[논문]Affinity Chromatography를 이용한 재조합 Helicobacter pylori urease의 분리 정제

이주연; 이만형

doi:10.5352/jls.2003.13.1.067

Affinity Chromatography를 이용한 재조합 Helicobacter pylori urease의 분리 정제
Purification of the Recombinant Helicobacter pyrori Urease by Affinity Chromatography 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.13 no.1 = no.56, 2003년, pp.67 - 72

이주연 (대구가톨릭대학교 약학대학) , 이만형 (대구가톨릭대학교 약학대학)

초록
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위염, 위궤양 및 위암의 원인 균인 Helicobacter pylori 가균체 표면에 다량 함유하며 주된 생존 인자이며 병원성 인자인 urease를 대장균에서 발현시키고 이 효소에 대한 항체 또는 기질과의 특이 상호 작용을 이용하여 두 단계의 간편한 방법에 의하여 정제하였다. 우선 anti-H. pylori Urease IgG-Sepharose column과 urea-Sepharose column을 각각 제조하고 DEAE-Sepharose 음이온 교환수지를 통하여 1차 정제한 시료를 각각 적용하고 제반 조건에서 용출시켰다. Anti-H. pylori urease IgG-Sepharose column의 경우에는 urease 시료가 너무 강력하게 결합함으로써 극단적인 pH조건에서만 용출이 가능함이 관찰되었으므로, 100 mM 탄산 완충액(pH 10.5)으로 최종 용출하였을 때 비교적 순수한 효소를 얻었으나, 비활성이 다소 감소된 것으로 나타났다. 한편, urea-Sepharose에 적용시킨 시료는 100 mM urea-HEB 완충액(pH 7.5)으로 비교적 용이하게 용출되어 비교적 높은 순도와 비활성의 urease 효소를 얻을 수 있었으나 이 경우에는 urease의 smaller subunit인 UreA peptide band의 강도가 다소 감소한 것이 관찰되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Helicobacter pylori is the etiologic agent of human gastritis and peptic ulceration and produces urease as the major protein component on its surface. H. pylori urease is known to serve as a major virulence factor and a potent immunogen. Recombinant H. pylori urease expressed in E. coli was purified by simple purification procedures utilizing (CNBr-activated Sepharose-anti-urease IgG immunoaffinity chromatography or epoxy- activated Sepharose-urea affinity chromatography. Urease was apparently bound so tightly to the anti-urease IgG resin that it could not be eluted at various elution conditions except at certain extreme pH 1, including 100 mM carbonate (pH 10.5) buffer solution, which was shown to elute slightly inactivated but relatively pure enzyme. Urease eluted from the epoxy-activated Sepharose-urea affinity column showed higher activity, but the smaller UreA subunit of the enzyme appeared as a Fainter band of diminished intensity when subjected to SDS-polyamide gel electrophoresis.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

pylori세균은 그 배양조건이 까다로운 관계로 urease 관련 유전자군을 대장균에 도입한 재조합 균주를 이용하여 활성 효소를 다량 발현하여 연구 재료로서 이용하여 왔다[8,12]. H. pylori urease는 이온 교환, gelfiltration 및 hydrophobic interaction 등의 성질을 이용한 3~4 단계의 크로마토그라피를 거쳐 정제하여 왔는데 [2,7,8,12], 본 연구에서는 재조합 대장균에서 대량 발현하여 정제한 H. pylori urease를 이용하여 토끼에 투여하여 제조한 항체 또는 기질인 urea를 coupling 시켜서 제조한 affinity column을 이용하여 최소 한도의 크로마토그라피 과정을 통하여 효소를 고도 정제하는 방법을 모색하고자 하였다.
pylori urease가 용출되어 나옴을 분획의 SDS-polyacrylamide 전기 영동 분석으로 확인할 수 있었다. 따라서 용출 용매의 pH 변화에 의거하여 항체 affinity chromatography column에 흡착된 urease를 분리할 수 있는 가능성을 확인하였다. PED (pH 7.
있다[12]. 본 연구에서는 최소한의 크로마토그라피 과정을 통하여 효소를 고도 정제하기 위하여 항원-항체 간의 상호 작용 또는 기질-효소 간의 결합 친화력를 바탕으로 한 affinity column을 이용한 간편한 정제 방법의 개발을 모색하고자 하였다.

제안 방법

여기에 144 mg의 urea가 녹아 있는 15 mL coupling 완충액을 가하고 실온에서 16시간 서서히 교반 하여 coupling 시켰다. Coupling 되지 않은 과잉의 urea를 제거하기 위하여 gel 부피의 5배량 (35 mL)의 coupling 완충액으로 세척하고, 1 M ethanolamine (pH 8.0) 용액을 가하여 40℃ 에서 6 시간 방치 함으로써 치환되지 않은 epoxy-activated Sepharose 수지의 잔여 활성 부위를 차단하였다. 이를 0.
pylori urease IgG를 함유한 10 mL coupling 완중액을 가하고 4℃에서 16시간 서서히 교반 하였다. Coupling 되지 않은 과잉의 항체를 제거하기 위하여 g이 부피의 5배량 (35 mL)의 coupling 완충액으로 세척하고, 0.1 M Tris-HCl(pH 8.0) 용액을 가하여 실온에서 2시간 방치함으로써 치환되지 않은 CNBr-activated Sepharose 수지의 잔여 활성 부위를 차단하였다. 이를 0.
Helicobacter pylori urease gene cluster 전체를 포함하는 재조합 플라스미드인 pHU1013[12]를 E. coli BL21(DE3) 균주에 transform 시켜서 얻은 E. coll BL21 (pHU1013) 또는 double transformant인 E. coli SE5000 (pHP808/pHP902)[7]을 각각 재조합 Helicobacter pylori urease의 발현에 사용하였다. E.
이를 4℃, 100,000xg에서 90 분간 원심 분리하고 그 상등액을 취하여 조 추출물로 하였다. PEB (pH 72)완충액으로 미리 평형화 시킨 DEAE-Sepahrose CL-6B (Pharmacia, Sweden) column (2.5 x 16 cm)에 조 추출물을 적용하고 50 mL PEB로 세척한 후, KCl 농도를 0에서 1 M 까지 직선적으로 증가시켜서 흡착된 단백질들을 용출 시켰다. 각 분획에 대하여 indophenol 법[15]에 준하여 urease 효소 활성 측정을 행하였으며 이 중 활성 분획 만을 모아서 50 mL-stirred ultrafiltration cell (Amicon, USA) 에서 농축과 동시에 용매 교환을 시행하였다.
Urease 활성은 urea로부터 ammonia가 방출되는 양을 측정 함으로써 결정하였다. 즉, ammonia 가 phenolhypochloride와 반응하여 생성된 indophenol을 625 nm에서 흡광도를 측정하는 fixed-time point assay를 시행하였다[12].
8)에 가하여 100℃에서 5분간 denature시킨 후 사용하였다. 이 시료를 두께 1.5 mm의 4.5% stacking gel과 12% polyacrylamide resolving gel에 적용하여 39 mA로 4 시간 동안 전기영동한 다음 0.1% Coomassie brilliant blueR-250으로 염색한 후 탈색하였다. 시료 중 단백질의 농도는 bovine serum albumin을 표준품으로 하여 Lowry법[13] 또는 MicroBCA Protein Assay Kit (Pierce, USA)를 이용하여 측정하였다.
0) 용액을 가하여 40℃ 에서 6 시간 방치 함으로써 치환되지 않은 epoxy-activated Sepharose 수지의 잔여 활성 부위를 차단하였다. 이를 0.5 M NaCl을 함유하는 0.1 M acetate 완충액 (pH 4.0) 및 0.5 M NaCl을 함유하는 0.1 M Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 각 50 mL로 교대로 세척한 다음 Pharmacia XK16/20 column에 충진하고 5배 column부피의 20 mM N-(2-hydroxyethyl) piperazine)-N'-(2-ethanesulfonic acid) (HEPES), 1 mM EDTA, 0.5 mM 2-mercaptoethanol (HEB, pH 7.5)완충액으로 평형화시켰다.
0) 용액을 가하여 실온에서 2시간 방치함으로써 치환되지 않은 CNBr-activated Sepharose 수지의 잔여 활성 부위를 차단하였다. 이를 0.5 M NaCl을 함유하는 0.1 M acetate 완충액 (pH 4.0) 및 0.5 M NaCl을 함유하는 0.1 M Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 각 50 mL로 교대로 세척한 다음 Pharmacia XK16/20 column에 충진하고 5배 column 부피의 20 mM KH₂PO₄, 1 mM ethylenediaminetetraacetate (EDTA), 1 mM dithiothreitol (PED, pH 7.2) 완충액으로 평형화시켰다.
각 분획에 대하여 indophenol 법[15]에 준하여 urease 효소 활성 측정을 행하였으며 이 중 활성 분획 만을 모아서 50 mL-stirred ultrafiltration cell (Amicon, USA) 에서 농축과 동시에 용매 교환을 시행하였다. 이를 전 항에서 제조하여 pH 7.2 PED 완충액으로 미리 평형화시킨 CNBr-anti H. pylori urease IgG column (1 x 6.4 cm)에 배적용하여, 4 배 column 부피의 PED 완충액으로 세척한 다음, 1 M KCl, 20% dimethylsulfoxide(DMSO)를 각각 함유하는 PED(pH 72) 완충액, 냉 초순수 (Milipore 급), 1 N NaOH 용액, 100 mM glycine HCl (pH 3.2) 완충액 및 100 mM 탄산(pH 10.5) 완충액 등으로 각각 용출을 시도하였다.
[10,14,20]. 한편 DEAE-Sepharose column으로 1차 정제한 시료를 urease 효소의 기질인 urea를 epoxy- activated Sepharose 6B에 coupling시킨 epoxy-urea affinity column에 적용하여 기질-효소 간의 친화력을 이용하여 효소를 정제하고자 하였다.Epoxy-activated Sepharose 6B는 Sepharose 6B resin에 1,4 bis-(2,3-epoxypropxy-) butane과 같은 비교적 긴 친수성 spacerarm을 함유하고 있으며, -OH, -SH 혹은 -NH₂기를 함유한 저 분자량의 리간드를 coupling할 수 있는 특성을 가지고 있다.

대상 데이터

각각의 시료는 3% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol을 함유하는 0.0625 M Tris buffer (pH 6.8)에 가하여 100℃에서 5분간 denature시킨 후 사용하였다. 이 시료를 두께 1.

데이터처리

즉, ammonia 가 phenolhypochloride와 반응하여 생성된 indophenol을 625 nm에서 흡광도를 측정하는 fixed-time point assay를 시행하였다[12]. Assay buffer (50 mM urea, 25 mM HEPES, 0.5 mM EDTA (pH 7.75)에 37℃에서 효소를 첨가함으로써 반응을 시작하였으며/ 방출되는 ammonia 농도는 Microsoft Excel 2000 프로그램 상에서 직선형 상관 회귀 분석에 의해 결정되었다. Urease 활성의 1 unit는 urea를 기질로 하여 37℃ 표준 assay buffer에서 매 분당 1 μmol의 urea를 가수 분해하는데 필요한 효소의 양으로서 정의하였다.

이론/모형

5 x 16 cm)에 조 추출물을 적용하고 50 mL PEB로 세척한 후, KCl 농도를 0에서 1 M 까지 직선적으로 증가시켜서 흡착된 단백질들을 용출 시켰다. 각 분획에 대하여 indophenol 법[15]에 준하여 urease 효소 활성 측정을 행하였으며 이 중 활성 분획 만을 모아서 50 mL-stirred ultrafiltration cell (Amicon, USA) 에서 농축과 동시에 용매 교환을 시행하였다. 이를 전 항에서 제조하여 pH 7.
각 정제단계에서의 단백질 순도는 Laemmli 법[11]에 의한 SDS-polyacrylamide gel 전기영동을 시행하여 확인하였다. 각각의 시료는 3% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol을 함유하는 0.
1% Coomassie brilliant blueR-250으로 염색한 후 탈색하였다. 시료 중 단백질의 농도는 bovine serum albumin을 표준품으로 하여 Lowry법[13] 또는 MicroBCA Protein Assay Kit (Pierce, USA)를 이용하여 측정하였다.
함으로써 결정하였다. 즉, ammonia 가 phenolhypochloride와 반응하여 생성된 indophenol을 625 nm에서 흡광도를 측정하는 fixed-time point assay를 시행하였다[12]. Assay buffer (50 mM urea, 25 mM HEPES, 0.

성능/효과

2) 완충액, 냉 초순수 (Milipore 급) 등으로 각각 용출시켜 보았으나 urease활성이나 단백질은 검출되지 않았다. 1 N NaOH 용액을 가하였을 때에야 높은 pH에 의해 활성이 소실된 H. pylori urease가 용출되어 나옴을 분획의 SDS-polyacrylamide 전기 영동 분석으로 확인할 수 있었다. 따라서 용출 용매의 pH 변화에 의거하여 항체 affinity chromatography column에 흡착된 urease를 분리할 수 있는 가능성을 확인하였다.
따라서 용출 용매의 pH 변화에 의거하여 항체 affinity chromatography column에 흡착된 urease를 분리할 수 있는 가능성을 확인하였다. PED (pH 7.2) 완충액으로 시료를 다시 적용한 후 100 mM glycine HCl (pH 3.2) 및 100 mM 탄산 (NaHCO₃-Na2CO, pH 10.5) 완충액으로 각각 용출한 결과 100 mM 탄산 완충액에서 Fig. 1의 12% SDS- polyacrylamide 전기 영동의 결과에 제시된 바와 같이 비교적 순수한 urease효소가 분리됨을 확인 하였다(lane 4). 그러나 정제된 효소는 column에서 분리된 직후, 다량의 중성 인산 완충액으로 즉시 투석하였음에도 불구하고 그 비활성 (specific activity)이 35.
먼저, 정제한 rabbit anti-H. pylori urease IgG를 CNBr-activated Sepharose 수지에 coupling시켜서 제조한 column에 핵산성분 등 기타 세포 내 고분자를 제거하기 위해 DEAE-Sepharose column으로 1차 정제한 재조합 H. pylori urease 함유 시료를 적용시켜 보았을 때, 항원-항체반응이 매우 강력하게 일어났음을 알 수 있었다. 즉, column을 초기 적용 완충액인 PED (pH7.
pylori urease 함유 시료를 적용시켜 보았을 때, 항원-항체반응이 매우 강력하게 일어났음을 알 수 있었다. 즉, column을 초기 적용 완충액인 PED (pH7.2)로 충분히(4배 column 부피) 세척한 후에 1 M KCl, 20% DMSO를 각각 함유하는 PED(pH 7.2) 완충액, 냉 초순수 (Milipore 급) 등으로 각각 용출시켜 보았으나 urease활성이나 단백질은 검출되지 않았다. 1 N NaOH 용액을 가하였을 때에야 높은 pH에 의해 활성이 소실된 H.

후속연구

2, lane 4). 결론적으로, 본 연구에서는 특이 항체 및 기질을 이용한 affinity column chromatography를 이용하여 의약학적으로 중요한 H. pylori urease를 간단한 방법으로 정제하는 방법을 모색하였는데 항체 affinity chromatography의 경우 효소의 천연 활성이 유지될 수 있도록 좀더 온화한 용출 방법의 모색이 필요한 것으로 나타났다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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