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문제 정의
- 또한 가수분해 시 부수적으로 발생하여 발효에 좋지 않은 영향을 미치는 acetic acid, furfural을 제거하는 과정을 거친다 [11, 16]. 따라서 이러한 고온, 무기산 스트레스환경에 대해서 우리의 발효효모균주의 적용 가능성을 알아보기 위해서 30℃ 정상적인 발효 조건과 40℃ 고온 발효 시, 황산의 알코올 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 정상조건에서는 두 균주 모두 발효 시작 후 3일까지 알코올 생산량이 꾸준히 증가하는 양상을 보였고, 황산 0.
- 이 연구에서는 바이오매스의 산 가수분해로 발생하는 낮아진 환경 pH에 대하여 이 균주 Saccharomyces cerevisiae KNU5377의 스트레스반응 을 알아보기 위하여 여러가지 무기산에 대한 내성도 측정 및 무기산 첨가 후 중화하지 않은 상태에서 발효하여 생산되는 알코올 생산량을 조사하였다. 또한 스트레스에 대한 세포방어에 관여하는 trehalose의 세포 내 축적량을 조사함으로써 무기산에 대한 세포반응 및 세포형태 변화에 미치는 영향 등도 함께 조사하여 보고한다.
- 무기산 스트레스에 대한 비 단백질성 보호제인 trehalose의 관련 여부를 확인하기 위해 trehalose의 세포 내 축적정도를 조사하였다. 생육 및 생존에 거의 영향을 주지 않는 농도 0.
- 또한 35 mM 과산화수소(H2O2)에 대해서는 2시간 동안 처리하거나 유기용매 benzonitrile의 10%에 30분간 처리했을 때는 생존하는 것을 확인하였다. 이 연구에서는 바이오매스의 산 가수분해로 발생하는 낮아진 환경 pH에 대하여 이 균주 Saccharomyces cerevisiae KNU5377의 스트레스반응 을 알아보기 위하여 여러가지 무기산에 대한 내성도 측정 및 무기산 첨가 후 중화하지 않은 상태에서 발효하여 생산되는 알코올 생산량을 조사하였다. 또한 스트레스에 대한 세포방어에 관여하는 trehalose의 세포 내 축적량을 조사함으로써 무기산에 대한 세포반응 및 세포형태 변화에 미치는 영향 등도 함께 조사하여 보고한다.
제안 방법
- Durham tube-f- 넣고 멸균한 YEPD 액체 배지에 황산, 질산, 염산을 0에서 0.5% (v/v)까지 첨가한 뒤 pH를 측정 하고 pH가 낮게 조절된 배양 배지에서 중간 대수 증식기 까지 배양한 다음, 두 균주를 1% 접종하여 30℃ 에서 배양 하면서 Durham tube에 모이는 가스 및 탁도를 관찰하여 각각의 무기산 농도에서 생육 가능성을 조사하였다. 또한 정상적인 생육 조건에서 배양한 균을 최종 흡광도를 OD600=3 되도록 조절한 뒤, 생육이 불가능한 다소 높은 농도에 단시간 노출시키고 그 반응액 5 μ1를 YEPD 고체배 지에 떨어뜨린 뒤, 30℃에서 이틀동안 배양하면서 생성되는 colony를 관찰하였다.
- 대수 증식기까지 배양한 KNU5377을 OD6oo=3.0 되도록 세포 수를 조절한 뒤, 30 mM 황산에 노출시켜 시간별로 세포를 회수하여 살균한 생리식염수로 3회 세척하였다. 이를 10배 희석하여 OD6oo=0.
- 대수 증식기까지 배양한 두 균주의 흡광도를 통하여 세 포 수를 동일하게 한 뒤, 황산 1%가 첨가된 YEPD배지에 한시간 동안 노출시킨 다음, 세포를 고정하여 transmission electron microscope(TEM)로 관찰하였다. 대수 증식기의 세포에서는 핵과 마이토콘드리아를 비롯한 세포 내 소기관의 배열에 변화가 보이지 않은(Fig.
- 생육에 사용된 배지로는 전형적인 Saccharomyces 영양배지인 YEPD media (Yeast extract 1%, Peptone 2% and Dextrose 2%)를 사용하였고, 필요에 따라 적정 농도의 무기산(황산, 질산, 염산)을 % 농도(v/v)로 멸균한 배양 배지에 첨가하였다. 또한 알코올 발효 시에는 YEPD와 동일 조성에 dextrose를 20% 첨가한 것을 사용하였다.
- 5% (v/v)까지 첨가한 뒤 pH를 측정 하고 pH가 낮게 조절된 배양 배지에서 중간 대수 증식기 까지 배양한 다음, 두 균주를 1% 접종하여 30℃ 에서 배양 하면서 Durham tube에 모이는 가스 및 탁도를 관찰하여 각각의 무기산 농도에서 생육 가능성을 조사하였다. 또한 정상적인 생육 조건에서 배양한 균을 최종 흡광도를 OD600=3 되도록 조절한 뒤, 생육이 불가능한 다소 높은 농도에 단시간 노출시키고 그 반응액 5 μ1를 YEPD 고체배 지에 떨어뜨린 뒤, 30℃에서 이틀동안 배양하면서 생성되는 colony를 관찰하였다.
- 무기산 스트레스에 대한 비 단백질성 보호제인 trehalose의 관련 여부를 확인하기 위해 trehalose의 세포 내 축적정도를 조사하였다. 생육 및 생존에 거의 영향을 주지 않는 농도 0.2%가 되도록 세 가지 무기산을 첨가하여 30분, 60분 동안 처리한 뒤, 세포 내에 축적된 량을 정량 하였다. 무기산이 첨가되지 않은 YEPD 배지에서 처리한 경우에는 두드러진 증감 없이 그 농도가 거의 일정하였다.
- 858) 균주를 대조 균주로 하였다. 생육에 사용된 배지로는 전형적인 Saccharomyces 영양배지인 YEPD media (Yeast extract 1%, Peptone 2% and Dextrose 2%)를 사용하였고, 필요에 따라 적정 농도의 무기산(황산, 질산, 염산)을 % 농도(v/v)로 멸균한 배양 배지에 첨가하였다. 또한 알코올 발효 시에는 YEPD와 동일 조성에 dextrose를 20% 첨가한 것을 사용하였다.
- 7) 와 3 μ1의 trehalase (Sigma, T8778)를 첨가하여 37℃ 에서 12시간 반응시킨 뒤, Somogi-Nelson법을 이용한 환원당 정량을 실시하였다. 이 결과로부터 산출된 환원당량을 바탕으로 trehalose농도를 산출하였다.
- 이 연구에 사용한 세 가지 무기산에 대한 KNU5377의 발효가능 농도 및 생산되는 알코올농도를 조사하였다. 황산은 0.
- 0 되도록 세포 수를 조절한 뒤, 30 mM 황산에 노출시켜 시간별로 세포를 회수하여 살균한 생리식염수로 3회 세척하였다. 이를 10배 희석하여 OD6oo=0.3 되도록 조절한 다음 희석하기 전, 후의 세포액을 YEPD 고체 배지에 5 떨어뜨리고 30 ℃에서 이틀간 배양하면서 생기는 colony를 관찰하였다.
- 5% Glutaraldehyde, 3% KMnQ 용액으로 고정 후, 2% Agar로 embedding 하고 lxl mm 크기로 절단한다. 절단한 조각을 1—2% Uranyl acetate로 염색한 뒤 농도를 점차 증가시킨 Acetone으로 dehydration하고, Quetol로 infiltration한 것을 sectioning, carbon coating하여 전자현미경(Hitachi H-7000, 75 kV) 하에서 관찰하였다.
- 황산, 질산, 염산이 0.2% 첨가된 YPD배지에서 30분, 60 분 동안 스트레스 반응시킨 각 효모균주의 배양액 1 ml을 원심 분리하여 0.86% 식염수로 3회 세척한 뒤 멸균한 증류 수 1 ml을 첨가하여 10(TC에서 한시간 동안 가열하여 세포를 파쇄하였다. 이를 원심분리하여 상등액 500 μ1를 멸균 eppendrof tube에 옮기고 400 μ1의 phosphate buffer (50 mM, pH 5.
- 이 연구에 사용한 세 가지 무기산에 대한 KNU5377의 발효가능 농도 및 생산되는 알코올농도를 조사하였다. 황산은 0.2, 0.3, 0.4, 0.5%까지, 질산은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4%까지, 염산은 0.1, 0.2, 0.3%를 각각 발효 배지에 첨가하여 이틀동안 생산되는 알코올 농도를 측정하였다. 황산 0.
대상 데이터
- 이 연구에 사용한 효모 균주는 대구지역의 고온 폐수로 부터 분리한 전형적인 효모 균주로서 고온에서 내성 및 알코올 발효능도 높다고 알려진 Saccharomyces cerevisiae KNU5377 (이하 KNU5377) 균주를 사용하였고[6, 7], 알코올에 대하여 비교적 높은 내성을 가지고 있는 Saccharomyces cerevisiae ATCC24858 (이하 ATCC24858) 균주를 대조 균주로 하였다. 생육에 사용된 배지로는 전형적인 Saccharomyces 영양배지인 YEPD media (Yeast extract 1%, Peptone 2% and Dextrose 2%)를 사용하였고, 필요에 따라 적정 농도의 무기산(황산, 질산, 염산)을 % 농도(v/v)로 멸균한 배양 배지에 첨가하였다.
이론/모형
- 세포 내 소기관의 관찰은 Kamasawa 등의 방법[5]을 기초로 transmission electron microscope (TEM)를 이용하였다. 간단히 요약하면 스트레스 처리한 세포를 차가운 증류수로 수세한 뒤 2.
- 86% 식염수로 3회 세척한 뒤 멸균한 증류 수 1 ml을 첨가하여 10(TC에서 한시간 동안 가열하여 세포를 파쇄하였다. 이를 원심분리하여 상등액 500 μ1를 멸균 eppendrof tube에 옮기고 400 μ1의 phosphate buffer (50 mM, pH 5.7) 와 3 μ1의 trehalase (Sigma, T8778)를 첨가하여 37℃ 에서 12시간 반응시킨 뒤, Somogi-Nelson법을 이용한 환원당 정량을 실시하였다. 이 결과로부터 산출된 환원당량을 바탕으로 trehalose농도를 산출하였다.
성능/효과
- 3%에서는 생산량이 적으나마 꾸준히 증가하는 양상을 보였다. 0.1% 의 질산농도에서는 산이 첨가되지 않았을 때의 90% 이상의 알코올 생산량을 보이므로써 발효에 거의 영향을 미치지 않음을 알게 되었고, 0.3% 이상의 농도에서는 알코올 생산량이 1%를 조금 넘었다. 또한 염산 첨가 시에도 0.
- 1). 따라서 KNU5377O] 대조균주보다 전반적으로 무기산에 대한 내성이 높게 나타났으며 염산에 대해서는 생육가능농도가 비슷하였으나 높은 농도에서 스트레스 처리 시 좀 더 강한 내성을 가지는 것을 확인하였다.
- 본 연구에 사용된 KNU5377은 4(FC라는 고온에서도 높은 발효율[6, 기을 나타내는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 본 연구에서와 같이 대조균주에 비해서 황산, 질산에 대한 내성이 높은 것을 확인하였다. 따라서 본 연구에 사용된 KNU5377 균주는 스트레스로 작용하는 여러가지 전처리 조건을 거친 기질을 이용한 알코올 생산에 유리할 것으로 생각된다.
- 우리 연구팀은 고온에서 알코올 발효가 가능한 균주를 대구, 경북 지역의 고온 폐수로부터 검색하던 중, 40℃의 고온 발효조건에서도 정상적인 발효를 할 수 있으며 발효 산물인 알코올을 75% 이상 생산하는 것을 확인하였다[6]. 또한 35 mM 과산화수소(H2O2)에 대해서는 2시간 동안 처리하거나 유기용매 benzonitrile의 10%에 30분간 처리했을 때는 생존하는 것을 확인하였다. 이 연구에서는 바이오매스의 산 가수분해로 발생하는 낮아진 환경 pH에 대하여 이 균주 Saccharomyces cerevisiae KNU5377의 스트레스반응 을 알아보기 위하여 여러가지 무기산에 대한 내성도 측정 및 무기산 첨가 후 중화하지 않은 상태에서 발효하여 생산되는 알코올 생산량을 조사하였다.
- 3% 이상의 농도에서는 알코올 생산량이 1%를 조금 넘었다. 또한 염산 첨가 시에도 0.2% 가 발효 가능한 한계농도였으나 무기산을 첨가하지 않은 조건에서의 알코올 발효량의 약 80%를 유지하는 높은 발효율을 나타내었다(Fig. 2). 최근 NREL (National Renewable Energy Laboratory)에서는 값싼 lignocellulosic biomass를발효 기질로 사용하기 위한 전처리 과정을 플랜트로 디자인하였다[16].
- 물에서 거의 해리 되는 무기 강산의 특징에 따라 효모 배양배지에 첨가했을 때 역시 주변의 산도를 상당히 떨어뜨리는 것을 확인하였다. 황산, 질산, 염산을 0% (v/v)에서 0.
- 3%까지 생육이 가능하고 질산에 대해서 좀 더 나은 양상을 보였다. 반면에 KNU5377은 염산에서는 대조 균주와 비슷한 양상을 보였으나 질산 0.4%에서 생육을 보일 뿐만 아니라 0.5% 황산농도에서도 생육이 가능한 것을 관찰하였다(Table 2). 생육에 저해를 받는 최고 농도(황산의 경우 0.
- 무기산이 첨가되지 않은 YEPD 배지에서 처리한 경우에는 두드러진 증감 없이 그 농도가 거의 일정하였다. 반면에 무기산 처리 30분 경과 후 두 균주 모두에서 축적 량이 증가하는데, 대조 균주에서는 처음 30분 경과 후 증가폭과 그 다음 30분 처리 시 증가폭이 큰 차이 없이 지속적으로 증가하는 반면, KNU5377에서는 30분 동안 유도 축적된 농도가 60분까지 이어지는 것이 관찰되었다(Fig. 4). 따라서 KNU5377은 외부 환경변화에 대하여 신속하게 반응하여 안정화하는 반면 대조 균주는 안정하게 되기까지 좀더 시간이 걸리고 이러한 특성은 세포의 무기산 스트레스에 대한 내성으로 이어지는 것으로 생각된다.
- 그러나 환경에 적응하면서 자연스럽게 환경 스트레스에 대한 내성을 획득하고 이러한 획득 내성(acquired tolerance)이 오랜 시간 동안 지속되면서 안정화된 자연상태의 균주를 분리하여 이용한다면 즉, 구성적인 내성 (intrinsic tolerance)을 가진 균주를 전처리한 기질에 이용한다면 중화 및 냉각 과정에 드는 비용을 줄이면서 효과적으로 알코올 생산이 가능할 것이다. 본 연구에 사용된 KNU5377은 4(FC라는 고온에서도 높은 발효율[6, 기을 나타내는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 본 연구에서와 같이 대조균주에 비해서 황산, 질산에 대한 내성이 높은 것을 확인하였다. 따라서 본 연구에 사용된 KNU5377 균주는 스트레스로 작용하는 여러가지 전처리 조건을 거친 기질을 이용한 알코올 생산에 유리할 것으로 생각된다.
- 5% 황산농도에서도 생육이 가능한 것을 관찰하였다(Table 2). 생육에 저해를 받는 최고 농도(황산의 경우 0.6%, 질산의 경우 0.45%, 염산의 경우 0.35%)에서 10분 간격으로 처리 후 생존하는 정도를 관찰하여 두 균주 간의 내성도를 조사한 결과, 질산에 대해서는 두 균주 모두 생존하지 못하였고 KNU5377은 염산 처리 시 90분까지 생존 가능하였으며 ATCC24858은 50분 이후 완전히 사멸하였다(Fig. 1). 따라서 KNU5377O] 대조균주보다 전반적으로 무기산에 대한 내성이 높게 나타났으며 염산에 대해서는 생육가능농도가 비슷하였으나 높은 농도에서 스트레스 처리 시 좀 더 강한 내성을 가지는 것을 확인하였다.
- 한편 40℃의 고온에서 발효를 할 경우, 김 등[6]의 보고에서와 같이 KNU5377 은 높은 발효율을 보였고 대조균주보다 약 3배 더 높았다. 이 균주는 무기산 첨가 후 고온에서 발효할 경우에도 대조균주보다 두 배정도 높은 4.5%의 알코올 생산을 보였다 (Fig. 3). 따라서 정상적인 발효 온도인 3(TC에서 발효 시, 두 균주 모두 황산에 대한 영향을 받았으며, 고온에서는 KNU5377 균주가 고온내성을 가지므로[7] 교차내성시스템에 의하여 황산에 대한 영향을 대조균주보다 덜 받는 것으로 생각된다.
- 5%까지 첨가하여 그 배지의 pH를 측정한 결과, 첨가한 무기산 농도에 비례하여 pH가 떨어졌고 동일 농도에서는 염산에 대한 산도가 더 낮게 나타났다(Table 1). 이와 같이 무기산의 첨가 및 pH가 낮게 조절된 배양 배지에서 두 균주의 생육을 관찰하기 위하여 Durham tube가 들어있는 시험관에 균주를 접종한 뒤 배양하면서 Durham tube에 생성되는 가스 및 흡광도를 측정한 결과, ATCC24858의 경우 세 가지 무기산에 대하여 0.3%까지 생육이 가능하고 질산에 대해서 좀 더 나은 양상을 보였다. 반면에 KNU5377은 염산에서는 대조 균주와 비슷한 양상을 보였으나 질산 0.
- 이와 같이 무기산의 첨가후 어떠한 중화과정을 거치지 않은 스트레스상태에서 KNU5377 균주는 높은 알코올 발효율을 보였을 뿐만 아니라, 고온 스트레스를 동시에 처리 했을 경우에도 4.5% 이상의 알코올 생산이 가능하였다. 따라서 목질계 기질의 증기 폭쇄 및 산 가수분해 시 발생하는 고온, 낮은 산도 등의 불리한 환경에서 이 연구에 사용된 균주를 적용할 경우 높은 기대 효과가 예상된다.
- 따라서 이러한 고온, 무기산 스트레스환경에 대해서 우리의 발효효모균주의 적용 가능성을 알아보기 위해서 30℃ 정상적인 발효 조건과 40℃ 고온 발효 시, 황산의 알코올 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 정상조건에서는 두 균주 모두 발효 시작 후 3일까지 알코올 생산량이 꾸준히 증가하는 양상을 보였고, 황산 0.2%를 첨가하였을 때 첫째 날에는 대조균주에서 다소 높았으나 2, 3일째 접어들면서 KNU5377이 높은 생산량을 보였다. 한편 40℃의 고온에서 발효를 할 경우, 김 등[6]의 보고에서와 같이 KNU5377 은 높은 발효율을 보였고 대조균주보다 약 3배 더 높았다.
- 3%를 각각 발효 배지에 첨가하여 이틀동안 생산되는 알코올 농도를 측정하였다. 황산 0.4% 이상의 농도에서는 하루동안 생산된 1.2% 정도의 알코올이 최대량이었고, 이틀째에는 오히려 감소하는 것으로 보아 더 이상의 발효는 진행되지 않는다고 판단하였다. 0.
- 물에서 거의 해리 되는 무기 강산의 특징에 따라 효모 배양배지에 첨가했을 때 역시 주변의 산도를 상당히 떨어뜨리는 것을 확인하였다. 황산, 질산, 염산을 0% (v/v)에서 0.5%까지 첨가하여 그 배지의 pH를 측정한 결과, 첨가한 무기산 농도에 비례하여 pH가 떨어졌고 동일 농도에서는 염산에 대한 산도가 더 낮게 나타났다(Table 1). 이와 같이 무기산의 첨가 및 pH가 낮게 조절된 배양 배지에서 두 균주의 생육을 관찰하기 위하여 Durham tube가 들어있는 시험관에 균주를 접종한 뒤 배양하면서 Durham tube에 생성되는 가스 및 흡광도를 측정한 결과, ATCC24858의 경우 세 가지 무기산에 대하여 0.
후속연구
- 무기산에 대한 효모의 스트레스 반응에 대한 연구는 아직 잘 알려져 있지 않으나 무기 강산 및 고온에서 전처리 한 목질계 바이오매스를 발효기질로 하여 알코올을 효과적으로 생산하는 균주의 탐색 및 유전자조작을 통한 무기산에 대한 내성을 가진 균주의 개발이 진행되고 있다[14]. 그러나 환경에 적응하면서 자연스럽게 환경 스트레스에 대한 내성을 획득하고 이러한 획득 내성(acquired tolerance)이 오랜 시간 동안 지속되면서 안정화된 자연상태의 균주를 분리하여 이용한다면 즉, 구성적인 내성 (intrinsic tolerance)을 가진 균주를 전처리한 기질에 이용한다면 중화 및 냉각 과정에 드는 비용을 줄이면서 효과적으로 알코올 생산이 가능할 것이다. 본 연구에 사용된 KNU5377은 4(FC라는 고온에서도 높은 발효율[6, 기을 나타내는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 본 연구에서와 같이 대조균주에 비해서 황산, 질산에 대한 내성이 높은 것을 확인하였다.
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