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문제 정의
- 미 한다. 따라서 본 실험 에서 는 각종 암세 포에 대한 세 포 독성을 규명하기 위해 암세포로 A549, HepG2, MCF-7, AGS와대조로서 정상세포 293을 이용하여 홍경천 에탄올 추출물과 분획물에 대하여 SRB assay를 행하였다.
- 또한 홍경천은 건강식품 혹은 의약품소재로서의 가치가 인정되고 있으며, 보다 구체적인 생리활성 효과에 대한 실험 결과가 필요한 시점이다. 본 연구에서는 중국에서 입수한 홍경 천의 항산화 활성, 항돌연변이능 및 세포독성 효과를 검토함으로서 새로운 기능성 소재로서의 기초자료를 얻고자 하였다.
가설 설정
- 1)Values are the mean ± SD (n = 3).
- 1)Values are the mean ± SD (n = 3).
제안 방법
- 용하여 건조시 켰다. 70% 에 탄올로 추출물을 용매의 극성 에 따라 분별분리를 행하여 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물층으로 극성의 차이 에 의 해 다섯가지 분획으로 조제하였다. 분리된 각각의 용매 분획물은 50°C에서 감압농축 후 동결건조하여 분획물을 얻었다.
- SRB(sulforhodamine B) assay는 세포 단백질 염 색을 이용하여 세포 증식이나 독성을 측정하는 방법(16)으로 10%의 fetal bovine serum과 각각의 세포들인 인간 폐 암세포(A549), 인간 간암세포(HepG2), 인간 유방암세포(MCF-7), 인간의 위암 세포(AGS), 인간의 정상세포(293)을 함유하는 RPMI 1640 배지를 5XIO, cell/mL 농도로 100 虬씩 각 well에 첨가하여 하루 동안 배 양(37°C, 5% CO2) 시킨 후 PBS에 녹인 추출물들을 각각 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mg/mL씩 첨가하여 다시 48시 간 배양시켰다. 그 후상등액을 aspirator 로 조심스럽게 제거하고 차가운 10% TCA(4°C) 용액을 50 此씩 첨가하여 세포들을 well 바닥에 고정 시 켰다.
- B(a)P 및 Trp-P-1 이다. 건열멸균시킨 glass cap tube에 시료의 추출물을 각각 50 UL씩 첨가하고 이어서 변이 원 물질을 각각 50 UL씩 첨가하였다. 간접 변이원인 경우 10% S-9 mix를 250 uL씩 첨가하였다.
- 건조된 홍경천 뿌리를 시료중량으로 10배의 70% 에탄올을 첨가하고 50°C에서 8시간씩 3회 추출하였으며, 감압 여과장치에서 뜨거운 상태로 여과하여 -4°C 냉장실에 24시간 방치 후 감압농축기를 사용하여 추출용매를 제거한 후 동결건조기를이 용하여 건조시 켰다. 70% 에 탄올로 추출물을 용매의 극성 에 따라 분별분리를 행하여 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물층으로 극성의 차이 에 의 해 다섯가지 분획으로 조제하였다.
- 홍경천 뿌리의 추출물과 변이원 물질의 .농도는 예비실험을 통하여 결정하였으며, 항돌연변이 활성 은 변이원물 질의 활성에 대한 시료의 억제율(inhibition, %)로 나타내었다. 그림에서 나타낸 억제율은 3회 반복실험을 실시하여 평균치를 나타낸 것이다.
- 0 mg/rr止에서 모두 38% 이하의 낮은 억제 효과를 나타내어 정상세포에 대해 비교적 낮은 독성효과를 나타내 었다. 또한 홍경천 뿌리 에 탄올 추출물의 활성성분의 특성을 검토하고자 극성이 다른 용매에 대한분획물을 이용하여 이들 암세포에 대한 성장 저해효과를 실험하였다. 인간 간암세포 HepG2에 대한 저 해효과는 0.
- 또한 홍경천 추출물의 성 분들의 특성 을 검 토하고자 에탄올 추출물을 핵산, 클로로포롬, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물층으로 분획한 후, MNNG, 4NQO, B(a)P 그리고 Trp-PT을사용하여 항돌연변이원성 실험을 수행한 결과를 Fig. 2〜5에 나타내었다. 각각의 변이원 물질에 대하여 각 분획물들은 돌연변이 억제효과를 나타내었다.
- 여러 농도의 시료를 4 m丄의 MeOH에 녹여, L5xi()T M 1, 1-di- phenyl-2-picrylhydrazyl solution (in methanol) 을 1 mL 를 첨가한 후, 30분간 암소에 방치한 후 517 nm에 서 흡광도를 측정하였다. 수소전자공여능은 각 실험을 3회 반복하였으며 RCso 은 시료가 대조구의 흡광도를 1/2로 감소시키는 농도로 표시되었으며, 검체의 농도에 따른 수소전자공여능 검정(standard curve)을 통해 결정하였다.
- 4)로 전체량이 700 UL가 되도록 하였다. 이것을 37°C에서 20분간 진탕배양한 다음 histidine/biotin이 첨가된 top agar(45°C)를 2 mL씩 가하여 잘 혼합한 후 미리 조제해놓은 minimal glucose agar plate상에 도말하고 평판고정 화 시켜 37°C에서 48시간 배양하여 생긴 복귀돌연변이(his* rever-tant colony)수를 측정하여 돌연변이원성의 유무를 판정하 였다.
- 2 M sodium phosphate buffer를 가하여 최종부피가 700 UL가 되도록 하였다. 이것을 37°C에서 20분간 진탕배양한 다음 상기의 돌연변이원성 실험과 같은 방법으로 실험하여 생성된 복귀돌연변이 수를 측정하여 항 돌연변이성 유무를 판정하였다. 홍경천 뿌리의 추출물과 변이원 물질의 .
- 한편, microsomal enzyme의 대사활성에 의해서만 돌연변이원성을 나타내는 간접변이원으로서 실제로 식품을 통해 흡수될 수 있는 polycyclic aromatic hydrocarbon인 B(a)P와 아미노산 가열분해물인 Tip-P-1 을 사용하여 실험을 수행하였다.
- 홍경천 에탄올 추출물과 분획물들의 돌연변이원성 억제작용을 검토하기 위하여 Ames test에서 양성반응을 나타내며, 물질 그 자체로서 돌연변이를 유발하는 직접 변이원물질로 MNNG와 4NQO 그리고 대사활성을 필요로 하는 간접 변이원물 질인 B(a)P와 Trp-P-1 을 사용하여 각각의 농도에 따른 돌연변이원성 억제효과를 검토하였다. 실험한 결과(Fig.
대상 데이터
- Ames test를 개량한 preincubation법 에 따라 항돌연변이 원성 실험을 실시하였고, 실험에 사용한 변이원물질은 4NQO, MNNG, B(a)P 및 Trp-P-1 이다. 건열멸균시킨 glass cap tube에 시료의 추출물을 각각 50 UL씩 첨가하고 이어서 변이 원 물질을 각각 50 UL씩 첨가하였다.
- 간접 돌연변이원(indirect mutagen)으로 benzo ( a )pyrene(B( a )P)과 3-aminoT, 4-dimethyl-5H-pyrido-(4, 3-b)indol(Trp-P-l) 그리 고 L-his-tidine은 일본 和光純藥 특급시약을 구입하였다. 세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640 과 Hepes buffer, fetal bovine serum(FBS), tripsin-EDTA는 Gibco사(USA)로부터 구입하였다.
- 본 실험 에 사용된 홍경천(Rhodiola sachalinensis A. Bor) 은 온도가 낮고 건조하며 산소가 결핍되고 강한 자외선이 비 치며 낮과 온도차이가 큰 해발 1, 700〜2, 300 m의 악조건에서 생존할 수 있는 특수한 적응성을 가지고 있다. 또한 인삼과 가시오갈피 이후에 발견된 보건약용식물의 일종으로서 원기를 회복시키고 병과 독을 극복하고 장수하게 할 수 있어 "고원인삼” 이라는 별칭을 가지고 있으며, 참돌꽃이라고도 불리는 홍경 천은 고산지대 에 서 자라는 초본식물로서 돌나물과 돌꽃속에 속하는 다년생 초본이다(1).
- 본 실험에 사용한 홍경천은 중국의 백두산에서 재배하는 홍경천 뿌리를 2001년에 중국 연변대학으로부터 입수하여 사용하였다.
- 세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640 과 Hepes buffer, fetal bovine serum(FBS), tripsin-EDTA는 Gibco사(USA)로부터 구입하였다. 본 실험에 이용된 인간 폐암 세포 A549(lung carcinoma, human), 인간 간암세포 HepG2 (hepatocellular carcinoma, human), 인간 위암세포 AGSCgas- tric carcinoma, human), 인간의 유방암세포 MCF-7(breast adeno carcinoma, human) 및 정상세포 293(ransformed pri mary human embryonal kidney)-c- Korea Cell Line Bank (KCLB)로부터 구입하여 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. 그외 추출 용매 인 에탄올, 핵 산, 클로로포름, 에 틸아세테이트, 부탄올 등은 특급시약을 사용하였다.
- 간접 돌연변이원(indirect mutagen)으로 benzo ( a )pyrene(B( a )P)과 3-aminoT, 4-dimethyl-5H-pyrido-(4, 3-b)indol(Trp-P-l) 그리 고 L-his-tidine은 일본 和光純藥 특급시약을 구입하였다. 세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640 과 Hepes buffer, fetal bovine serum(FBS), tripsin-EDTA는 Gibco사(USA)로부터 구입하였다. 본 실험에 이용된 인간 폐암 세포 A549(lung carcinoma, human), 인간 간암세포 HepG2 (hepatocellular carcinoma, human), 인간 위암세포 AGSCgas- tric carcinoma, human), 인간의 유방암세포 MCF-7(breast adeno carcinoma, human) 및 정상세포 293(ransformed pri mary human embryonal kidney)-c- Korea Cell Line Bank (KCLB)로부터 구입하여 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 직접 돌연변이원(direct mutagen)으로서 4~nitroquinoline- 1 -oxide(4NQO), TV-methyl-N'-nitroTV-nitrosoguanidine (MNNG), glucose-6-phosphate은 미국 Sigma 회사로부터구입하였다. 간접 돌연변이원(indirect mutagen)으로 benzo ( a )pyrene(B( a )P)과 3-aminoT, 4-dimethyl-5H-pyrido-(4, 3-b)indol(Trp-P-l) 그리 고 L-his-tidine은 일본 和光純藥 특급시약을 구입하였다.
이론/모형
- 70% 에 탄올 추출물과 각 분획물들은 Choi 등(14)의 방법 에의한 수소전자공여능에 의해 항산화 활성을 측정하였다. 여러 농도의 시료를 4 m丄의 MeOH에 녹여, L5xi()T M 1, 1-di- phenyl-2-picrylhydrazyl solution (in methanol) 을 1 mL 를 첨가한 후, 30분간 암소에 방치한 후 517 nm에 서 흡광도를 측정하였다.
- 홍경천 뿌리의 돌연변이원성 실험은 £. typhimurium의 변이 주인 TA98과 TA100을 이용하여 Ames test를 개량한 pre- incubation법(15)으로 실시하였다. 건열멸균시킨 glass cap tube에 각각의 시료를 50 Ug/plate씩 가하고 여기에 전 배양시킨 배양균액 100 UL를 가한 다음 0.
성능/효과
- 1 %의 억 제 효과를 나타내 었 다. 4NQO에 서 도 에틸아세테이트 분획물에서 S. typhimurium TA98 균주와 TA100 균주에 대해서 동일 시료농도에서 각각89.7%와91.5% 로 다른 분획물보다 높은 억제효과를 나타내었다. B(a)P에 대한 억제효과에서는 TA98, TA100 두 균주에 대하여 에틸아세테이 트 분획물에서 각각 94.
- B( a )P(101ig/plate)를 사용한 경 우(Fig. 4)에 서 는 S. typhi- murium TA98, TAI00 두 균주 모두에서 시료농도 증가에 따라 억 제효과 또한 증가하는 경 향을 보였으며 모든 분획 물에서 모두 80%이상의 높은 억제효과를 보였다. Fig.
- 5% 로 다른 분획물보다 높은 억제효과를 나타내었다. B(a)P에 대한 억제효과에서는 TA98, TA100 두 균주에 대하여 에틸아세테이 트 분획물에서 각각 94.2%와 95.7%로 다른 분획물보다 높은 억제활성을 나타내었으며, Trp*T에 대해서는 두 균주가 각각 92.3%와 93.8%로 다른 분획 물보다 높은 억제 효과를 나타내었다. 암세포 성장억 제 효과를 검토한 실험 에서는 에틸아세테이트 분획물이 가장 높은 억제활성을 나타내었으며, 시료농도의 증가와 함께 억 제 활성도 증가하는 경 향을 나타내 었으며 시료농도 1 mg/mL에서 A549가 90.
- S. typhimurium TA98과 TA100을 이 용한 Ames test를 행한 결과 음성대조군의 복귀 돌연변이 집 락수는 TA98이 18±6 그리고 丁人100은183±8이었다. 홍경천 뿌리 에탄올 추출물과 각 분획 물을 50, 100, 150, 200 Ug/plate의 여 러 농도를 첨 가하여 실험한 결과, 집락수가 음성대조군에 비하여 농도 변화에 따른 집 락수의 큰 변화를 나타내지 않으므로 홍경천 뿌리의 추출물과 각 분획물들은 돌연변이원성을 나타내지 않은 것으로 판단되었다(데이타 생략).
- 7%의 억 제율을 각각 나타내었다. TA100 균주도 동일시 료농도에서 각각 83.7%, 61.7%, 93.8%, 88.3% 그리고 86.1%로 에틸아세테이트 분획물에의 억제율이 TA98에서와 같이 유의적으로(p<0.05) 높은 억제율을 나타내었다.
- 5%, 845%의 억 제율을 나타내었다. TA100 균주의 경우는 직 접변 이원 물질로 MNNG와 4NQO 그리고 간접변이원 물질인 B(a)P와 Trp-PT을 사용하여 홍경천 에탄올 추출물의 억제 효과를 검토한 결과, 시료의 농도 증가에 따라 억제율도 증가하였으며, 200 Ug/plate의 농도를 첨가한 경우 간접 변이원인 B(a)P에 대해 92.6%의 강한 억제율을 나타내었다.
- 6은 홍경천 뿌리 에 탄올 추출물의 A549, HepG2, MCF- 7, AGS 등 인간의 암세포에 대한 저해효과를 나타낸 결과이다. 각 암세포에 대하여 농도의 증가에 따라 농도 의존적으로 암세포 성장 저해효과도 증가하였으며, 시료농도 1.0 mg/mL 에서 각각 88.5%, 76.5%, 70.8% 그리고 80.7%의 억제 효과를 나타내 었다. 특히 인간의 폐 암세 포와 위 암세포의 경 우는 80% 이상의 암세포 성장 저해효과를 나타내었다.
- 5 Ug/m丄를 나타내었다는 연구와 비슷한 결과를 얻었다. 또한 비극성 부분의 분획보다는 극성 부분의 분획 에 서 보다 강력한 항상화 활성 이 인정되었으며, 항산화 활성에 미치는 특이성분들이 극성에서 비 극성 부분까지 고루 분포되어 있는 것을 암시해 주었다.
- 6%의 암세포 성장 억제효과를 나타낸 반면, 다른 분획물에서는 70% 이하의 암세포 성 장 억 제 효과를 나타내 었다. 또한 위 암세포인 AGS의경우는 클로로포름 분획물을 제외한 다른 분획물에서 모두 80%이상의 강한 암세포 성장억제 효과를 나타내었으며, 특히 에틸아세테이트 분획물에서는 다른 분획물보다 유의적(p< 0.05으로 높은 억제활성을 나타내었으며 모든 암세포에서 80%이 상의 높은 암세포 성 장 억 제효과를 나타내었다. 시 료농도가0.
- B(a)P와 Trp-P-1 을 사용하여 각각의 농도에 따른 돌연변이원성 억제효과를 검토하였다. 실험한 결과(Fig. 1) 홍경천 에탄올 추출물에서 TA98균주에 대하여 4NQO(0.15 Ug/ plate), B( a )P(10 Ug/plate 그리고 Trp-P-l(0.5 Hg/plate) 등변이 원 물질에 대하여 농도 의존적으로 억제율이 증가하였으며 , 200 Ug/plate의 농도를 첨가하였을 때 4NQO 그리고 간 접변 이원 물질인 B(a)P와 Trp-PT에 대하여 각각 80.5%, 90.5%, 845%의 억 제율을 나타내었다. TA100 균주의 경우는 직 접변 이원 물질로 MNNG와 4NQO 그리고 간접변이원 물질인 B(a)P와 Trp-PT을 사용하여 홍경천 에탄올 추출물의 억제 효과를 검토한 결과, 시료의 농도 증가에 따라 억제율도 증가하였으며, 200 Ug/plate의 농도를 첨가한 경우 간접 변이원인 B(a)P에 대해 92.
- 8%로 다른 분획 물보다 높은 억제 효과를 나타내었다. 암세포 성장억 제 효과를 검토한 실험 에서는 에틸아세테이트 분획물이 가장 높은 억제활성을 나타내었으며, 시료농도의 증가와 함께 억 제 활성도 증가하는 경 향을 나타내 었으며 시료농도 1 mg/mL에서 A549가 90.5%, HepG2가 81.5%, AGS가 92.2% 그리고 MCF-7이 82.6%의 암세포 성장억제 효과를 나타내었다.
- 앞선 실험에서 나타낸 항산화성의 결과에서 에틸아세테이트 분획물의 강력한 항산화성과 상호 연관시켜 볼 때 기존에 알려진 물질 혹은 미지의 물질이 단독 혹은 복합적 상승작용에 의 해 강한 생리 활성 효과를 나타낸 것으로 추정되었다. 향후 이들 분획물에 대한 좀더 세부적인 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과는 Duhan 등(18)이 홍경천 뿌리 추출물에서 항돌연변이 원성 효과를 나타내었다는 보고와 비슷한 결과를 보여주었으며 특히 본 실험에서 에틸아세테이트 분획물에서 나타난 강력한 항돌연변이성 효과는 매우 주목할 만한 결과로 여겨진다. 앞선 실험에서 나타낸 항산화성의 결과에서 에틸아세테이트 분획물의 강력한 항산화성과 상호 연관시켜 볼 때 기존에 알려진 물질 혹은 미지의 물질이 단독 혹은 복합적 상승작용에 의 해 강한 생리 활성 효과를 나타낸 것으로 추정되었다.
- 또한 홍경천 뿌리 에 탄올 추출물의 활성성분의 특성을 검토하고자 극성이 다른 용매에 대한분획물을 이용하여 이들 암세포에 대한 성장 저해효과를 실험하였다. 인간 간암세포 HepG2에 대한 저 해효과는 0.5, 0.75, 1.0 mg/mL의 시료농도에서 클로로포름층이 약 36〜61%, 핵산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물층에서 각각 다소 높은 54〜74%, 56 -82%, 52〜72% 그리고 50〜76%의 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다. 한편 A549에서는 에틸아세테이트 분획에서 시료농도 0.
- 3pg/mL의 강한 항산화 활성을 나타내었다. 직접 변이원인 MNNG에 대한 항돌연변이 효과에서 S. typhimurium TA100 균주에 대해 홍경천 뿌리 에틸아세테이트 분획물(200ug/plate)에서 다른 분획 물보다 높은 89.1 %의 억 제 효과를 나타내 었 다. 4NQO에 서 도 에틸아세테이트 분획물에서 S.
- typhimurium TA98과 TA100을 이 용한 Ames test를 행한 결과 음성대조군의 복귀 돌연변이 집 락수는 TA98이 18±6 그리고 丁人100은183±8이었다. 홍경천 뿌리 에탄올 추출물과 각 분획 물을 50, 100, 150, 200 Ug/plate의 여 러 농도를 첨 가하여 실험한 결과, 집락수가 음성대조군에 비하여 농도 변화에 따른 집 락수의 큰 변화를 나타내지 않으므로 홍경천 뿌리의 추출물과 각 분획물들은 돌연변이원성을 나타내지 않은 것으로 판단되었다(데이타 생략).
- 홍경천 뿌리 의 에탄올 추출물과 분획 물에 대한 항산화 활성을 측정한 결과, 에틸아세테이트 분획물에서 14.3pg/mL의 강한 항산화 활성을 나타내었다. 직접 변이원인 MNNG에 대한 항돌연변이 효과에서 S.
후속연구
- 실험이 필요할 것으로 사료된다. 본 실험 결과로부터 기초적 인 생리활성 데이터를 제시하였으며, 추후 in 庆I"상에서 독성실험을 수행하여 안전성평가 후 건강보조식품으로서 개발 가능성을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
- 따라서 생리 활성 이 높은 분획물로부터 유용 성 분을 분리 동정하는 실험이 필요할 것으로 사료된다. 본 실험 결과로부터 기초적 인 생리활성 데이터를 제시하였으며, 추후 in 庆I"상에서 독성실험을 수행하여 안전성평가 후 건강보조식품으로서 개발 가능성을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
- 앞선 실험에서 나타낸 항산화성의 결과에서 에틸아세테이트 분획물의 강력한 항산화성과 상호 연관시켜 볼 때 기존에 알려진 물질 혹은 미지의 물질이 단독 혹은 복합적 상승작용에 의 해 강한 생리 활성 효과를 나타낸 것으로 추정되었다. 향후 이들 분획물에 대한 좀더 세부적인 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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