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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 홍경천(Rhodiola dumulosa)을 기능성 식품 소재로 활용하기 위하여 홍경천 메탄올 추출물을용매의 극성 증가순으로 계통분획한 후 이들에 대한 항산화, 항암 및 면역활성과 같은 생리활성을 검토하였다.
제안 방법
- 2. Growth inhibitory effect of each fractions from methanol extract of the Rhodiola dumulosa root in the SW480 colon cancer cells by SRB assay after 24 hours of treatment.
- 배양하면서 실험에 사용하였다. Mono- layer 로 자란 암세포 주를 0.25% trypsin-EDTA 용액으로 처리하여 single cell로 만든 후 최종 세포농도가 5x104 cells/mL 되도록 희석하여 48 well plate에 각 well당 450 L씩 분주한 다음 37 C, 5% CO2 incubator 에서 24시간 동안 배양한 후 홍경천 분획물 희석액을 50 L씩 각 농도별로 첨가하고 48시간 배양한 후 세포증식 정도를 SRB 방법에 의하여 측정하였다 (19).
- 1% N-1-naphthyl-ethylendiamine in H2O : 1% sulfanilamide in 5% H3PO4 = 1 : 1)을 동량 첨가하여 10분간 반응시킨 후 microplate reader(Titertek Multiscan Plus, Finland) 로 550 nm 에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite 의 농도는 sodium nitrite 를 이용하여 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다
- 첨가하여 분획하였다. 각 분획물을 여과한 후 rotary vacuum evaporator로 45C에서 감압농축한 후 4C 냉장고에서 보관하면서 각종 생리활성측정을 위한 시료로 사용하였다.
- 광학현미경으로 세포를 관찰하기 위해 SRB 정량 분석을 하기 전에 대조구와 실험군의 세포모양 변화를 inverted microscope 로 관찰하고 사진을 촬영하였다.
- 이용하여 측정하였다 (20). 대식세포주 (RAW 264.7) 에 홍경천 분획물을 48시간동안 처리 한 후 배양 상층액을 96 well plate에 100 jL씩 넣고 여기에 Griess시약 (0.1% N-1-naphthyl-ethylendiamine in H2O : 1% sulfanilamide in 5% H3PO4 = 1 : 1)을 동량 첨가하여 10분간 반응시킨 후 microplate reader(Titertek Multiscan Plus, Finland) 로 550 nm 에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite 의 농도는 sodium nitrite 를 이용하여 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다
- 로 측정하였다. 즉 각 분획물 및 대조구로 사용한 BHT 1 mL 와 4X10-4 M DPPH 용액 3 mL를 5초 동안 vortex mixer로 혼합하여 첨가한 후 이를 30분간 암소에서 반응시킨 후 흡광도를 측정하고, 대조구는 시료대신 에탄올 1 mL 을 첨가하여 대조구에 대한 흡광도의 감소비율로 나타내었다.
- 홍경천 메탄올 추출물의 분획물이 대식세포의 NO 생산에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 대식세포주인 RAW264.7에 홍경천 분획물들을 농도별로 처리하여 48시간 배양한 후, 배양액 중의 대식세포가 생산한 NO 로부터산화된 NO2-농도를 측정하였다. 그 결과 홍경천메탄올 분획물을 각각 0.
- 홍경천 뿌리 (Rhodiola dumulosa)를 마쇄한 다음 시료 100 g 에 80% 메탄올 1,000 mL 첨가하여 80℃ 에서 3시간동안 3회 열수 추출하고 여과하여 농축한 다음 용매의 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 메탄올 및 물을 첨가하여 분획하였다. 각 분획물을 여과한 후 rotary vacuum evaporator로 45C에서 감압농축한 후 4C 냉장고에서 보관하면서 각종 생리활성측정을 위한 시료로 사용하였다.
- 홍경천(Rhodiola dumulosd)을 기능성 식품소재로 개발하기 위하여 홍경천(뿌리)을 80% 메탄올로 열수 추출하여용매 분획한 후 이들에 대한 항산화, 암세포 성장 억제 및대식세포의 면역활성 등과 같은 기능성을 조사하였다. 홍경천 메탄올 추출물의 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올, 메탄올 및 물 분획물의 수소공여능은 100 g/mL의 농도에서각각 28.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 홍경천(Rhodiola dumulosa)뿌리는 2004년 3월에 중국과학원 식물연구소에서 제공받아 생리활성 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 암세포주는 인체 폐암세포주인 A549(human lung carcinoma cell; KCLB 30022) 및 SW480 (human colon carcinoma cell; KCLB 10228) 를 한국세포주은행으로부터 분양받아 10% FBS(fetal bovine serum) 를 첨가한 RPMI 1640배지를 첨가하여 37C, 5% CO2 incubator에서계대 배양하면서 실험에 사용하였다. Mono- layer 로 자란 암세포 주를 0.
데이터처리
- 실험결과는 평균(mean)士표준편차(SD)로 나타내었고, Student t-test 를 이용하여 통계처리한 후 p<0.05, p<0.01 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 안정된 일산화질소 산화물인 NO2-(nitrite)는 Griess 반응을 이용하여 측정하였다 (20). 대식세포주 (RAW 264.
- 홍경천 추출물의 분획물 대한 DPPH radical 소거활성은 Blois 방법(18) 에 의한 q, q'-diphenyl-picrylhydrazine (DPPH) 의 환원성을 이용하여 517 nm 에 UV/Vis-spectropho- tometer 로 측정하였다. 즉 각 분획물 및 대조구로 사용한 BHT 1 mL 와 4X10-4 M DPPH 용액 3 mL를 5초 동안 vortex mixer로 혼합하여 첨가한 후 이를 30분간 암소에서 반응시킨 후 흡광도를 측정하고, 대조구는 시료대신 에탄올 1 mL 을 첨가하여 대조구에 대한 흡광도의 감소비율로 나타내었다.
성능/효과
- 14% 로서 에틸아세테이트 분획물이 가장 높았으며, 이는 합성 항산화제인 BHT 와 비슷한 항산화 효과를 나타내었다. A549 및 SW480 와같은 암세포에 용매 분획물 1, 10 및 100 g/mL의 농도로 48시간 처리한 결과 에틸아세테이트 분획물이 다른 분획물에 비하여 암세포주의 성장을 강하게 억제하였으며, 그 활성은 농도 의존적으로 나타났다. 또한 100 g/mL의 농도로 48시간 동안 에틸아세테이트 분획물을 암세포에 처리시처리구에서의 암세포는 뚜렷한 세포수의 감소와 함께 심한형태학적 변화가 관찰되었다.
- 결과는 Table 1과 같다. 각 분획물들은 농도 의존적으로 수소공여능이 증가하였으며, 100 g/mL의 농도로 처리시 에틸아세테이트, 메탄올, 부탄올, 헥산 및 물 분획물순으로 각각 53.21, 42.64, 35.48, 28.30 및 21.14%로 활성을나타내었으며, 이 중 에틸아세테이트 분획물은 대조구인항산화성 물질의 BHT(55.21%)를 100 g/mL의 농도로 처리한 구와 비슷한 항산화 활성을 나타내었다.
- 7에 홍경천 분획물들을 농도별로 처리하여 48시간 배양한 후, 배양액 중의 대식세포가 생산한 NO 로부터산화된 NO2-농도를 측정하였다. 그 결과 홍경천메탄올 분획물을 각각 0.1, 1, 10 및 50 g/mL의 농도로 처리시 대조구 (1.056 uM) 에 비하여 NO 의 생산이 증가되었으며, 특히 10 g/mL 이상의 농도에서는 메탄올 분획물 처리구에서 NO 의 생성이 4.878 uM(10 g/mL), 5.669 uM(50 g/mL)로 크게유도 되었다. 또한 대식세포에 1 g/mL 농도의 LPS 와 홍경천메탄올 분획물을 함께 처리시 50 g/mL의 농도에서 부탄올(7.
- 또한 100 g/mL의 농도로 48시간 동안 에틸아세테이트 분획물을 암세포에 처리시처리구에서의 암세포는 뚜렷한 세포수의 감소와 함께 심한형태학적 변화가 관찰되었다. 대식세포주 (RAW 264.7) 에 1, 10 및 50 g/mL의 농도로 용매 분획물을 처리한 후 NO의생성량을 측정한 결과 10 g/mL 이상의 농도에서 메탄올분획물에서 NO 생성을 강하게 유도하였다. 따라서 본 결과는 홍경천의 기능성 식품소재로의 활용 가능성을 시사한다.
- A549 및 SW480 와같은 암세포에 용매 분획물 1, 10 및 100 g/mL의 농도로 48시간 처리한 결과 에틸아세테이트 분획물이 다른 분획물에 비하여 암세포주의 성장을 강하게 억제하였으며, 그 활성은 농도 의존적으로 나타났다. 또한 100 g/mL의 농도로 48시간 동안 에틸아세테이트 분획물을 암세포에 처리시처리구에서의 암세포는 뚜렷한 세포수의 감소와 함께 심한형태학적 변화가 관찰되었다. 대식세포주 (RAW 264.
- 669 uM(50 g/mL)로 크게유도 되었다. 또한 대식세포에 1 g/mL 농도의 LPS 와 홍경천메탄올 분획물을 함께 처리시 50 g/mL의 농도에서 부탄올(7.698 uM) 및 메탄올 분획물 (8.086 uM) 처리구가헥산(5.934 uM), 에틸아세테이트 (3.707 uM), 물 (5.994) 분획물 처리구 보다 NO 의 생성을 더 많이 유도하였다(Fig. 6). Lee 등(22)은 대식세포, 간세포 및 혈관 평활근 세포의 일산화질소 합성에 미치는 홍경천 추출물의 효과에 대하여 조사한 결과 홍경천 뿌리의 물 추출물 단독 처리구에서는 NO 생성을 유도하지 못했지만 interferon- 의 존재하 에서는 농도 의존적으로 NO 의 생성을 증가시키는 결과를 나타내어 홍경천의 물추출물이 NO 의 생성을 높여준다는 유사한 결과를 나타내었다.
- 3 및 4와 같다. 즉, 이들 암세포주의 대조구는 세포막을 유지하며 plate 의 기벽에 부착되어 긴 세포 모양을 유지하고 있으나, 처리구는 사멸한 세포가 배양 용기에서 떨어져 배지에 부유하는 것을 관찰할 수 있었고, 또한 대조구에 비하여 세포의 밀도와 수도 시료 처리 구에서 급격히 감소하였다.
- 홍경천 추출물의 용매분획물은 처리농도에 의존적으로 이들 암세포의 성장을 억제하는 경향을 나타내었다. 특히 에틸아세테이트 분획물은 다른 분획물에 비하여 월등히 높은 암세포 성장억제 효과를 나타내었으며, 특히 100 g/mL의 농도로 처리 시 이들 암세포의 성장을 80% 이상 저해하는 것으로 나타났다.
- 홍경천 메탄올 추출물의 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올, 메탄올 및 물 분획물의 수소공여능은 100 g/mL의 농도에서각각 28.30, 53.21, 35.48, 42.64 및 21.14% 로서 에틸아세테이트 분획물이 가장 높았으며, 이는 합성 항산화제인 BHT 와 비슷한 항산화 효과를 나타내었다. A549 및 SW480 와같은 암세포에 용매 분획물 1, 10 및 100 g/mL의 농도로 48시간 처리한 결과 에틸아세테이트 분획물이 다른 분획물에 비하여 암세포주의 성장을 강하게 억제하였으며, 그 활성은 농도 의존적으로 나타났다.
후속연구
- 억제한다. 따라서 이런 결과를 고려할 때 홍경천 추출물은 NO 생성을유도하여 암세포의 성장을 억제하는 것으로 생각되나, 이에 대한 연구는 더욱 진행되어야 할 것으로 생각된다.
- 따라서 이전의 연구결과 및 본 실험의 결과를 종합하여볼 때 홍경천에는 암세포 증식을 억제하는 물질을 함유하고 있다는 것을 알 수 있었으며, 차후 이들 물질을 분리한 후 암세포의 사멸 기전에 관한 심도 깊은 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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