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문제 정의
- 시코닌의 최초 상업화(5)를 시작으로 최근에는 주목 세포배양에 의한 항암제 택솔의 대량생산의 성과가 있었다(6). 본연구에서는 식물세포배양 기술을 이용하여 산삼 세포배양을 우선 확립하고 안정된 세포주를 확보하고자 한다. 그 동안 연구 보고된 결과가 많지 않은 산삼 세포주의 배양 특성은 기존의 인삼 세포 배양 결과와 비교함으로서 분석이 가능할 것으로 여겨진다.
- 그 동안 연구 보고된 결과가 많지 않은 산삼 세포주의 배양 특성은 기존의 인삼 세포 배양 결과와 비교함으로서 분석이 가능할 것으로 여겨진다. 이러한 산삼과 인삼의 세포 배양 특성 외에도 이들이 생산하는 생리활성물질의 생산 특성도 본 연구에서 비교 분석하고자 한다.
제안 방법
- Callus 유도를 위하여 산삼 시료는 뿌리 및 뇌두 부위, 재배 인삼 시료는 배(embryo), 잎, 뿌리 부위를 구분하여 각각 표면 살균을 실시한 후, 적당한 크기로 절편을 내어 callus 유도용 agar 배지에 치상하였다. 시료의 부위별 살균 방법은 다음과 같다.
- Intracellular ginsenoside 함량 분석을 위해 동결 건조된 세포 100 mg을 이용하였으며, 수포화 n-buthanol을 5 mL 첨가하여 30분 동안 초음파 분쇄하고 원심분리 후, 상징액을 진공 건조한 다음 methanol로 녹여 분석에 사용하였다. Extracellular ginsenoside 함량 분석을 위해서는 배양배지 5 mL에 동량의 수포화 n-buthanol을첨가하여 partitioning에 의해 2회 추출하고, 각각의 추출단계에서 얻은 buthanol 층을 진공 건조한 다음 methanol로 녹여 분석에 사용하였다. 두 가지 경우의 최종 methanol 추출액은 0.
- cell weight (FDCW)으로 측정되었다. FCW는 배양된 세포를 Whatman No. 1의 여과지를 사용하여 수분을 제거한 후, 남은 세포의 무게를 저울로 측정하여 얻었고, FDCW는 용기의 무게가 미리 측정된 falcone tube에 fresh cell을 넣고, deep freezer에서 -70°C로 냉동 후, 동결건조기에서 건조하여 세포내 수분을 완전히 제거한 후, 세포의 건조량을 측정하여 얻었다. 그리고 모든 세포량의 단위는 g/L로 환산하여 나타내었다.
- 또한, 산삼으로부터 callus 유도실험을 수행하기 전에 먼저 재배인삼 시료로부터 callus 유도실험을 수행하여 실험 오류를 줄였다. MS 기본배지에 탄소원으로서 sucrose 3%, pH 5.8, agar 0.7%의 고체배지에 살균된 시료를 치상하여 callus를 유도하였다. 이때 식물생장조절제로서 2, 4-D와 kinetin-g- 사용하였고, 이들을 각각 1 - 5 ppm, 0.
- 구분하여 조사하였다. Intracellular ginsenoside 함량 분석을 위해 동결 건조된 세포 100 mg을 이용하였으며, 수포화 n-buthanol을 5 mL 첨가하여 30분 동안 초음파 분쇄하고 원심분리 후, 상징액을 진공 건조한 다음 methanol로 녹여 분석에 사용하였다.
- 또한 세포배양 과정에서 인삼의 대표적 생리활성물질인 ginsenoside의 생합성 특성을 조사하였다. 그리고 기초 실험 결과로부터 최적화된 현탁 세포배양조건 및 이차대사산물 생산성 증대를 위한 조건들을 산삼 세포에 적용하여 실험하였다.
- 재배인삼 세포는 앞에서 진행된 세포배양 기초실험에사용되었던 KE 세포를 사용하였다. 그리고 앞에서 수행되었던 basic kinetics 실험 결과에서 세포의 증식속도가 매우 느림을 알 수 있었는데, 세포배양 비교 연구에 경제적인 측면에서 불리한 면이 있으므로, 이를 해결하기 위해 본 실험부터는 세포 접종량을 증가하여 실험하였다. 또한 새로 선정된 MS 기본 배지의 탄소원 2%, 식물생장조절제는 2, 4-D와 kinetin 이 각각 2 ppm 와 0.
- Extracellular ginsenoside 함량 분석을 위해서는 배양배지 5 mL에 동량의 수포화 n-buthanol을첨가하여 partitioning에 의해 2회 추출하고, 각각의 추출단계에서 얻은 buthanol 층을 진공 건조한 다음 methanol로 녹여 분석에 사용하였다. 두 가지 경우의 최종 methanol 추출액은 0.45 im filter로 여과한 후, HPLC 분석방법으로 분석하였다. 분석조건은 Samukawa 등(13)의 방법을 참고하여 최적화 하였는데, 분리 칼럼은 C-18 (Shiseido사의 UG 120 A, 5 pm, 4.
- 그리고 앞에서 수행되었던 basic kinetics 실험 결과에서 세포의 증식속도가 매우 느림을 알 수 있었는데, 세포배양 비교 연구에 경제적인 측면에서 불리한 면이 있으므로, 이를 해결하기 위해 본 실험부터는 세포 접종량을 증가하여 실험하였다. 또한 새로 선정된 MS 기본 배지의 탄소원 2%, 식물생장조절제는 2, 4-D와 kinetin 이 각각 2 ppm 와 0.2 ppm 인 배지 조건에서 비교 실험을 수행하였다.
- 따라서 상대적으로 세포 성장 속도가 빠른 재배인삼 유래의 KE 세포를 대상으로 세포배양기초 실험을 수행하였다. 또한 세포배양 과정에서 인삼의 대표적 생리활성물질인 ginsenoside의 생합성 특성을 조사하였다. 그리고 기초 실험 결과로부터 최적화된 현탁 세포배양조건 및 이차대사산물 생산성 증대를 위한 조건들을 산삼 세포에 적용하여 실험하였다.
- 기본조건을 찾았다. 또한, 산삼으로부터 callus 유도실험을 수행하기 전에 먼저 재배인삼 시료로부터 callus 유도실험을 수행하여 실험 오류를 줄였다. MS 기본배지에 탄소원으로서 sucrose 3%, pH 5.
- 무균대에서 Whatman No. 1의 여과지가 들어있는 멸균된 funnel을 사용하여 진공펌프에 의해 현탁세포의 배지가 제거되었고, 여과되고 남은 세포들을 고르게 섞어 준 후 40 mL 배지가 들어 있는 125 mL 삼각플라스크에 10 -20%(w/v)의 접종량으로 접종하였다. 회분배양 온도 조건은 25°C, 진탕기의 회전속도는 120 rpm으로 유지하였다.
- 배양된 세포의 세포량은 fresh cell weight (FCW)와 freezing drying cell weight (FDCW)으로 측정되었다. FCW는 배양된 세포를 Whatman No.
- 실험에사용된 세포는 한국산 재배인삼에서 유도된 KE였다. 배양조건은 120 rpm으로 유지되는 진탕 배양기에서 25 °C 배양온도를 유지하였으며, 시간별로 샘플링하여 세포성장 및 탄소원소모량 그리고 ginsenoside 생산량을 측정하였다.
- 세포 배양 중 배지의 당 농도를 측정하기 위해 sucrose, glucose와 fructose를 HPLC 방법에 의해 동시 분석하였다. 분석에 사용된 검출기는 refractive index(RI) detector 였고, 컬럼은 Shodex Asahipak NH2P-5O 4E를 사용하였으며, 이동상조건은 상온에서 acetonitrile 과 물을 80 : 20으로 유지하면서 2.0 mL/min의 유속으로 분석하였다.
- 45 im filter로 여과한 후, HPLC 분석방법으로 분석하였다. 분석조건은 Samukawa 등(13)의 방법을 참고하여 최적화 하였는데, 분리 칼럼은 C-18 (Shiseido사의 UG 120 A, 5 pm, 4.6 mm x 250 mm)을 이용하였고, UV 203 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 이동상은 아세토나이트릴(MeCN)과 물을 혼합 사용하는데, 초기에는 MeCN의 농도를 25%로부터 시작하여 30분 후에 50%까지 증가시키며 분석하였다.
- 세포성장 정도를 비교 조사하였다. 비교 조사된 배지의종류는 MS, B5, hMS, SH 기본 배지이며, 모든 배지는 공통적으로 탄소원은 2%, 식물생장조절제는 2, 4-D와 kinetin을 각각 2 ppm, 0.2 ppm으로 제조하여 사용하였다. KE 세포를 접종 후, 주기적으로 계대배양을 하면서 세포의 성장량을 조사하였는데, 총 4회의 계대 배양 후 세포량 증식 정도는 MS 기본배지 조건에서 가장 우수하였다 (자료 미제시).
- 유도하였다. 산삼 시료는 고가이며 귀하기 때문에우선 재배인삼을 사용하여 callus 유도방법을 최적화 한 후산삼 callus를 유도하였다. MS 기본배지에 탄소원으로서 sucrose 3%, pH 5.
- 산삼과 인삼의 세포주를 확립하고, 배양을 통하여 세포성장 및 탄소원 소모 경향과 이들이 생산하는 생리활성물질의 (ginsenoside) 생성 특성을 비교 분석하였다. 세포주는 직접산삼(KM2, KM3, KM5의 뿌리) 및 재배인삼(포천, 홍천, 영주, 무주와 금산에서 재배된 시료)으로부터 callus를 유도하고장기간 배양하여 확립하였다.
- 산삼과 재배인삼 세포 배양에서 basic kinetics를 비교하였다. 세포배양 비교실험에 사용된 산삼은 KM5 세포로서 나머지 세포주들에 비교하여 세포성장 속도가 좀더 우수한 경우였다.
- 산삼으로부터 callus를 유도하기 위해서 지금 까지 발표되어온 인삼 callus 유도와 관련된 논문들(7-12)을 참고하여 일차적인 기본조건을 찾았다. 또한, 산삼으로부터 callus 유도실험을 수행하기 전에 먼저 재배인삼 시료로부터 callus 유도실험을 수행하여 실험 오류를 줄였다.
- 삼각플라스크 회분 배양실험을 위해서 MS 기본 배지에 탄소원으로서 sucrose 3%, pH 5.8, 그리고 식물생장조절 제로서 2.4- D 3 ppm 조건의 배지를 125 mL용 삼각플라스크에 40 mL씩 넣고 15%(w/v)로 세포접종을 하여 실험하였다. 실험에사용된 세포는 한국산 재배인삼에서 유도된 KE였다.
- 세포배양 연구를 위해 직접 산삼 및 재배인삼으로부터 callus를 유도하였다. 산삼 시료는 고가이며 귀하기 때문에우선 재배인삼을 사용하여 callus 유도방법을 최적화 한 후산삼 callus를 유도하였다.
- 세포의 증식 속도를 증가시키기 위해 배지의 종류에 따라서 세포성장 정도를 비교 조사하였다. 비교 조사된 배지의종류는 MS, B5, hMS, SH 기본 배지이며, 모든 배지는 공통적으로 탄소원은 2%, 식물생장조절제는 2, 4-D와 kinetin을 각각 2 ppm, 0.
- 1 - 1 ppm 의 농도 범위 내에서 다양한 농도 조합으로 callus를 유도하였다. 유도된 산삼 및 재배인삼 callus는 MS 기본배지에 탄소원은 sucrose 3%, pH 5.8, agar 0.7%, 그리고 식물생장조절제로서 2, 4-D와 kinetin을 각각 1 ppm, 0.1 ppm 갖는 고체배지에서 약 30일 간격으로 계대 배양 하였다. 현탁 배양은 위와 동일 조건을 갖는 액체배지가 들어있는 500 mL 삼각플라스크에서 10일 간격으로 계대 배양하여 증식시키고, 회분배양 실험에 사용하였다.
- 6 mm x 250 mm)을 이용하였고, UV 203 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 이동상은 아세토나이트릴(MeCN)과 물을 혼합 사용하는데, 초기에는 MeCN의 농도를 25%로부터 시작하여 30분 후에 50%까지 증가시키며 분석하였다.
- 7%의 고체배지에 살균된 시료를 치상하여 callus를 유도하였다. 이때 식물생장조절제로서 2, 4-D와 kinetin-g- 사용하였고, 이들을 각각 1 - 5 ppm, 0.1 - 1 ppm 의 농도 범위 내에서 다양한 농도 조합으로 callus를 유도하였다. 유도된 산삼 및 재배인삼 callus는 MS 기본배지에 탄소원은 sucrose 3%, pH 5.
- KE 세포를 접종 후, 주기적으로 계대배양을 하면서 세포의 성장량을 조사하였는데, 총 4회의 계대 배양 후 세포량 증식 정도는 MS 기본배지 조건에서 가장 우수하였다 (자료 미제시). 이러한결과는 실험에 사용하기 위한 세포량 확보를 위해서 세포증식이 매우 어려운 산삼 세포들에 대하여 적용하였다. 그 결과 산삼 세포들의 증식률이 증가하였고, 계대배양 기간 또한 10일 이내로 단축되는 결과를 얻게 되었다.
- 인삼의 주요 이차대사산물인 ginsenoside의 현탁 배양에서의 생성 변화를 조사 하였다. 실험 결과, Fig.
대상 데이터
- 본 연구에서는 직접 유도한 산삼 cell line의 경우 성장속도가 매우 느리므로 세포배양 실험을 위한 증식에 어려움이 있었다. 따라서 상대적으로 세포 성장 속도가 빠른 재배인삼 유래의 KE 세포를 대상으로 세포배양기초 실험을 수행하였다. 또한 세포배양 과정에서 인삼의 대표적 생리활성물질인 ginsenoside의 생합성 특성을 조사하였다.
- 산삼시료는 한국산 산삼시료 중 KM2, KM3, KM5 의 뿌리에서 callus를 유도하였고, 재배인삼의 경우 포천, 홍천, 영주, 무주, 금산에서 재배된 시료로부터 callus를 유도하였다.
- 삼각플라스크에서의 회분배양 실험에 사용된 현탁 세포는 대수 성장기 상태에 있는 것을 사용하였다 . 무균대에서 Whatman No.
- 생성 특성을 비교 분석하였다. 세포주는 직접산삼(KM2, KM3, KM5의 뿌리) 및 재배인삼(포천, 홍천, 영주, 무주와 금산에서 재배된 시료)으로부터 callus를 유도하고장기간 배양하여 확립하였다. 산삼과 재배인삼 세포배양 결과 나타난 특성을 비교해 보면, specific growth rateQi, day-1) 는 각각 0.
- 4- D 3 ppm 조건의 배지를 125 mL용 삼각플라스크에 40 mL씩 넣고 15%(w/v)로 세포접종을 하여 실험하였다. 실험에사용된 세포는 한국산 재배인삼에서 유도된 KE였다. 배양조건은 120 rpm으로 유지되는 진탕 배양기에서 25 °C 배양온도를 유지하였으며, 시간별로 샘플링하여 세포성장 및 탄소원소모량 그리고 ginsenoside 생산량을 측정하였다.
- 세포배양 비교실험에 사용된 산삼은 KM5 세포로서 나머지 세포주들에 비교하여 세포성장 속도가 좀더 우수한 경우였다. 재배인삼 세포는 앞에서 진행된 세포배양 기초실험에사용되었던 KE 세포를 사용하였다. 그리고 앞에서 수행되었던 basic kinetics 실험 결과에서 세포의 증식속도가 매우 느림을 알 수 있었는데, 세포배양 비교 연구에 경제적인 측면에서 불리한 면이 있으므로, 이를 해결하기 위해 본 실험부터는 세포 접종량을 증가하여 실험하였다.
이론/모형
- 그리고 모든 세포량의 단위는 g/L로 환산하여 나타내었다. 세포 배양 중 배지의 당 농도를 측정하기 위해 sucrose, glucose와 fructose를 HPLC 방법에 의해 동시 분석하였다. 분석에 사용된 검출기는 refractive index(RI) detector 였고, 컬럼은 Shodex Asahipak NH2P-5O 4E를 사용하였으며, 이동상조건은 상온에서 acetonitrile 과 물을 80 : 20으로 유지하면서 2.
성능/효과
- 2 ppm으로 제조하여 사용하였다. KE 세포를 접종 후, 주기적으로 계대배양을 하면서 세포의 성장량을 조사하였는데, 총 4회의 계대 배양 후 세포량 증식 정도는 MS 기본배지 조건에서 가장 우수하였다 (자료 미제시). 이러한결과는 실험에 사용하기 위한 세포량 확보를 위해서 세포증식이 매우 어려운 산삼 세포들에 대하여 적용하였다.
- 산삼 시료는 고가이며 귀하기 때문에우선 재배인삼을 사용하여 callus 유도방법을 최적화 한 후산삼 callus를 유도하였다. MS 기본배지에 탄소원으로서 sucrose 3%, pH 5.8, agar 0.7% 그리고 식물생장조절제로서 2.4- D와 kinetin을 각각 1 ppm과 0.1 ppm 또는 2, 4-D 단독으로 3 ppm 일 때 callus를 가장 잘 유도할 수 있었다. 한국산재배인삼은 포천, 홍천, 영주, 무주, 금산 지역의 인삼을 사용하여 뿌리로부터 각각 callus를 유도하였으며, 또한 금산지역에서 유래한 종자의 embryo 로부터도 유도하였다.
- 한국산산삼의 경우 생리활성성분 분석결과 한국산 산삼으로 판별되는 시료들 중에서 총 3 종류의 산삼시료로부터 callus 유도를하였고, 각각 KM2, KM3, KM5로 명명하였다. 같은 방법으로 판별된 중국산 산삼 시료들 중 총 2 종류의 산삼시료로부터 callus를 유도하였고, 각각 CM1, CM2로 명명하였다. 이들 cell line들은 약 30일 간격으로 계대 배양 하였고, 증식된 callus 세포들은 같은 조건의 액체배지에 현탁 배양하여 세포배양 실험을 위해 사용되었다.
- 이러한결과는 실험에 사용하기 위한 세포량 확보를 위해서 세포증식이 매우 어려운 산삼 세포들에 대하여 적용하였다. 그 결과 산삼 세포들의 증식률이 증가하였고, 계대배양 기간 또한 10일 이내로 단축되는 결과를 얻게 되었다. 그러나 세포의성장에 대한 배지 조건의 최적화 연구는 좀더 다양하게 진행되어야 할 것으로 생각된다.
- 53 mg/L day로 재배 인삼 세포에서 약 5배 더 높게 나타났다. 그런데 sugar consumption rate는 각각 1.51 과 1.54 g/L day로 비슷한 수준으로 나타났는데, 이러한 결과들을 고찰해 볼 때, 기초 세포배양 조건에서는 KM5 보다 재배인삼인 KE 세포에서 ginsenoside 생합성 대사가 더욱 활발하게 이루어지고 있음을 알 수 있었다.
- 세포주는 직접산삼(KM2, KM3, KM5의 뿌리) 및 재배인삼(포천, 홍천, 영주, 무주와 금산에서 재배된 시료)으로부터 callus를 유도하고장기간 배양하여 확립하였다. 산삼과 재배인삼 세포배양 결과 나타난 특성을 비교해 보면, specific growth rateQi, day-1) 는 각각 0.067과 0.035로서 산삼유래의 KM5 세포가 약 2배정도 빨랐고, 반면에 ginsenoside 생성속도는 각각 0.53과 2.53 mg/L day로 재배인삼 세포에서 약 5배 더 높게 나타났다. 그런데 sugar consumption rate는 각각 1.
- 산삼과 재배인삼 세포배양 결과 나타난 특성을 종합적으로 비교해 보면, specific growth rate(jl, day-1)는 각각 0.067과 0.035로서 산삼유래의 KM5 세포가 약 2배 정도 빨랐고, 반면에 ginsenoside 생성속도는 각각 0.53과 2.53 mg/L day로 재배 인삼 세포에서 약 5배 더 높게 나타났다. 그런데 sugar consumption rate는 각각 1.
- 이러한 결과는 식물세포배양에 의한 이차대사산물 생성 시 나타나는 non-growth associated 생성 유형에 가깝다고 판단된다. 세포 내외의 ginsenoside 함량을 비교 조사한 결과, 세포에서 생성된 ginsenoside는 세포막 을 통과하여 세포 밖으로 원활하게 분비된다는 특성을 알 수 있었다. 위 결과와 같이 생성된 前nsenoside가 대등한 함량비율로 세포 밖으로 분비되는 특성은, 세포막을 기준으로 세포 안 밖의 생성물 농도 차에 기인하는 물질수송 능력과 더불어 물에 잘 녹을 수 있는 배당체의 화학구조를 갖는 ginsenoside의 친수성에 기인하여 나타난다고 여겨진다.
- 생성 변화를 조사 하였다. 실험 결과, Fig. 3과 같이 세포 성장이 대수증식기로 접어들면서 생성량이 급격히 증가하기 시작하였고, 세포성장이 stationary phase로 전환되면서 생성이 더 이상 증가하지 못하고, 오히려 감소되는 경향을 보였다. 이러한 결과는 식물세포배양에 의한 이차대사산물 생성 시 나타나는 non-growth associated 생성 유형에 가깝다고 판단된다.
- 세포 내외의 ginsenoside 함량을 비교 조사한 결과, 세포에서 생성된 ginsenoside는 세포막 을 통과하여 세포 밖으로 원활하게 분비된다는 특성을 알 수 있었다. 위 결과와 같이 생성된 前nsenoside가 대등한 함량비율로 세포 밖으로 분비되는 특성은, 세포막을 기준으로 세포 안 밖의 생성물 농도 차에 기인하는 물질수송 능력과 더불어 물에 잘 녹을 수 있는 배당체의 화학구조를 갖는 ginsenoside의 친수성에 기인하여 나타난다고 여겨진다. 이러한 특성은 인삼 세포배양에 의한 ginsenoside 생산 시 생산성 향상을 위한 여러 기술들의 적용에 매우 유리한 조건이 될 것이다.
후속연구
- 그 결과 산삼 세포들의 증식률이 증가하였고, 계대배양 기간 또한 10일 이내로 단축되는 결과를 얻게 되었다. 그러나 세포의성장에 대한 배지 조건의 최적화 연구는 좀더 다양하게 진행되어야 할 것으로 생각된다. 즉, 배지의 구성 성분들 중 salt 성분들의 최적화, 탄소원의 최적화, 그리고 식물생장조절제의최적화 등 많은 성분들에 대한 체계적인 조사와 더불어 최적화 연구를 진행함으로써 산삼 세포주의 세포성장에 가장 알맞은 배양배지 조건을 규명할 수 있을 것이다.
- 위 결과와 같이 생성된 前nsenoside가 대등한 함량비율로 세포 밖으로 분비되는 특성은, 세포막을 기준으로 세포 안 밖의 생성물 농도 차에 기인하는 물질수송 능력과 더불어 물에 잘 녹을 수 있는 배당체의 화학구조를 갖는 ginsenoside의 친수성에 기인하여 나타난다고 여겨진다. 이러한 특성은 인삼 세포배양에 의한 ginsenoside 생산 시 생산성 향상을 위한 여러 기술들의 적용에 매우 유리한 조건이 될 것이다.
- 그러나 세포의성장에 대한 배지 조건의 최적화 연구는 좀더 다양하게 진행되어야 할 것으로 생각된다. 즉, 배지의 구성 성분들 중 salt 성분들의 최적화, 탄소원의 최적화, 그리고 식물생장조절제의최적화 등 많은 성분들에 대한 체계적인 조사와 더불어 최적화 연구를 진행함으로써 산삼 세포주의 세포성장에 가장 알맞은 배양배지 조건을 규명할 수 있을 것이다.
- 하지만 현재로서 가장 시급한 문제는 보다 과학적인 산삼의 진위 및 산지 판별을 통하여 산삼의 부정 거래를 방지하는 것이다. 최근 과학적 연구(2)를 통하여 산삼의 유전자 차이 및 재배 환경에 따른 산삼 식별이 일부 가능해진 것은 매우다행스런 일이며, 앞으로 관련 연구가 계속적으로 이루어져야 할 것으로 생각한다.
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