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문제 정의
- 본 연구에서는 발효기간 중 교반속도와 통기속도를 일정한 범위에서 동시에 조절하여 용존산소 농도가 미생물유래 TG 생산에 미치는 영향 및 용존산소 농도에 따른 미생물유래 TG의 생산성 변화를 조사하고자한다.
제안 방법
- Streptoverticillium 皿刃改〃•如 로부터 미생물 유래 trans이utaminase 생산을 위하여 최적의 용존산소 농도를 구명 하였다. 용존산소는 용존산소 농도 자동 조절 시스템에 의해 조절되었다.
- 반응기 내에서 방출되는 CO2와 o2 농도는 가스 분석기 (Lokas, Korea)를 이용하여 측정하였다.
- 2에 나타냈다. 발효 중 용존산소 농도 조절을 위해 통기속도 0.3-3.9 L/min, 교 반속도 260 rpm 이상으로 작동되도록 설정하였고, 먼저 지정 된 용존산소 농도 유지를 위해 통기속도가 우선적으로 작동 되도록 하였으며, 만약 통기속도의 증가만으로 지정된 용존 산소 농도를 도달할 수 없을 경우 교반속도와 동시에 작동되 도록 하였다. 실험 자료는 각각의 지정된 용존산소 농도에 대하여 1초마다 측정하여, 지정된 용존산소 농도가 상당기간 유지되는지 확인할 수 있도록 50분 동안 수집하였다.
- 발효를 하는 동안 용존산소 농도 조절 시스템 (on-line computer-controlled fermentation system) 의 실제 작동여부를 확인하고자, 용존산소 농도를 10-50%까지 조절하면서 교반속 도와 통기속도의 변화를 관찰하여 Fig. 2에 나타냈다. 발효 중 용존산소 농도 조절을 위해 통기속도 0.
- 지정된 용존산소 농도 유지를 위해 통기속도가 우선적으로 작동되도록 하였으며, 만약 통기속도 의 증가만으로 지정된 용존산소 농도를 유지할 수 없을 경우 교반속도가 동시에 작동되도록 하였다. 발효조에서 용존산소 를 조절하지 않고 일정한 교반속도에서 회분 배양한 실험을 대조구로 하였다{Table 1).
- 1과 같다. 산소 의 공급은 공기압축기를 이용하여 발효기 내로 공급하였으며, 원하는 용존산소 농도는 일차적으로 통기속도 0.3-3.9 L/min 범위 내에서 배지내의 용존산도 농도를 측정하여 자동으로 통기속도를 조절하여 유지하였다. 그러나 통기속도 하나를 변화시켜 원하는 용존산소 농도로의 조절이 쉽지 않은 경우, 교반속도를 260-360 rpm 범위에서 동시에 변화시켜 원하는 용존산소 농도로 자동으로 조절되도록 하였다.
- 0, 온도 30℃, 교반속도 250 rpm에서 3일간 진 탕 배양하였다. 생산배지 조성은 soluble starch 5%, proteose peptone 2%, yeast extract 0.2%, NaH2PO4 -・2压0 0.1%, MgSO4 0.1%, polypropylene glycol 0.05%이었고, pH는 2 N HC1 또는 2 N NaOH를 사용하여 7.0으로 조절하였다.
- 9 L/min, 교 반속도 260 rpm 이상으로 작동되도록 설정하였고, 먼저 지정 된 용존산소 농도 유지를 위해 통기속도가 우선적으로 작동 되도록 하였으며, 만약 통기속도의 증가만으로 지정된 용존 산소 농도를 도달할 수 없을 경우 교반속도와 동시에 작동되 도록 하였다. 실험 자료는 각각의 지정된 용존산소 농도에 대하여 1초마다 측정하여, 지정된 용존산소 농도가 상당기간 유지되는지 확인할 수 있도록 50분 동안 수집하였다. 발효 초기 100%를 유지하던 용존산소 농도는 발효가 진행되면서 미생물의 성장으로 인하여 감소하였으며, 배양시작 10시간 후부터 바닥상태를 나타냈다.
- 용존산소 농도 자동 조절 시스템을 이용하여 회분식 발효 에서 용존산소 조절이 효소생산에 미치는 영향을 규명하고자 용존산소 농도를 10-30%로 조절하여 실험을 수행하였다. 발 효 중 용존산소 농도 조절을 위해 통기속도와 교반속도는 각각 0.
- 발효배양액의 잔류당은 Miller(25)가 제시한 dinitrosalicyclic acid (DNS)를 이용하여 측정하였다. 전분함량은 Dubois(26) 방법을 보완해서 측정하였다.
- 종균배양을 위해 사용된 배지의 조성은 glucose 0.5%, proteose peptone 0.2%, MgSO4 0.1%, K2HPO4 0.2%이며, 종 균배지 80 mL에 Bacto agar 배지에서 취한 1甘 포자를 접종 하여, pH 7.0, 온도 30℃, 교반속도 250 rpm에서 3일간 진 탕 배양하였다. 생산배지 조성은 soluble starch 5%, proteose peptone 2%, yeast extract 0.
- 과도한 전 단력에 의한 미생물의 불활성을 고려하여 교반속도의 최고값은 회분식 배양에서 최대 생산성을 보여준 360 rpm으로 제 한하였다(자료 미제시). 지정된 용존산소 농도 유지를 위해 통기속도가 우선적으로 작동되도록 하였으며, 만약 통기속도 의 증가만으로 지정된 용존산소 농도를 유지할 수 없을 경우 교반속도가 동시에 작동되도록 하였다. 발효조에서 용존산소 를 조절하지 않고 일정한 교반속도에서 회분 배양한 실험을 대조구로 하였다{Table 1).
- 건조균체농도를 측정하기 위해 일정량을 취하여 3, 000 rpm 에서 10분간 원심분리한 후 상징액은 버리고 증류수를 넣어 혼합, 다시 원심분리하여 세척과정(3번)을 거친 후 105℃에서 항량을 구하였다. 효소활성은 Folk(23) 방법을 보완해서 측정 하였고 1 Unit는 1 ]imol L-glutamic acid Y-monohydroxamate가 생성되는 양으로 정하였다. 단백질 함량은 bovine serum albumin-t 표준 단백질로 하여 Lowery(24) 방법으로 정량하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 균주는 Streptoverticillium morbaraense (ATCC 29302)이며, 균주의 활성을 유지하기 위하여 Bacto agar(DIFCO) 배지에서 2개월마다 계대배양하였다.
이론/모형
- 효소활성은 Folk(23) 방법을 보완해서 측정 하였고 1 Unit는 1 ]imol L-glutamic acid Y-monohydroxamate가 생성되는 양으로 정하였다. 단백질 함량은 bovine serum albumin-t 표준 단백질로 하여 Lowery(24) 방법으로 정량하였다. 발효배양액의 잔류당은 Miller(25)가 제시한 dinitrosalicyclic acid (DNS)를 이용하여 측정하였다.
- 단백질 함량은 bovine serum albumin-t 표준 단백질로 하여 Lowery(24) 방법으로 정량하였다. 발효배양액의 잔류당은 Miller(25)가 제시한 dinitrosalicyclic acid (DNS)를 이용하여 측정하였다. 전분함량은 Dubois(26) 방법을 보완해서 측정하였다.
성능/효과
- 3에 나타냈다. mTG 생산은 용존산 소 농도를 20%로 유지했을 경우 배양 7일에 2.12 U/mL로 대조구(1.95 U/mL)보다 약 1.1 배 향상되었고, 용존산소 농도를 10%와 30%로 조절했을 경우 효소생산은 각각 1.6과 1.67 U/mL로 대조구(1.95 U/mL)보다 낮은 효소생산을 나타냈다. 건조균체량은 용존산소 농도를 20%로 유지했을 경우 12.
- 따라서 5. morbaraense 에 의해 생산되는 미생물 유래 transglutaminase의 최적 용존산소 농도는 약 20%로 판단되었다. 그리고 용존산소 농도의 조절이 미생물의 배양에 중요한 경우, 사용된 용존산소 농도 조절 시스템은 최종 생성물의 생산성을 높일 수 있는 효과적인 장치로 판단된다.
- 결과적으로 상기결과를 요약하면 효소생산은 용존산소 농도를 조절하지 않은 회분배양(1.95 U/mL)과 유가식 배양(2.21 U/mL)보다 각각 약 1.3배와 1.2배 향상됨을 알 수 있었다. 따라서 5.
- 9 L/min 까지 증가되었다. 그러나 통기속도만으로는 용존산소 농도 20%에 도달할 수 없었으며, 교반속도가 최소값인 266 rpm에서 서서히 증가하여 일정하게 유지되었다. 원하는 용존산소 농도 값이 20%보다 증가하면 교반속도도 높게 증가되는 현 상을 보여주었다.
- 9 L/min, 교반속도는 299 rpm까지 각각 증가하는 경향을 보였다. 그리고 발효 105시간 이후부터 통기속도와 교반속도는 최소 설정 값으로 일정하게 유지되었다. 발효가 진행되는 동안 방출되는 6와 C6의 변화를 Fig.
- 방출된 02 농도는 균체가 빠르게 증식되는 발효 초기에 더욱 감소되었고, CO2 농도는 반대로 높게 측정되었다. 또한 CO2 농도는 회분배양 의 경우보다 높게 측정되어 균체량의 증가 또는 효소 생산증 가를 예측할 수 있었다.
- 즉 용존산소 농도 10% 유지는 교반속도 의 변화 없이 통기속도만으로 가능하였다. 또한 용존산소 농 도 20-50% 유지를 위해서 조절하고자 하는 용존산소 농도 값을 컴퓨터에 입력하자 곧 통기속도는 최대값인 3.9 L/min 까지 증가되었다. 그러나 통기속도만으로는 용존산소 농도 20%에 도달할 수 없었으며, 교반속도가 최소값인 266 rpm에서 서서히 증가하여 일정하게 유지되었다.
- 7배 향상됨을 확인할 수 있었다 (Table 2). 또한 회분식 배양 실험에서 확립된 용존산소 농도 20%를 유가식 배양에 적용함으로써 수율을 향상시킬 수 있 으리라 판단되었다. 유가식 배양에서 용존산소 농도를 20%로 조절했을 때의 실험결과를 Fig.
- 발효 중 방출되는 CO2와 6농도는 용존산소가 조절되는 시기에 왕성한 세포성장과 세포대사로 인하여 02 농도는 감 소되고 CO, 농도는 상대적으로 증가하였다. 특히 용존산소 농도를 20%로 유지했을 경우 CO2 농도는 0.
- 7에 나타냈다. 발효 중 용존산소 농도 조절은 회분식 배양조건과 동일하며, 용존산소 농도 20% 유지를 위해 통기속도는 최대 3.9 L/min, 교반속도는 299 rpm까지 각각 증가하는 경향을 보였다. 그리고 발효 105시간 이후부터 통기속도와 교반속도는 최소 설정 값으로 일정하게 유지되었다.
- 4 에 나타냈다. 발효가 시작되면서 미생물들은 대수적으로 증 가하여 용존산소 농도는 감소되었고 발효시작 2시간 후부터 지정된 용존산소 농도(20% DO)로 조절되기 시작하였다. 통 기속도는 지정된 농도로 조절되는 시기에 모두 최대값인 3.
- 본 연구에서는 상기 결과를 토대로 질소원인 proteose peptone(20 g/L)을 6일 동안 연속적으로 공급하여 발효 기간 중 질소원의 농도를 낮게 유지하는 실험을 수행한 결과, 회 분식 배양보다 유가식 배양에서 효소생산과 비활성 (specific activity)이 각각 1.1과 1.7배 향상됨을 확인할 수 있었다 (Table 2). 또한 회분식 배양 실험에서 확립된 용존산소 농도 20%를 유가식 배양에 적용함으로써 수율을 향상시킬 수 있 으리라 판단되었다.
- 1 배 향상되었다. 역시 가장 높은 미생물유래 transglutaminase 생산은 용존산소를 20%로 조절 한 유가식 배양에서 가능하였으며, 용존산소를 조절하지 않은 회분식 배양의 미생물유래 transglutaminase 생산에 비교해 서 L3배 증가하였다. 최대 건조균체량과 미생물유래 transglutaminase 생산은 각각 13.
- 원하는 용존산소 농도 값이 20%보다 증가하면 교반속도도 높게 증가되는 현 상을 보여주었다. 용존산소 농도 20% 유지에는 305 rpm, 용 존산소 농도 50% 유지에는 452 rpm까지 급격하게 증가됨을 알 수 있었다. 지정된 용존산소 농도 유지를 위해 용존산소 농도 자동 조절 시스템이 정확하게 작동됨을 확인할 수 있었 다 .
- 발효 초기 100%를 유지하던 용존산소 농도는 발효가 진행되면서 미생물의 성장으로 인하여 감소하였으며, 배양시작 10시간 후부터 바닥상태를 나타냈다. 용존산소 농도가 바닥상태에 도달한 후 용존산소 농도 10% 유지를 위해 원하는 값을 컴 퓨터에 입력하자, 통기속도가 증가하기 시작하여 최대 2.1 L/min까지 증가되었고 교반속도는 최소값인 260 rpm으로 일 정하게 유지되었다. 즉 용존산소 농도 10% 유지는 교반속도 의 변화 없이 통기속도만으로 가능하였다.
- 2 g/L로 최대를 나타 냈다. 용존산소 농도를 20%로 조절한 회분배양 보다 효소생 산이 약 1.2배 향상되었다. 발효 중 용존산소 농도 유지를 위해 조절된 통기속도와 교반속도의 변화를 Fig.
- 339 L/min, 교반속도는 260-360 rpm으로 각각 범위를 설정하였다. 용존산소 농도를 조절한 다양한 회분식 배양에서 용존산소가 20%일 때 최대 미생물유래 transglutaminase 생산이 가능하였다. 회분배양에서 용존산소 농도를 20%로 조 절한 경우 미생물유래 transglutaminase 생산은 2.
- 그러나 통기속도만으로는 용존산소 농도 20%에 도달할 수 없었으며, 교반속도가 최소값인 266 rpm에서 서서히 증가하여 일정하게 유지되었다. 원하는 용존산소 농도 값이 20%보다 증가하면 교반속도도 높게 증가되는 현 상을 보여주었다. 용존산소 농도 20% 유지에는 305 rpm, 용 존산소 농도 50% 유지에는 452 rpm까지 급격하게 증가됨을 알 수 있었다.
- 용존산소 농도 20% 유지에는 305 rpm, 용 존산소 농도 50% 유지에는 452 rpm까지 급격하게 증가됨을 알 수 있었다. 지정된 용존산소 농도 유지를 위해 용존산소 농도 자동 조절 시스템이 정확하게 작동됨을 확인할 수 있었 다 .
- 역시 가장 높은 미생물유래 transglutaminase 생산은 용존산소를 20%로 조절 한 유가식 배양에서 가능하였으며, 용존산소를 조절하지 않은 회분식 배양의 미생물유래 transglutaminase 생산에 비교해 서 L3배 증가하였다. 최대 건조균체량과 미생물유래 transglutaminase 생산은 각각 13.2 g/L와 2.6 U/mL이었다, 용 존산소를 20%로 용존산소 농도 자동 조절 시스템에 의해 조 절한 유가식 배양은 미생물유래 transglutaminase 생산에 적절 하였으며 다른 미생물 배양에도 적용할 수 있을 것으로 판단된다.
- 발효가 시작되면서 미생물들은 대수적으로 증 가하여 용존산소 농도는 감소되었고 발효시작 2시간 후부터 지정된 용존산소 농도(20% DO)로 조절되기 시작하였다. 통 기속도는 지정된 농도로 조절되는 시기에 모두 최대값인 3.9 L/min까지 증가하였고, 원하는 용존산소 농도 값이 높으면 최대 교반속도는 증가하는 경향을 보였다(Table 2). 산소소비 속도(OUR)가 감소하기 시작한 96시간 이후에는 통기속도와 교반속도는 최소값인 0.
- 용존산소 농도를 조절한 다양한 회분식 배양에서 용존산소가 20%일 때 최대 미생물유래 transglutaminase 생산이 가능하였다. 회분배양에서 용존산소 농도를 20%로 조 절한 경우 미생물유래 transglutaminase 생산은 2.12 U/mL이 었고, 용존산소를 조절하지 않은 회분식 배양의 미생물유래 trans이utaminase 생산보다 1.1 배 향상되었다. 역시 가장 높은 미생물유래 transglutaminase 생산은 용존산소를 20%로 조절 한 유가식 배양에서 가능하였으며, 용존산소를 조절하지 않은 회분식 배양의 미생물유래 transglutaminase 생산에 비교해 서 L3배 증가하였다.
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