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문제 정의
- (2001)이 미꾸라지 p-actin promoter와 성장호르몬 유전자를 융합한 미꾸라지 유래의 유전자를 미세주입법에 의하여 형질전환 시킴으로써 성장촉진 효과와 다음 세대로의 안정적인 전달을 보고한 바 있다. 이 연구는 붉바리 유래의 성장호르몬 유전자와 그 산물인 성 장호르몬을 이용하여 속 성장 및 초기 감모 현상이 일어나는 위험시기의 성장 기간을 단축시키려는 연구의 기초실험으로 성장호르몬의 cDNA를 cloning하고 E. ”〃에서의 발현을 유도하였다. 그러나 아직까지 붉바리의 종묘생산이 안정적으로 이루어지지 않아 붉바리를 대상으로 성장호르몬과 그 유전자의 이용은 어려운 실정이지만 현재 아시아의 여러 국가에서 붉바리의 종묘 생산에 대한 연구가 진행되고 있으며, 같은 속에 속하는 능성 어류의 종묘생산에 관한 연구도 활발히 진행되고 있다.
제안 방법
- 상등액을 제 거 한 cell pellet에 50 卩1의 ddHQ와 50 卩1의 Laemmli sample buffer를 첨가하여 잘 부유시켰다. 부유 된 cell을 95。(2에서 10분 동안 단백질 변성시킨 후 12%의 resolving gel과 4%의 stacking gel의 SDS-PAGE를 이용하여 단백질 분석을 수행하였다. Resolving gel은 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 6시간 염색한 후 하루 동안 탈색 시켜 확인하였다.
- 증폭된 3'과 DNAHigh Pure PCR Product Purification Kit (Roche Molecular Biochemicals)을 이용하여 정제하였다. 3'과 DNA염기서 열을 밝히기 위하여 Hindi로 절단된 pBluescript SK(-) vector에 T4 DNA ligase(Takara)를 이용하여 삽입하였다.
- GenBank에 등록된 이미 밝혀진 진골 어류의 성장호르몬 cDNA의 염기서열을 이용하여 붉바리로부터 성장호르몬을 암호화하 코 있는 Open reading frame(ORF)을 포함한 5' untranslated region(UTR)과 3' UTR을 증폭할 수 있도록 상동성이 가장 높은 부분(3, 말단에 가까운 한 부분)의 염기서열을 3과 5' partial cDNA clone을 증폭하는 primerS. 사용하였으며, 이 primer의 염기서열을 Fig.
- ot competent cell에 형질전환 시킨 다음 100卩g/ml의 ampicillin, 80 pg/ml의 X-gal, 1 mM의 IPTG를 함유한 LB plate에 도말하였다. LB plate 상의 white colonyi 1.5 ml LB-ampicillin(100 jig/ml) 액체배지에 overnight 배양한 후에, High Pure Plasmid Isolation Kit(Roche Molecular Biochemicals)을 이용하여 plasmid DNA를 분리하였다.
- 그리고 5' partial region을 증폭하기 위하여 single strand cDNA의 3' 말단에 terminal deoxynucleotidyl transferase(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 poly(G) tail을 인위적으로 붙였다. Terminal deoxynucleotidyl transferase에의 흐HH 생성된 poly(G) tail과 상보적인 dC(18 nt) primer^]- Eaka-Rl primer를 이용하여 5' cDNA 단편을 증폭하였다. 5' cDNA 단편의 증폭을 위한 PCR 조건은 3' cDNA 단편의 증폭을 위한 반응 조건과 동일하게 하였다.
- 정제된 mRNA를 주형으로 하여 1 st-strand cDNA Synthesis Kit (Clontech)를 이용하여 single strand cDNA를 합성하였다. cDNA를 주형으로 사용하고 poly(A) tail과 상보적인 dT(20 nt) primer 와 Eaka-Fl primer, Pfu DNA polymerase(Stratagene)를 사용하여 붉바리 성장호르몬 cDNA의 3' 일부분을 증폭하였다. 3' cDNA 단편의 증폭을 위한 PCR 조건은 94。(2에서 2분간 denaturation 과정을 거친 후에, 94。(2에서 1분 동안의 denaturation, 5CTC에서 1분 동안의 annealing, 72。6에서 4。초 동안의 extension 반응을 30주기 수행한 후에, 마지막 주기에서 5분 동안 extension 반응을 시켰다.
- co〃에서의 붉바리 성장호르몬 cDNA의 발현실험은 signal peptide를 포함한 성장호르몬 전체 p* eptide 암호화하고 있는 부위(615 bp; 204 aa)와 mature peptide만을 암호화하고 있는 부위(564 bp; 187 aa)에 대하여 수행되었다. 각각의 polypeptide# 암호화하고 있는 염기서열 부위를 Ndel과 BamHI 제한부위가 삽입되도록 특이적으로 디자인된 primer들을 이용하여 각각 PCR 증폭한 후에, 그 PCR 산물들을 pET-1 la vector(Novagen)의 N** d BamHI site에 T4 DNA ligase(Takara)를 이용하여 ligation 한 후 DH5a에 형질전환 시켰다. 형질전환체는 ampicillin(100|ig/ml)을 포함한 LB plate에서 선별하였다.
- 형질전환체는 ampicillin(100|ig/ml)을 포함한 LB plate에서 선별하였다. 선별된 colony로부터 plasmid DNA를 분리한 후, Nd。과 BamHI으로 절단하여 삽입된 붉바리의 GH 유전자를 확인하였다.
- 그리고 5' partial region을 증폭하기 위하여 single strand cDNA의 3' 말단에 terminal deoxynucleotidyl transferase(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 poly(G) tail을 인위적으로 붙였다. Terminal deoxynucleotidyl transferase에의 흐HH 생성된 poly(G) tail과 상보적인 dC(18 nt) primer^]- Eaka-Rl primer를 이용하여 5' cDNA 단편을 증폭하였다.
- 본 연구를 통하여 붉바리의 뇌하수체로부터 mRNA를 분리. 정제하여 성장호르몬을 암호화하고 있는 것으로 추정되는 완전한 cDNA를 cloning하고 그 염기 서열이 규명되었다.
- 붉바리 (E. a如ara)의 뇌하수체에서 추출한 mRNA로부터 RACE 방법으로 cDNA를 cloning하고 염기서열을 분석하였다. 붉바리의 성장호르몬 cDNA는 5' UTR, open reading frame, 3' UTR이 각각 21 bp, 615 bp, 247 bp인 전체 883 bp로 구성되어있다.
- 붉바리 성장호르몬 coding region의 아미노산 조성으로부터 추정된 signal peptide와 mature peptide를 포함한 전구체 호르몬과 mature peptide만을 포함한 성숙한 성장호르몬의 분자량은 Compute pI/Mw tool을 사용하여 계산하였으며, 각각 약 23.1 kDa과 21.3 kDa이 었다(http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html). SDS-R4GE 분석 결과 E.
- 붉바리와 같이 성장이 느리고 경제적으로 중요한 어종은 성 장호르몬과 같은 성장촉진 인자의 처리에 좋은 대상 종이 되므로, 우리는 이 연구에서 양 기술개발이 이루어진 후에 그 공급과 수요가 증대될 것으로 예상되는 붉바리로부터 성장호르몬을 암호화하고 있는 cDNA를 cloning 하여 그 염기서열을 밝히고 아미노산 서열을 추정하였으며, E. coli 발현 시스템을 이용하여 그 단백질 산물에 대한 SDS-PAGE 분석을 수행하였다.
- 붉바리의 뇌하수체 조직 0.1 g으로부터 Micro FastTrack™ Kit(Invitrogen)을 이용하여 mRNA를 주줄 하여 정제하였다. 정제된 mRNA를 주형으로 하여 1 st-strand cDNA Synthesis Kit (Clontech)를 이용하여 single strand cDNA를 합성하였다.
- 1에 밑줄로 나타내었다. 이 primer들은 각각 3'과artial cDNA clone들의 증폭을 위한 특이적인 primer (Eaka-Fl, S-GACATGCACAAGGTGGAGAC-3; Eaka-Rl, 5'- GTCTCCACCTTGTGCATGTC-3)들로서 (주)바이오니아에의 뢰하여 합성하였다.
- 이미 실험을 통하여 확인된 3'과artial region의 염기서 열에 근거하여 제작된 한 쌍의 primer(Eaka-N, 5'-GAGACATATGGA- CCGAGTCGTCCTCCT3'; Eaka-C, S-TCTCGGATCCCTACA- GGGACAGTTGGCCT-3, )를 이용하여 완전한 cDNA clone을 first strand cDNA로부터 증폭하였다. E.
- 1 g으로부터 Micro FastTrack™ Kit(Invitrogen)을 이용하여 mRNA를 주줄 하여 정제하였다. 정제된 mRNA를 주형으로 하여 1 st-strand cDNA Synthesis Kit (Clontech)를 이용하여 single strand cDNA를 합성하였다. cDNA를 주형으로 사용하고 poly(A) tail과 상보적인 dT(20 nt) primer 와 Eaka-Fl primer, Pfu DNA polymerase(Stratagene)를 사용하여 붉바리 성장호르몬 cDNA의 3' 일부분을 증폭하였다.
- 본 연구를 통하여 붉바리의 뇌하수체로부터 mRNA를 분리. 정제하여 성장호르몬을 암호화하고 있는 것으로 추정되는 완전한 cDNA를 cloning하고 그 염기 서열이 규명되었다. 같은 우레기 속에 속하는 GenBank에 등록된 orange-spotted grouper (E.
- 증폭된 DNA 단편은 1% agarose gel에 전기 영동 하여 각 cDNA 단편의 크기를 확인하였다. 증폭된 3'과 DNAHigh Pure PCR Product Purification Kit (Roche Molecular Biochemicals)을 이용하여 정제하였다. 3'과 DNA염기서 열을 밝히기 위하여 Hindi로 절단된 pBluescript SK(-) vector에 T4 DNA ligase(Takara)를 이용하여 삽입하였다.
- 5' cDNA 단편의 증폭을 위한 PCR 조건은 3' cDNA 단편의 증폭을 위한 반응 조건과 동일하게 하였다. 증폭된 DNA 단편은 1% agarose gel에 전기 영동 하여 각 cDNA 단편의 크기를 확인하였다. 증폭된 3'과 DNAHigh Pure PCR Product Purification Kit (Roche Molecular Biochemicals)을 이용하여 정제하였다.
- 추출된 plasmid DNA를 Thermo Sequenase Cy5.5 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 자동 염기서 열분석 장치인 SEQ 4X4 personal sequencing system(Amersham Pharmacia Biotech)虎로 염기서열을 확인하였다. 결정된 염기서열은 Clustal W(Thompson et al.
대상 데이터
- 어시장에서 채집한 살아있는 제주산 붉바리 (E. akagra)를 마취 시켜 신선한 상태로 뇌하수체를 적출하였다. 분리한 뇌하수 체는 액체질소로 급속 동결하고, 사용할 때까지 -8CTC에 보관하였다.
- 각각의 polypeptide# 암호화하고 있는 염기서열 부위를 Ndel과 BamHI 제한부위가 삽입되도록 특이적으로 디자인된 primer들을 이용하여 각각 PCR 증폭한 후에, 그 PCR 산물들을 pET-1 la vector(Novagen)의 N** d BamHI site에 T4 DNA ligase(Takara)를 이용하여 ligation 한 후 DH5a에 형질전환 시켰다. 형질전환체는 ampicillin(100|ig/ml)을 포함한 LB plate에서 선별하였다. 선별된 colony로부터 plasmid DNA를 분리한 후, Nd。과 BamHI으로 절단하여 삽입된 붉바리의 GH 유전자를 확인하였다.
이론/모형
- 5 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 자동 염기서 열분석 장치인 SEQ 4X4 personal sequencing system(Amersham Pharmacia Biotech)虎로 염기서열을 확인하였다. 결정된 염기서열은 Clustal W(Thompson et al., 1994)를 이용하여 이미 밝혀진 다른 어류의 성장호르몬 cDNA 자료와 그 상동성을 조사하였고, 아미노산 서열을 추정하였다.
성능/효과
- html). SDS-R4GE 분석 결과 E. co〃에서 발현된 성장호르몬 산물은 추정된 단백질의 분자량과 일치하는 것으로 밝혀졌다(Fig. 3).
- 정제하여 성장호르몬을 암호화하고 있는 것으로 추정되는 완전한 cDNA를 cloning하고 그 염기 서열이 규명되었다. 같은 우레기 속에 속하는 GenBank에 등록된 orange-spotted grouper (E. coioides)의 성장호르몬 ORF 염기서열과 아미노산 서열을 이 연구를 통하여 밝혀진 붉바리의 성장호르몬 ORF 염기서열과 아미노산 서열과 비교한 결과, 각각 96.9%와 98.5%로서 매우 높은 상동성을 보였다(Table 1).
- 붉바리 성장호르몬 coding region의 염기서열을 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록된 다른 농어목 어류와 비교해 본 결과 orange-spotted grouper, gilthead seabream, yellowfin seabream, barramundi perch, yellow tail, croceine croaker, yellow perch, European sea bass, tilapia, Mozambique tilapia와 three spot gourami에 대하여 각각 96.9%, 88.6%, 88.0%, 86.7%, 85.7%, 85.5%, 85.0%, 84.6%, 83.4%, 82.4%와 80.8%의 높은 유사성을 보였고, 추정된 아미노산 서열은 각각 98.5%, 96.1%, 95.1%, 95.1%, 88.7%, 90.7%, 92.6%, 90.7%, 89.7%, 88.7%와 87.7%의 높은 상동성을 보였다(Table 1). 한편, 사람(GenBank accession number, AAA98618)과 소(GenBank accession number, AAA30543) 의 성장호르몬 아미노산 서열과 비교한 결과는 각각 33.
- 이 호르몬은 단백질의 3차 구조에 중요한 이황화 결합을 할 수 있는 4개의 cysteine 잔기와 1개의 N-glycosylation site를 가지고 있었다. 붉바리 성장호르몬의 염기서열은 농어목에 속하는 다른 어류의 성장호르몬 염기서열과의 유사도가 높게 나타났으며 orange-spotted grouper, gilthead seabream과 각각 96.9%, 88.6%의 상동성을 보였다.
- Adenylation signal로 작용하는 sequence인 AATAAA 는 poly(A)로부터 20 bp upstream에 위치하는 것을 확인하였다. 염기서 열을 바탕으로 추정한 성장호르몬은 204개의 아미노산으로 구성된 단백질로서 signal peptide(17 aa)와 mature protein(187 aa)을 포함하고 있으며 mature protein의 분자량은 21.3 kDa으로 나타났다. 이 호르몬은 단백질의 3차 구조에 중요한 이황화 결합을 할 수 있는 4개의 cysteine 잔기와 1개의 N-glycosylation site를 가지고 있었다.
- 염기서열에 근거하여 추정된 붉바리의 성장호르몬을 암호화 하고 있는 coding region은 전체 615 base들로서, 22-24번째 위치에 있는 번역 개시코 돈인 ATG로 시작되어 634-636번째 위치에 있는 번역 종결코돈인 TAG로 종결되며, 17 aa의 signal peptide 서열과 187 aa의 matured peptide 서열을 포함한 204개의 아미노산을 암호화하고 있는 것으로 추정되었다. 또한, 단백질의 C 말단 쪽의 201-203번째 위치에 추정상의 N잉ycosylation site(Asn-Xaa-Thr/Ser)가 존재하는 것으로 추정되었다.
후속연구
- 그러나 아직까지 붉바리의 종묘생산이 안정적으로 이루어지지 않아 붉바리를 대상으로 성장호르몬과 그 유전자의 이용은 어려운 실정이지만 현재 아시아의 여러 국가에서 붉바리의 종묘 생산에 대한 연구가 진행되고 있으며, 같은 속에 속하는 능성 어류의 종묘생산에 관한 연구도 활발히 진행되고 있다. 따라서, 멀지 않은 장래에 붉바리의 종묘생산이 안정적으로 이루어지게 된다면 이 연구의 결과를 유용하게 이용할 수 있으리라고 여겨진다.
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