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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 천연의 풍부한 생리활성을 지닌 IGFs를 다양한 기능성 유제품에 적용하기 전에 먼저 수행되어야 할 단계로서 현재 시중에 판매 중인 상업용 IGFs 및 초유로부터 분리. 정제된 IGFs의 안전성을 평가하여 새로운 기능성 소재로서의 IGFs의 가능성을 검토해 보고자 하였다.
- 분리. 정제된 IGFs의 안전성을 평가하여 새로운 기능성 소재로서의 IGFs의 가능성을 검토해 보고자 하였다.
- 분리. 정제된 IGFs의 안전성을 평가하여 새로운 기능성 소재로서의 IGFs의 가능성을 검토해 보고자 하였다.
제안 방법
- R&D Systems社의 Recombinant Human IGF- I (250 μg)을 시험물질로 하여 생리식염수 4 ml을 용매로 하여 시험당일 투여 전에 조제하여 사용하였고 대조군은 vehicle인 0.9% 생리식염수를 투여하였다. 투여 경로는 정맥투여로 실험동물의 꼬리정맥에 주사하여 투여하였다.
- ② Automatic tissue processor(Shandon, England)를 이용하여 탈수, 투명, 침투 과정을 진행하고 paraplast로 포매한 다음 회전형 박절기(Microm, Germany)# 사용하여 4 um 두께의 파라핀 절편을 제작하였다.
- ⑤ 염색이 끝난 모든 절편은 탈수, 투명 과정을 거쳐 카나다발삼으로 봉입하여 광학현미경 (Olymphus BX50, Japan)으로 관찰하였다.
- 9 % 생리식 염수를 용매로 하여 시험 개시 당일 투여 전에 조제한 후 분주하여 사용하였고 deep freezer(-40℃)에 보관하면서 14일 동안 일 1회 투여하였다. 대조군은 vehicle인 0.9 % 생리식염수를 투여하였으며(USFDA, 1993) 투여 경로는 경구투여로 강제투여보조장치를 사용하여 투여하였다.
- 모든 실험동물군에 대한 일반 증상, 독성 증상, 회복 증상 및 사망 발현의 유무를 투여 당일에는 투여 후 2시간마다 관찰하였으며 투여익 일부터 1주일 동안은 1일 2회씩 관찰하였고 투여 1주일 이후부터 20일째까지는 1일 1회씩 관찰하였다. 시험동물의 체중은 투여당 일부터 매 4일에 1회씩 과 시험종료 직후에 측정하였고 사료 및 물 섭취 량은 투여익 일부터 시험종료일까지 매일 측정하였다.
- 모든 실험동물군에 대한 일반 증상, 독성 증상, 회복증상 및 사망발현의 유무를 투여 개시일에는 투여 후 2시간마다, 투여개시 익일부터는 1일 2회씩 관찰하였다 (JMHW, 1996) 시험동물의 체중은 투여개 시일, 부검 일 그리고 투여개 시 익일부터 매 2일에 1회씩 측정하였고 사료 및 물 섭취 량은 투여개시일부터 매일 측정하였다.
- 생후 4주된 Sprague-Dawley계(8) 흰쥐(rat)를 1주일 동안 고형사료로 적응시킨 뒤 순화 기간 중 건강하다고 판정된 동물 중에서 약 160 g의 체중을 지닌 12마리를 선별하여 무작위법을 이용 각 3마리씩 4군으로 나누어 Table 2와 같이 각실험군 별로 농도를 달리한 시험물질 용액을 개체당 1일 1회 1 mL씩 14일간 반복투여하였다 (KFDA, 1998).
- 생후 4주된 Sprague-Dawley계(♂) 흰쥐(rat)를 1주일 동안 고형사료로 적응시킨 뒤 순화 기간 중 건강하다고 판정된 동물 중에서 체중 155 g으로 측정된 12마리를 선별하여 무작위 법으로(IPCS & JECFA, 1984) 각 3마리씩 4군으로 나누어어 62.5 μg/ml 농도의 시험물질을 각 실험군별로 용량을 달리하여 Table 1과 같이 투여하였다.
- 관찰하였다. 시험동물의 체중은 투여당 일부터 매 4일에 1회씩 과 시험종료 직후에 측정하였고 사료 및 물 섭취 량은 투여익 일부터 시험종료일까지 매일 측정하였다.
- 실험기간 종료 후 실험동물을 부검하여 표적 장기에 대한 육안검사를 실시하였고 간장, 신장, 비장을 적출하여 중량을 측정하였다.(OECD, 1993) 적출한 장기를 10 % formalin 15~ 20 mL로 채운 시험관에 넣어 보관하였다.
- 정제된 IGFs의안전성을 평가하여 새로운 기능성 소재로서의 IGFs의 가능성을 검토해 보고자 하였다. 이를 위하여 독성평가에서 기본적 으로 수행되고 있는 단회투여 독성시험과 반복투여 독성시험 을 실시하였다. 단 회투여 독성 시험에서 는 R&D Systems社 의 Recombinant Human IGF-1 을 시험물질로 하고 생후 4주 된 Sprague-Dawley계(♂) 흰쥐(rat)를 실험동물로 하여 개체당 0, 10, 20, 50 μg씩 투여하는 시험군을 설정한 후, 꼬리정꼬리정맥에 주사하여 20일간 관찰하면서 체중 변화, 식이 섭취 변화를 측정하고 최종적으로 부검하여 육안검사 및 간장, 신장, 비장에 대한 병리조직검사를 실시한 결과, 명확한 이상소견이 나타나지 않아 모든 시험군에서 급성 독성이 확인되지 않았다.
- 적출한 간장, 신장, 비장을 대상으로 단회투여독성시험에서와 동일한 방법으로 병리조직검사를 실시하여 표적 장기에 대한 독성 작용을 확인하였다.
- 초유로부터 분리. 정제된 IGF-I 을 0.9 % 생리식 염수를 용매로 하여 시험 개시 당일 투여 전에 조제한 후 분주하여 사용하였고 deep freezer(-40℃)에 보관하면서 14일 동안 일 1회 투여하였다. 대조군은 vehicle인 0.
- 최종투여 일 종료 후 충분한 관찰기간을 두고 임상증상을관찰한 후, 부검하여 육안검사를 실시하였고 간장, 신장, 비장을 적출하여 중량을 측정하였다. 적출한 장기는 10 % formalin 15-20 mL로 채운 시험관에 넣어 보관하였다.
- 9% 생리식염수를 투여하였다. 투여 경로는 정맥투여로 실험동물의 꼬리정맥에 주사하여 투여하였다.
대상 데이터
- 사료는 Damool Science社로부터 실험동물용 사료를 받아멸균음용수와 같이 자유로이 공급하였으며 사료 섭취량 및음용수섭취량을 매일 측정하였다 (Ono, 1984).
- 청정구역에서 생산된 SPF(특정병원체부재) SD계(♂) rat 를 Damool Science社로부터 받아온도 22+1℃, 습도 50+5%, 조도 300-500 Lux (형광등을 12시간 간격으로 점멸함)의사육환경에서 polycarbonate cage에 1마리씩 넣어 사육하였다. 사료는 Damool Science社로부터 실험동물용 사료를 받아멸균음용수와 같이 자유로이 공급하였으며 사료 섭취량 및음용수섭취량을 매일 측정하였다 (Ono, 1984).
성능/효과
- 일부 시험군에서 운동성 감소 등을 보이기도 하였으나 유의성을 보이지는 않았다. 결과적으로 임상증상에서 명확한 이상 증상의 관찰소견은 없었다. 주요 임상 증상을 관찰한 결과를 Table 11과 Table 12에 개체수로 나타내었다
- 보이는 관찰소견이 확인되지 않았다. 결론적으로 본 연구의 모든 투여 농도에서 반복투여독성시험을 비롯한 기본적인 독성평가에 있어 초유로부터 분리, 정제된 IGF-I 의 안전성에는 명확한 이상 소견이 없었다. 따라서 본 연구의 초유 IGF-1 은 안전성에서 기능성 식품의 원료로서 충분한 가능성이 확인되었다.
- 이를 위하여 독성평가에서 기본적 으로 수행되고 있는 단회투여 독성시험과 반복투여 독성시험 을 실시하였다. 단 회투여 독성 시험에서 는 R&D Systems社 의 Recombinant Human IGF-1 을 시험물질로 하고 생후 4주 된 Sprague-Dawley계(♂) 흰쥐(rat)를 실험동물로 하여 개체당 0, 10, 20, 50 μg씩 투여하는 시험군을 설정한 후, 꼬리정꼬리정맥에 주사하여 20일간 관찰하면서 체중 변화, 식이 섭취 변화를 측정하고 최종적으로 부검하여 육안검사 및 간장, 신장, 비장에 대한 병리조직검사를 실시한 결과, 명확한 이상소견이 나타나지 않아 모든 시험군에서 급성 독성이 확인되지 않았다. 반복투여 독성시험에서는 초유로부터 분리.
- 결론적으로 본 연구의 모든 투여 농도에서 반복투여독성시험을 비롯한 기본적인 독성평가에 있어 초유로부터 분리, 정제된 IGF-I 의 안전성에는 명확한 이상 소견이 없었다. 따라서 본 연구의 초유 IGF-1 은 안전성에서 기능성 식품의 원료로서 충분한 가능성이 확인되었다.
- 비장을 적출하여 세포조직의 절편을 탈수, 투명 과정을 거쳐 카나다발삼。루 봉입하고 광학현미경으로 관찰한 결과도 임상병리학적으로 이상을 보이는 관찰소견이 나타나지 않아 모든 시험군에서 급성 독성이 없는 것으로 확인되었다.
- 시험물질 투여기간 중 의 사료 및 물 섭취 량을 측정하고 그 결과 값을 ANOVA를 이용한 Duncan's Multiple Range Test를 95 %의 신뢰도(p<0.05)에서 통계처리한 결과, 반복적인 강제투여에 따른 일시적인 약간의 변화가 있었으나 전체 실험기간으로는 유의성을 보이는 명확한 이상 소견은 확인되지않았다. 통계처리 결과를 Table 13~18에 나타내었다.
- 시험물질 투여기간 중에 모든 실험동물의 체중 변화를 측정하였으나 대조군에 비해 모든 실험군에서 유의성 있는 이상 소견이 없었다.
- 시험물질의 투여 후 20일간 사망동물이 발생하지 않았으며 명확한 독성 증상의 발현이나 사망이 지연되는 경우도 나타나지 않았다. 일부 시험군에서 운동성 감소를 보이는 실험동물이 관찰되었으나 유의성을 보이는 관찰소견은 없었고 결과적으로 뚜렷한 이상 증상이 발견되지 않았다.
- 실험기간 동안의 사료 및 물 섭취량을 측정하고 그 결과 값을 ANOVA를 이용한 Duncan's Multiple Range Test를 95%의 신뢰도(p<0.05)에서 통계처리한 결과, 유의성을 보이는관찰소견은 확인되지 않았다. 통계처리 결과를 Table 5~ 10에 나타내었다.
- 않았다. 일부 시험군에서 운동성 감소를 보이는 실험동물이 관찰되었으나 유의성을 보이는 관찰소견은 없었고 결과적으로 뚜렷한 이상 증상이 발견되지 않았다. 주요 이상 증상을 관찰한 결과를 Table 3과 Table 4에 개체수로 나타내었다.
- 반복투여 독성시험에서는 초유로부터 분리. 정제된 IGF-1 을 시험물질로 하고 생후 4주된 Sprague-Dawley 계(♂) 흰쥐(rat)를 실험동물로 하여 개체당 0, 5, 10, 15 μg씩투여하는 시험군을 설정한 후, 14일간 반복적으로 강제경구투여 하면서 임상증상을 관찰하면서 체중 변화, 식이섭취 변화를 측정하였고 최종적으로 부검하여 육안검사 및 간장, 신장, 비장에 대한병리조직검사를 실시한 결과, 명확한 이상소견이 나타나지 않아 모든 투여 농도에서 반복투여 독성 시험을 비롯한 기본적인 독성평가에 있어서 초유 내 IGF-I 의 안전성에는 명확한 이상 소견이 없는 것으로 판단되었다.
- 투여 개시 일부터 부검일까지 사망동물이 발생하지 않았으며 명확한 독성 증상의 발현이나 사망이 지연되는 경우도 나타나지 않았다. 일부 시험군에서 운동성 감소 등을 보이기도 하였으나 유의성을 보이지는 않았다.
- 투여 기간 종료 후, 단회투여 독성시험과 동일한 방법으로육안검사를 실시하고 신장, 간장, 비장을 적출하여 병 리조직검사를 실시한 결과 모든 시험군에서 임상병리학적으로 이상을 보이는 관찰소견이 확인되지 않았다. 결론적으로 본 연구의 모든 투여 농도에서 반복투여독성시험을 비롯한 기본적인 독성평가에 있어 초유로부터 분리, 정제된 IGF-I 의 안전성에는 명확한 이상 소견이 없었다.
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