초록 ▼

분리․정제○ 연구결과
1) 젖소 초유 내에 존재하는 성장호르몬인 IGF-I을 분리∙정제한 후 cell line 및 마우스의 생체내에서 미치는 면역활성에 미치는 영향을 실험하였다. 젖소 초유로부터 IGF-I의 분리 및 정제는 ion exchange chromatography와 gel filtration chromatography, affinity chromatography 및 ultrafiltraion 거쳐 IGF-I을 분리∙정제 하였으며, 이를 SDS-PAGE와 western blotting을 실시하여 확인하였다. 초유 IGF

분리․정제○ 연구결과
1) 젖소 초유 내에 존재하는 성장호르몬인 IGF-I을 분리∙정제한 후 cell line 및 마우스의 생체내에서 미치는 면역활성에 미치는 영향을 실험하였다. 젖소 초유로부터 IGF-I의 분리 및 정제는 ion exchange chromatography와 gel filtration chromatography, affinity chromatography 및 ultrafiltraion 거쳐 IGF-I을 분리∙정제 하였으며, 이를 SDS-PAGE와 western blotting을 실시하여 확인하였다. 초유 IGF-I의 함량은 약 540㎍/L 으로 측정되었고, 이를 분리 정제 한 결과 약 12㎍의 IGF-I을 회수하였다. IGF-I이 cell line 면역활성에 미치는 영향을 살펴본 결과, IGF-I의 세포증식에 미치는 영향은 EL4 cell에서 약 55%로서 높은 성장율을 나타냈으며, 암세포 성장 저해율은 A427 cell에서 약 35%로 가장 높게 나타났다. IGF-I이 RAW 264.7 cell을 자극하여 TNF-α와 IL-6의 생성을 증가시켰다. IGF-I이 murine machrophge의 면역활성에 미치는 영향을 실험한 결과, IL-6, NO, TNF-α 분비를 유도와 탐식작용을 증가시키는 것으로 확인하였다. IGF-I이 murine splenocyte의 면역활성에 미치는 영향을 살펴본 결과 B cell, T cell 증식효과를 보였고, NK cell의 활성을 증가시켰다. N-terminal 서열과 아미노산 조성 분석의 결과로 초유와 형질전환 누에에서 분리된 IGF-I이 표준 IGF-I과 동일한 물질임을 알 수 있었다. 형질 전환 누에와 초유에서 분리한 IGF-I의 세포증식에 미치는 영향을 비교하였을 때, 정상세포증식에는 상대적으로 초유 중의 IGF-I의 증식률이 높았다.
하지만 항암효과에 있어서는 HeLa와 SNU-C1 에서는 형질전환 누에에서 분리된 IGF-I의 효과가 훨씬 더 높았다.
2) 여러 가지 유용물질의 대량생산을 위하여 그동안 대장균에서 많은 연구가 이루어졌다. 그러나 대장균에서의 유용물질 생산은 고등생물에서 필요로 하는 특징을 대체하지 못하는 단점이 있어 이를 보완할 수 있는 생물을 찾게 되었다. 누에는 이러한 단점을 보완할 수 있는 고등생물로서의 특징을 가지고 있어 post-translational modification을 하고, 특히 누에의 견 단백질인 피브로인은 5령기 유충의 후부 견사선에서 아주 강력한 발현을 하여 전체 체중의 약 20% 이상이나 되는 피브로인 단백질을 생산한다. 그러므로, 누에에서의 유용물질을 생산하는 것이 그 기대효과가 크다고 할 수 있다. 본 연구에서는, 앞서 연구된 미세주사법을 이용한 형질전환 누에를 바탕으로 P 벡터계를 이용하여 피브로인 유전자를 프로모터로 한 IGF-Ⅰ유전자를 삽입한 발현벡터를 만들었다(p[FPIGF-Ⅰ]). 발현벡터는 전이효소와 함께 전낭배기난에 미세주사하여 형질전환 누에를 만들었다. 미세주사한 4,605개의 난중에 70개가 1령 단계로 되었고, PCR로 형질전환체를 선별하였고, 전이율은 13%였다. F2는 PCR 산물을 염기서열 결정하여 외부유전자(IGF-Ⅰ)가 존재함을 확인하였다. PCR로 선별된 형질전환체의 무게와 크기가 정상적인 번데기에 비하여 약 20%정도 더 큰 것으로 확인하였다. 또한 F1, F2에서도 같은 양상을 보임을 확인하였다. 이러한 결과로 발현벡터가 생식세포에 의해 유전되고 있음을 알 수 있었다. 그리고 형질전환된 누에의 고치로부터 1,300ng/g의 IGF-I이 포함되어 있는 것을 확인하였다.
3) In vivo 상에서 IGF-I의 생리활성 검증 및 실용화 기술개발에 관한 연구를 진행하였다. IGF-I 분획물의 마우스 비장세포의 증식효과는 whole whey에 비해서 2배 이상의 세포증식효과를 나타내었으며 투여량의 높을수록 면역증강효과가 높은 것으로 나타났다. IGF-I 분획물은 methotrexate투여쥐의 장관 및 점막 부작용을 감소시켰다. IGF-I 분획물의 투여방법중 근육내 주사보다 복강내 주사가 methotrexate 투여쥐의 장관기능을 더 증진시켰다. IGF-I 분획물은 STZ 유발 당뇨쥐의 내당능과 지질대사를 다소 개선시키는 경향을 보였다. 형질전환 IGF-I 누에는 STZ 유발 당뇨쥐의 공복혈당을 감소시켰으며 혈중 인슐린 농도를 다소 증가시켰다.

Abstract ▼

Ⅲ. In vivo study on biological activity of IGF-I and development its practical use.
The results are as follows; IGF-I enriched whey fraction enhances splenocyte proliferation in comparison with whole IGF-I. Immune enhancing properties of IGF-I enriched whey fraction is dose dependant manner. IGF-

Ⅲ. In vivo study on biological activity of IGF-I and development its practical use.
The results are as follows; IGF-I enriched whey fraction enhances splenocyte proliferation in comparison with whole IGF-I. Immune enhancing properties of IGF-I enriched whey fraction is dose dependant manner. IGF-I enriched whey fraction reduces gastrointestinal and mucosal adverse effects in methotrexate treated rat. Intraperitoneal injection of IGF-I enriched whey fraction reduces gastrointestinal and mucosal adverse effects in methotrexate treated rat in contrast with intramuscular injection. IGF-I enriched whey fraction makes impaired glucose tolerance and lipid metabolism better in STZ induced diabetic rat. Transgenic IGF-I enriched silkworm decrease fasting blood glucose concentration and increase insulin concentration a little bit in STZ induced diabetic rat. But In normal rat, insulin concentration pick up considerably.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY ... 8
• CONTENTS ... 10
• 목차 ... 13
• 제 1 장 연구개발 과제의 개요 ... 16
• 제 1절 연구 개발의 목적 및 필요성 ... 16
• 1. 기술적 측면 ... 16
• 2. 경제 산업적 측면 ... 17
• 3. 사회 문화적 측면 ... 18
• 제 2절 연구개발의 내용 및 범위 ... 19
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 22
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 24
• 제 1절 IGF-I의 생리화학적 특성 검증(제1세부과제) ... 24
• 1. 연구개발 내용 ... 24
• 가. 초유 중의 생리활성 인자의 검색 및 IGF-I의 분리 ... 24
• 나. IGF-I의 면역세포 증식효과 및 cytokines분비능력 검증 ... 25
• 다. IGF-I의 항암효과 검증 ... 26
• 라. IGF-I이 murine macrophage와 murine splenocyte의 면역활성에 미치는 영향 ... 28
• 마. 초유 IGF-I와 형질전환 IGF-I의 구조적 유의성 검증 ... 30
• 바. 형질전환 IGF-I와 초유중의 IGF-I의 생리적 기능 비교 검토 ... 31
• 2. 연구개발 수행 결과 ... 32
• 가. IGF-I의 분리 및 정제 ... 32
• 나. IGF-I의 면역세포 증식효과 및 cytokines분비능력 측정 ... 39
• 다. IGF-I의 항암효과 측정 ... 47
• 라. IGF-I이 murine macrophage와 murine splenocyte의 면역활성에 미치는 영향 ... 51
• 마. 초유 IGF-I과 형질전환 IGF-I의 구조적 유의성 검증 ... 63
• 바. 형질전환 IGF-I과 초유 IGF-I의 생리적 기능 비교 ... 65
• 제 2절 IGF-I의 형질전환 누에의 작성(제 2세부과제) ... 73
• 1. 서론 ... 73
• 가. 누에의 생태와 피브로인 ... 73
• 나. 형질전환 동물 ... 75
• 다. 전이인자를 이용한 형질전환 벡터 ... 76
• 2. 연구개발 내용 ... 77
• 가. IGF-I gene 발현벡터 개발 ... 77
• 나. IGF-I 형질전환 누에 작성 ... 78
• 다. IGF-I 유전자가 형질전환 된 개체 선별 ... 79
• 라. 형질전환 누에에서 발현된 IGF-I의 분리 정제 방법 확립 ... 80
• 3. 연구개발 수행 결과 ... 81
• 가. IGF-I gene screening 및 발현벡터 개발 ... 81
• 나. IGF-I 형질전환 누에 작성 ... 83
• 다. IGF-I 유전자가 형질전환 된 개체 선별 ... 83
• 라. Fibroin promoter 분석 ... 88
• 마. 형질전환 누에에서 발현된 IGF-I의 분리 정제 방법 확립 ... 92
• 바. IGF-I 형질전환 누에 대량생산 ... 94
• 제 3절 In vivo 에서의 IGF-I의 생리활성 검증 및 실용화 기술개발(제 3세부과제) ... 95
• 1. 연구개발 내용 ... 95
• 가. IGF-I enriched whey fraction의 primary cell 증식효과 검증 ... 95
• 나. IGF-I enriched whey fraction의 장관기능 증진에 미치는 효과 검증 ... 95
• 다. 투여방법에 따른 IGF-I의 활성변화 ... 97
• 라. 인슐린 의존성 당뇨병에 미치는 효과 검증 ... 99
• 마. 형질전환 IGF-I의 실용화 기술 개발 ... 100
• 2. 연구개발 수행 결과 ... 102
• 가. IGF-I enriched whey fraction의 primary cell 증식효과 검증 ... 102
• 나. IGF-I enriched whey fraction의 장관기능 증진에 미치는 효과 검증 ... 104
• 다. 투여방법에 따른 IGF-I의 활성변화 ... 106
• 라. 인슐린 의존성 당뇨병에 미치는 효과 검증 ... 113
• 마. 형질전환 IGF-I의 실용화 기술 개발 ... 116
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 123
• 제 1절 목표 달성도 ... 123
• 제 2절 관련분야에의 기여도 ... 124
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 125
• 제 1절 활용계획 ... 125
• 제 2절 추가 연구의 필요성 ... 125
• 제 3절 타 연구의 응용성 ... 125
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 126
• 제 7 장 참고문헌 ... 127
• 끝페이지 ... 130