임신이나 배란진단과 같이 가정에서 직접 사용할 수 있는 형태의 membrane strip 크로마토그래피 방법을 이용하여 식중독 균 DNA 분석시스템을 개발하였다. 분석물질로서는 빈번하게 발생하고 있는 식중독 미생물 중에서 S. typhimurium을 선택하였으며, Salmonella 종에 특이한 유전자 부위인 invA 유전자 분석을 목표로 하였다. 우선 이 유전자는 본 실험실 내에서 설계한 primer 쌍을 사용한 PCR 공정을 통하여 증폭되었다. 이렇게 증폭한 산물을 본 연구자들이 설계한 DNA probe와의 hybridization을 통하여 분석함으로써 전통적으로 사용하고 있는 전기영동분석법의 단순히 분자크기에 의한 분리법과 비교하여 특이한 분석을 할 수 있었다. 이때 PCR 후 과량으로 잔존하는 primer를 별도로 제거하지 않고 hybridization을 수행할 수 있도록 특별하게 DNA probe를 설계하였다. 또한, probe가 증폭된 DNA와 hybridization 하였을 때 고체표면에 의한 간섭효과가 최소화되도록 설계 시 반영되었고 더욱이 streptavidin-비오틴의 결합을 이용하여 probe를 고정함으로써 고상에서의 상호작용이 더욱 용이하도록 배려하였다. 이러한 분석방법을 이용하여 분석한 결과 시료첨가 후 20-40분 정도에 최소 $10^3$cfu/mL (10 cells/system) 농도의 박테리아를 분석할 수 있었다. 이러한 결과는 일반적으로 사용하는 전기영동법보다 약 10배정도 더 민감한 결과일 뿐만 아니라 실험실 기기를 사용하지 않고 분석을 수행함으로써 분석시료가 제공되는 현장에서도 식중독 균의 탐지가 가능하게 되었다.
임신이나 배란진단과 같이 가정에서 직접 사용할 수 있는 형태의 membrane strip 크로마토그래피 방법을 이용하여 식중독 균 DNA 분석시스템을 개발하였다. 분석물질로서는 빈번하게 발생하고 있는 식중독 미생물 중에서 S. typhimurium을 선택하였으며, Salmonella 종에 특이한 유전자 부위인 invA 유전자 분석을 목표로 하였다. 우선 이 유전자는 본 실험실 내에서 설계한 primer 쌍을 사용한 PCR 공정을 통하여 증폭되었다. 이렇게 증폭한 산물을 본 연구자들이 설계한 DNA probe와의 hybridization을 통하여 분석함으로써 전통적으로 사용하고 있는 전기영동 분석법의 단순히 분자크기에 의한 분리법과 비교하여 특이한 분석을 할 수 있었다. 이때 PCR 후 과량으로 잔존하는 primer를 별도로 제거하지 않고 hybridization을 수행할 수 있도록 특별하게 DNA probe를 설계하였다. 또한, probe가 증폭된 DNA와 hybridization 하였을 때 고체표면에 의한 간섭효과가 최소화되도록 설계 시 반영되었고 더욱이 streptavidin-비오틴의 결합을 이용하여 probe를 고정함으로써 고상에서의 상호작용이 더욱 용이하도록 배려하였다. 이러한 분석방법을 이용하여 분석한 결과 시료첨가 후 20-40분 정도에 최소 $10^3$cfu/mL (10 cells/system) 농도의 박테리아를 분석할 수 있었다. 이러한 결과는 일반적으로 사용하는 전기영동법보다 약 10배정도 더 민감한 결과일 뿐만 아니라 실험실 기기를 사용하지 않고 분석을 수행함으로써 분석시료가 제공되는 현장에서도 식중독 균의 탐지가 가능하게 되었다.
An analytical system detecting DNA particularly utilizing a concept of membrane strip chromatography initially applied to home-version tests for, such as, pregnancy and ovulation has been developed. We have chosen S. typhimurium as model analyte among food-contaminating microorganisms that occurred ...
An analytical system detecting DNA particularly utilizing a concept of membrane strip chromatography initially applied to home-version tests for, such as, pregnancy and ovulation has been developed. We have chosen S. typhimurium as model analyte among food-contaminating microorganisms that occurred in high frequencies, and invA gene, as a detection target, specific to Salmonella species. This gene was able to be amplified by PCR under optimal conditions employing newly designed primers in our laboratory. The PCR product was specifically measured via hybridization between the analyte and a DNA probe, which was a totally different feature from the conventional gel electrophoresis detecting the products based only on the molecular size. It is notable thar the DNA probe sequence was specially designed such that no separation of excess primers present after PCR was required. This was immobilized on a nitrocellulose (NC) membrane via streptavidin-biotin linkage minimizing a steric effect when the hybridization with the amplified DNA took place. The analyrical system detected the microorganism in a concentration of minimum $10^3$ cfu/mL (i.e., 10 cells per system), estimated from the standard curve, 20 to 40 minutes after adding the sample. This sneitivity was approximately 10 times higher than that of gel electrophoresis as an analytical tool conventionally used. Furthermore, the assay was able to be run at room temperature, which would ofter an extra advantage to users.
An analytical system detecting DNA particularly utilizing a concept of membrane strip chromatography initially applied to home-version tests for, such as, pregnancy and ovulation has been developed. We have chosen S. typhimurium as model analyte among food-contaminating microorganisms that occurred in high frequencies, and invA gene, as a detection target, specific to Salmonella species. This gene was able to be amplified by PCR under optimal conditions employing newly designed primers in our laboratory. The PCR product was specifically measured via hybridization between the analyte and a DNA probe, which was a totally different feature from the conventional gel electrophoresis detecting the products based only on the molecular size. It is notable thar the DNA probe sequence was specially designed such that no separation of excess primers present after PCR was required. This was immobilized on a nitrocellulose (NC) membrane via streptavidin-biotin linkage minimizing a steric effect when the hybridization with the amplified DNA took place. The analyrical system detected the microorganism in a concentration of minimum $10^3$ cfu/mL (i.e., 10 cells per system), estimated from the standard curve, 20 to 40 minutes after adding the sample. This sneitivity was approximately 10 times higher than that of gel electrophoresis as an analytical tool conventionally used. Furthermore, the assay was able to be run at room temperature, which would ofter an extra advantage to users.
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제안 방법
그 하단에 준비된 시료첨가 패드를 2 mm 정도 신호 발생 패드와 중첩하여 붙였다. 마지막으로 흡수패드 (7x25 mm; 17 chromatography grade, Whatman Co., USA)를 신호발생 패드의 상단에 중첩하여 붙여 유전자분석용 "trip을 제작하였다 (Fig. 1 참조).
이 배지를 petri dish에 부어 굳힌 후 위에서 준비된 균주 배양액을 W4, 10'5, 10< 10", 10'8, 그리고 10, 으로희석하여 100 JJL 씩 도말하였다. 37°C로 유지되는 배양기 내에서 9시간 동안 배양한 후 형성된 콜로니 수를 세어서 균주의 농도를 측정하였다.
PCR 공정을 통하여 증폭된 DNA를 특이하게 탐지하기 위한 probe로써 biotin이 표지된 PinvA를 합성하였다(Table 1). 고체표면에 고정화하기 위해 이 probe를 streptavidin과 4:1 몰비로 반응시켰다.
PCR 과정에 의해 증폭된 DNA를 특이하게 분석하기 위해 그 분석물질과 핵산 서열 상보성이 있는 DNA probe를 위에서 설명한 바와 같이 제작한 후 부착단백질인 streptavidin과 중합하여 신호발생 패드 상에 고정하였다. 이때 probe의 고정된 위치에 따라 각 시료에 포함된 화학성분들의 농도, 온도와 같은 물리적 조건, 그리고 중력에 역행하는 액체 흐름의 속도 등의 변화가 예상되었다.
, Germany)에 넣어 PCR을 수행하였다. PCR 반응조건으로써, 94°C 에서 4분 동안 1회 수행한 후, 94°C에서 30초, 55°C에서 1분, 그리고 72°C에서 1분 동안 30회 반복 수행하였고, 마지막으로 72°C에서 5분 동안 1 회 반응시켰다.
5 U Taq. polymerase (GeneCraft Co., Germany), 그리고 20 pmol LZ«vA와 형광이 표지된 Ri'nvA (primers, Table 1 참조)를 5 mM KC1 과 2 mM (NHaBSQ가 포함된 7.5 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 9.0, PCR 반응용액; GeneCraft Co., Germany)에 넣어 PCR을 수행하였다. PCR 반응조건으로써, 94°C 에서 4분 동안 1회 수행한 후, 94°C에서 30초, 55°C에서 1분, 그리고 72°C에서 1분 동안 30회 반복 수행하였고, 마지막으로 72°C에서 5분 동안 1 회 반응시켰다.
또한 PCR을 수행하기 위해 Taq. polymerase (GeneCraft Co., Germany)와 여기에 사용되는 buffer (GeneCraft Co., Germany) 등을 구입하였고 primer와 DNA capture probe (Genset Co., France)는 제작 의뢰하였다. 그리고 nitrocellulose membrane, cellulose membrane (Whatman Co.
이 유전자를 PCR을 통해 증폭하고자 정방향 (I加vA) 그리고 역방향 (RWvA) primer들을 설계하였다 (Table 1). 그 성능을 시험하기 위해 103-107 cfu/mL 농도 범위로 희석된 균의 DNA를 시료로 이용하여 PCR을 실시하였고 그 결과를 전기영동을 통하여 분석하였다. 예측한 바와 같이전기영동 gel 싱・어] 570 bp 크기의 mvA 유전자가 단일 band 로 탐지되었고 10’ cfu/mL의 시료에 대해서도 측정할 수 있는 것으로 나타났다.
, France)는 제작 의뢰하였다. 그리고 nitrocellulose membrane, cellulose membrane (Whatman Co., USA)과 glass fiber membrane (Millipore Co., USA)를 사용하여 분석 시스템을 구성하였으며. Probe 고정화 시에는 glutaaldehyde, poly-L-lysine (Sigma Chemical Co.
이때 probe의 고정된 위치에 따라 각 시료에 포함된 화학성분들의 농도, 온도와 같은 물리적 조건, 그리고 중력에 역행하는 액체 흐름의 속도 등의 변화가 예상되었다. 따라서 DNA probe의 패드 상의 수직배열 위치에 따른 신호 세기 효과를 시험하였고 발생된 신호는 optical density로 전환한 후 그래프로 나타내었다(Fig. 5). 시험 결과로부터, 발색 신호 세기는 신호발생패드 하단으로부터의 거리에 비례하여 증가하지만 최상단 부근에서는 오히려 감소하는 것으로 나타났다.
유전자 크로마토그래피 분석을 위한 핵산 접합 반응은 비평형 상태 하에서 속성으로 수행되기 때문에 그 결합체의 형성은 분석시간에 따라 변화한다Q9). 따라서 분석 시간에 대한 측정성능의 변화를 우선 결정하였고 최적 조건 하에서 농도 응답을 구하였다. 본 실험에서 사용된 조건 하에서 분석 시간을 20분으로 고정하면 분석물질의 탐지하한농도는 약 10, cfu/mL이지만, 분석 시간을 2배 증가시키면 발생되는 신호가 높아져서 탐지 하한농도는 약 10배 정도 낮아지는 것으로 나타났다(6a).
있다. 따라서, 본 연구에서는 현장 분석을 위해 주로이 용되 는 membrane strip 크로마토그래피 분석 방법 을(10-12) 채택하여 한 예로써 식중독균의 유전자 분석에 응용하였다. 식중독 균 중 배양이 용이하며 특정 유전 부위가 이미 밝혀진 Salmonella typhim"h”n(13)을 모델 분석물질로 선택하였다.
분석대상 물질인 DNA를 증폭하기 위해 PCR을 수행하였다(14). 위에서 준비된 genomic DNA를 10, 에서 10’ cfu/mL 균에 해당하는 농도로 희석하였다.
유전자분석 Strip 시스템의 성능에 대해 조건 최적화를 수행하기 위해 신호 발생이 우선 성취되어야 하므로 신호 발생원으로 사용될 colloidal gold-항체 (형광물질에 특이함) 중합체를 합성하였고 그 기능을 시험하였다 이 중합체는 유전자분석 시 궁극적으로 고체 표면에 고정된 probe와의 핵산 접합에 의해 포획되는 DNA 분자 상의 형광물질을 항원으로 인지하여 발색신호를 발생한다(Fig. 2c). 이를 모방하여 우유 단백질인 casein과 형광물질 간의 중합체를 신호발생패드의 일정 지역에 고정한 후 신호 발생원으로 합성한 gold 중합체를 모세관 현상에 의해 하단으로부터 유입시켜 크로마토그래피 방법에 의한 항원-항체 반응을 시험하였다(Fig.
이러한 유전자들은 다른 그람 음성 균주에서도 같은 기능으로 유사하게 존재하는데 이중 invk gene은 Salmonella 종을 특이하게 분류하는데 사용되고 있다(18). 이 유전자를 PCR을 통해 증폭하고자 정방향 (I加vA) 그리고 역방향 (RWvA) primer들을 설계하였다 (Table 1). 그 성능을 시험하기 위해 103-107 cfu/mL 농도 범위로 희석된 균의 DNA를 시료로 이용하여 PCR을 실시하였고 그 결과를 전기영동을 통하여 분석하였다.
2c). 이를 모방하여 우유 단백질인 casein과 형광물질 간의 중합체를 신호발생패드의 일정 지역에 고정한 후 신호 발생원으로 합성한 gold 중합체를 모세관 현상에 의해 하단으로부터 유입시켜 크로마토그래피 방법에 의한 항원-항체 반응을 시험하였다(Fig. 4). 그 결과, 형광물질이 고정화된 strip에서는 강한 발색 신호가 발생된 반면에 형광물질을 포함하지 않은 strip에서는 어떤 신호도 나타나지 않았다.
이와 같은 결과로부터 설계된 primer가 목표 유전자에 대해 특이할 뿐만 아니라 PCR을 통한 증폭이 매우 효율적임을 확인하였다. 참고로, 우리는 미생물을 고농도로 배양하여 이로부터 DNA를 정제한 후 표준시료로 사용하여 위에서 설명된 실험을 수행하였다. 그러나 실제로 식중독균에 대한 진단키트의 현장시험 시에는 각기 다른 식품 (예: 유가공 제품) 어】 식중독균이 분포할 수 있으므로 특히 DNA 추출 효율의 변이가 예상된다.
대상 데이터
따라서, 본 연구에서는 현장 분석을 위해 주로이 용되 는 membrane strip 크로마토그래피 분석 방법 을(10-12) 채택하여 한 예로써 식중독균의 유전자 분석에 응용하였다. 식중독 균 중 배양이 용이하며 특정 유전 부위가 이미 밝혀진 Salmonella typhim"h”n(13)을 모델 분석물질로 선택하였다. Membrane strip의 세공을 통한 모세관현상을 이용하면 분석물질인 DNA의 물질전달을 가속시킬 수 있고 또한 일정 지역에 고정되어 있는 DNA capture probe와의 접합반응을 유도함으로써 분석물질을 속성으로 특이하게 측정할 수 있다.
, USA)를 사용하여 분석 시스템을 구성하였으며. Probe 고정화 시에는 glutaaldehyde, poly-L-lysine (Sigma Chemical Co., USA), 그리고 streptavidin (International enzyme, USA) 역시 구입하여 사용하였다. 이외의 시약은 모두 분석용 급을 구입하여 사용하였다.
본 실험에서 분석대상 미생물로써 S. typhimurium (KCTC 1925)를 사용하였고 배지를 준비하기 위해 nutrient broth (Difco Lab., USA)를 탈이 온수에 8 g/L의 농도로 녹인 후 5 mL씩 cap tube에 넣고 121 °C 그리고 1.5 기압에서 15분 동안 멸균하였다. 이후 균주를 멸균된 배지에 접종시켰고 3 7°C 그리고 200 rpm이 유지되는 배양기에서 18시간 동안 배양하였다.
분석대상 미생물로 S. typhimurium (KCTC 1925)를 사용하였고, 이것을 배양하기 위해 nutrient broth (Difco Lab., USA) 와 agar (Junsei Chemical Co., Japan)을 구입하였으며 DNA 정제를 위해서 sodium dodecyl sulfate, EDTA, phenol, chloroform, isoamylalcohol, NaCl, EtOH, Trisma base (Sigma Chemical Co., USA)를 사용하였다. 또한 PCR을 수행하기 위해 Taq.
데이터처리
다른 농도로 존재하는 invA gene에 대해 증폭된 DNA의 크로마토그래피 분석을 최적 조건 하에서 수행하였고 그 결과를 전기영동 분석 결과와 비교하였다(Fig. 6). 유전자 크로마토그래피 분석을 위한 핵산 접합 반응은 비평형 상태 하에서 속성으로 수행되기 때문에 그 결합체의 형성은 분석시간에 따라 변화한다Q9).
5% casein이 포함된 100 mM Tris-HCl 완충용액 150 虬가 들어 있는 5 mL 유리관에 꽂아 넣어 용액을 모세관현상에 의해 흡수시켰다. 분석개시 20분 혹은 40분 후에 꺼내어 신호가 발생된 strip을 스캐닝하여 이미지를 컴퓨터에 저장하였고 Multi-Analyst (BioRad Co., , USA) 분석 프로그램을 이용하여 발생된 발색의 optical density를 측정하였다(16).
성능/효과
결론적으로, 유전자 크로마토그래피 분석시스템의 성능을 조절하는 주요 변수들을 최적화하였고 이 조건 하에서 IO, cfu/mL 농도에 상응하는 S. 邛以沥"加«에 특이한 invA 유전자를 간편하게 그리고 속성으로 검출하였다. 이와 같은 측정 하한농도는 실제로 응용할 경우 분석시스템 당 5개의 미생물 세포의 존재 유무를 확인할 수 있을 정도의 우수한 성능임을 나타낸다.
4). 그 결과, 형광물질이 고정화된 strip에서는 강한 발색 신호가 발생된 반면에 형광물질을 포함하지 않은 strip에서는 어떤 신호도 나타나지 않았다. 이것은 gold 중합체가 membrane 상에 고정되어있는 형광물질을 특이하게 인지하는 기능을 보유하였으며 이에 따라 발색 신호 발생을 이용한 분석시스템의 조건 최적화를 수행할 수 있었다.
본 실험에서 사용된 조건 하에서 분석 시간을 20분으로 고정하면 분석물질의 탐지하한농도는 약 10, cfu/mL이지만, 분석 시간을 2배 증가시키면 발생되는 신호가 높아져서 탐지 하한농도는 약 10배 정도 낮아지는 것으로 나타났다(6a). 더욱이 분석물질 부재 하에서의 비특이 신호 발생은 전무하여 고안된 분석시스템은 매우 특이성이 높은 것으로 나타났다. 사용된 조건 하에서 크로마토그래피 분석시스템의 농도응답(6a)을 전기영동 분석결과(6b)와 비교하면 크로마토그래피 시스템이 측정 민감도 측면에서 10배 더 우수한 것으로 규명되었다.
이와 같이 접합 반응을 통한 분석물질의 탐지는 colloidal gold와 같은 표지물질을 이용하여 그 반응 부위에서 발색을 생성시킴으로써 분석물질의 유무를 눈으로 직접 확인 할 수 있게 된다. 더욱이, 이와 같은 DNA probe 분석시스템을 PCR 공정과 결합시킴으로써 유전자 분석 시 잠재적인 낮은 측정 민감도를 보완하였다.
따라서 분석 시간에 대한 측정성능의 변화를 우선 결정하였고 최적 조건 하에서 농도 응답을 구하였다. 본 실험에서 사용된 조건 하에서 분석 시간을 20분으로 고정하면 분석물질의 탐지하한농도는 약 10, cfu/mL이지만, 분석 시간을 2배 증가시키면 발생되는 신호가 높아져서 탐지 하한농도는 약 10배 정도 낮아지는 것으로 나타났다(6a). 더욱이 분석물질 부재 하에서의 비특이 신호 발생은 전무하여 고안된 분석시스템은 매우 특이성이 높은 것으로 나타났다.
더욱이 분석물질 부재 하에서의 비특이 신호 발생은 전무하여 고안된 분석시스템은 매우 특이성이 높은 것으로 나타났다. 사용된 조건 하에서 크로마토그래피 분석시스템의 농도응답(6a)을 전기영동 분석결과(6b)와 비교하면 크로마토그래피 시스템이 측정 민감도 측면에서 10배 더 우수한 것으로 규명되었다.
5). 시험 결과로부터, 발색 신호 세기는 신호발생패드 하단으로부터의 거리에 비례하여 증가하지만 최상단 부근에서는 오히려 감소하는 것으로 나타났다. 신호발생패드의 대부분 지역 (하단으로부터 0.
그 성능을 시험하기 위해 103-107 cfu/mL 농도 범위로 희석된 균의 DNA를 시료로 이용하여 PCR을 실시하였고 그 결과를 전기영동을 통하여 분석하였다. 예측한 바와 같이전기영동 gel 싱・어] 570 bp 크기의 mvA 유전자가 단일 band 로 탐지되었고 10’ cfu/mL의 시료에 대해서도 측정할 수 있는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과로부터 설계된 primer가 목표 유전자에 대해 특이할 뿐만 아니라 PCR을 통한 증폭이 매우 효율적임을 확인하였다.
셋째 과정으로 용해된 항체-colloidal gold 중합체가 연이어 운반되어 probe에 포획된 DNA 분자의 5七 말단에 표지되어있는 형광물질과 반응하여 결합한다(2c). 이 결합체는 colloidal gold를 포함하므로 눈으로 확인할 수 있는 발색이 신호로써 발생되고 결과적으로 분석하고자 하는 식중독균의 유무를 육안으로 쉽게 확인할 수 있다.
예측한 바와 같이전기영동 gel 싱・어] 570 bp 크기의 mvA 유전자가 단일 band 로 탐지되었고 10’ cfu/mL의 시료에 대해서도 측정할 수 있는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과로부터 설계된 primer가 목표 유전자에 대해 특이할 뿐만 아니라 PCR을 통한 증폭이 매우 효율적임을 확인하였다. 참고로, 우리는 미생물을 고농도로 배양하여 이로부터 DNA를 정제한 후 표준시료로 사용하여 위에서 설명된 실험을 수행하였다.
95 cm 지역)에서 신호가 감소한 것은 시료에 포함되었던 유기용매가 점차 희석되어 DNA 단일가닥들이 renaturation 되기 때문으로 예측된다. 이와 같은 결과에 근거하여, DNA probe의 고정화 배열 시 nitrocellulose membrane 하단으로부터 1.15 cm 거리가 최적이라는 것을 알 수 있었다.
邛以沥"加«에 특이한 invA 유전자를 간편하게 그리고 속성으로 검출하였다. 이와 같은 측정 하한농도는 실제로 응용할 경우 분석시스템 당 5개의 미생물 세포의 존재 유무를 확인할 수 있을 정도의 우수한 성능임을 나타낸다. 유전자 크로마토그래피 방법을 기존에 일반적으로 사용되고 있는 전기영동법과 비교하면 분석시간이 상대적으로 짧고 그 분석 특이성도 높을 뿐만 아니라 측정민감도도 향상된 분석시스템이다.
후속연구
그러나 현재 시료만을 첨가하여 수행이 완료될 수 있는 PCR 용 마이크로시스템을 개발하는 연구들이 진행되고 있을 뿐만 아니라(20) PCR과 비교하여 상대적으로 사용이 간편한 다양한 증폭기술의 개발이 이루어지고 있다(21, 22). 따라서 본연구에서 개발된 유전자 크로마토그래피 분석시스템은 가까운 미래에 현장 사용이 가능한 DNA 증폭 공정 기술과 융합될 수 있을 것으로 전망된다. 이렇게 현장 진단을 위한 주요 기술들과 융합되어진 유전자 크로마토그래피 분석시스템은 다양한 유전자 측정을 위해 응용이 매우 용이해서 식중독균의 검사 외에도 유전자 변형작물의 분류, 병원성 박테리아 및 바이러스의 검출, 유전성 질환의 조기 검진, 암 발생 인자의 조사 등 그 응용의 범위는 매우 넓다.
그러나 실제로 식중독균에 대한 진단키트의 현장시험 시에는 각기 다른 식품 (예: 유가공 제품) 어】 식중독균이 분포할 수 있으므로 특히 DNA 추출 효율의 변이가 예상된다. 따라서 분석재현성을 확보하기 위해서는 추가적으로 효율적인 DNA 추출방법의 개발이 필요하다.
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