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문제 정의
- 알콜증류 폐액에 빵효모를 배양하는 중에 포도당, 암모늄 및 인산을 자동 첨가하여 균체량을 효율적으로 증가시킴으로써 폐액의 재이용성을 향상시키고자 하였다. 포도당은 DO를 제어파라미터로 하는 제어방법을 사용하여 자동 첨가함으로서 그 농도를 300 mg/L 이하로 유지하였다.
- 따라서, 본 연구에서는 배양액의 인산을 자동분석하기 위하여 자동화 FIA 장치을 제작하였으며, 이 장치를 사용하여 알콜증류폐액에 빵효모를 배양하면서 배양액에 포도당, 암모늄과 함께 인산까지 자동첨가 함으로써 균체농도를 효율적으로 더 증가시킬 수 있는가를 알아 보았다.
- 미생물배양액의 인산을 자동제어하기 위해서는 상당히 긴 시간에 걸쳐서 여러 번 자동분석을 수행하여야 하므로 침전물을 효과적으로 제거하여야 한다. 본 연구에서는 두 가지 방법으로 이 문제를 해결하고자 하였다. 첫 번째 방법은 표준 용액과 시료를 분석한 후 매번 injection valve loop를 2M NaOH 용액으로 채우고 유로를 따라 흘려서 침착된 침전물을 세척하여 제거 하여 주는 것이었다.
가설 설정
- 2에 나타내었다. 제어방법은 인산의 형태로 존재하는 인 (Pd-P)의 농도를 자동분석하고 그 농도가 30 mg/L이하가 되면 40 mg/L가 되도록 10% KH2PO4 용액을 공급 (배양액의 양은 3.0 L로 가정)하는 것으로 하였다. 자동분석방법은 20 mg/L 표준용액, 40 mg/L 표준용액 및 시료의 순서로 흡광도 peak값을 검출한 후 내삽에 의하여 시료의 PO4-P 농도를 산출하는 것으로 하였다.
제안 방법
- 폐액의 재이용성을 향상시키고자 하였다. 포도당은 DO를 제어파라미터로 하는 제어방법을 사용하여 자동 첨가함으로서 그 농도를 300 mg/L 이하로 유지하였다. 암모늄은 pH-stat 방법을 사용하여 NHQH로서 자동 첨가함으로서 12.
- 4 mM의 낮은 농도범위로 유지하였다. 인산의 경우에는 분석 방법으로써 ascorbic acid법을 채택한 자동화 FIA sysetm을 제작하여 사용하였다. 이 system으로 배양 19.
- 0N NHQH를 사용하였다. 배양액의 용존산소농도는 통기량과 교반 속도를 조절함으로써 용존산소포화 백분율을 20% 이상으로 유지하였다. 소포제는 실리콘소포제 (럭키 디씨 실리콘, LS-300)를 사용하였다.
- 포도당 자동첨가장치의 구성을 Fig. 1의 발효조 왼쪽 바로 윗부분에 나타내었으며, 자동첨가방법은 전보들(1, 2) 과같이 DO를 제어파라미터로 하는 방법을 사용하였다.
- 계측제어장치는 486급 PC, multifunction card (Advantech, PCL-812PG), 신호변환기 (미래전자, MR-ISO), relay board(제작) 및 SSR board(제작)로 구성하였다.
- 0 L로 가정)하는 것으로 하였다. 자동분석방법은 20 mg/L 표준용액, 40 mg/L 표준용액 및 시료의 순서로 흡광도 peak값을 검출한 후 내삽에 의하여 시료의 PO4-P 농도를 산출하는 것으로 하였다. 흡광도 peak 값을 검출한 후에는 매번 2M NaOH 용액으로 loop를 채우고 유로를 따라 흘림으로서 tubing과 검출기 flow cell의 벽에 침착된 청색의 반응물을 세척하여 주었다.
- 45 Jim membrane filter로 여과한 여액에 포도당측정용 시약 (아산제약, AM201)을 첨가하여 발색시킨 후 비색법으로 측정하였다. 암모늄 농도의 측정은 배양액을 membrane filter로 여과한 여액에 대하여 자동화 FIA장치(2)를 사용하여 측정하였다.
- 본 연구에서는 두 가지 방법으로 이 문제를 해결하고자 하였다. 첫 번째 방법은 표준 용액과 시료를 분석한 후 매번 injection valve loop를 2M NaOH 용액으로 채우고 유로를 따라 흘려서 침착된 침전물을 세척하여 제거 하여 주는 것이었다. 두 번째 방법은 검출기의 출구에 적당한 길이의 내경 0.
- 첫 번째 방법은 표준 용액과 시료를 분석한 후 매번 injection valve loop를 2M NaOH 용액으로 채우고 유로를 따라 흘려서 침착된 침전물을 세척하여 제거 하여 주는 것이었다. 두 번째 방법은 검출기의 출구에 적당한 길이의 내경 0.01 inch stainless steel tubing을 연결하여 역압을 걸어줌으로서 침전물이 debubbler(6)의 PTFE membrane (Satorius, 11806-47-N)을 통하여 유로 밖으로 배출되도록 하는 것이었다. 이들 방법을 사용함으로써 결과적으로 원활한 자동분석이 가능하였다.
- 시료의 1회 분석에 소요되는 시간은 약 11분이었다. 농도를 정확히 측정하기 위하여 매회 분석시마다 두 가지 표준용액으로 calibration을 실시하였으므로 분석시간이 비교적 길어졌다. 그러나, 20 mg/L 표준용액의 흡광도 값의 평균이 0.
- 5에 나타내었다. 포도당은 폐액배양액의 탄소원이 전부 고갈되어 DO가 처음으로 60% 이상으로 증가된 4.4시간부터 DO신호가 증가할 때마다 0.9g씩 자동으로 첨가하여 주었으며(1, 2), 암모늄은 포도당 첨가가 시작된 후부터 저하하는 배양액의 pH를 중화하기 위하여 NHQH를 알칼리제로 첨가함으로써 자동으로 첨가하였다(1). 인산의 경우에는 19.
- 9g씩 자동으로 첨가하여 주었으며(1, 2), 암모늄은 포도당 첨가가 시작된 후부터 저하하는 배양액의 pH를 중화하기 위하여 NHQH를 알칼리제로 첨가함으로써 자동으로 첨가하였다(1). 인산의 경우에는 19.4시간까지는 sampler에서 시료를 수동으로 채취하여 희석한 후 자동분석장치로 분석하였으며, PO4-P 농도가 거의 40 mg/L 부근에 도달한 19.4 시간 이후 완전자동으로 분석하는 동시에 필요한 경우에는 인산을 KH2PO4로써 자동첨가하였다.
- 배양액의 PQ-P 농도는 그림에서와 같이 초기 266.5 mg/L 에서 균의 증식과 함께 계속 저하하여 17.9 시간에 48.1 mg/L에 도달하였으므로 19.4시간부터 자동분석 및 제어를 시작하였다. 인산의 자동첨가를 시작한 후 배양말기까지 총 34 회의 자동분석이 수행되었으며, PO4-P 농도는 23.
대상 데이터
- 균주는 J사 (경기도 안산시 소재)의 건조 이스트 제품으로부터 YM 평판배지 (peptone 5 g, yeast extract 3 g, malt extract 3 g, glucose 10 g, distilled water 1 L)를 사용하여 순수분리한 빵효모를 사용하였다. 알콜증류 폐액은 J사 (경기도 안산시 소재)에서 현미를 원료로 사용하여 주정을 생산하고 폐기되는 폐액을 수집하여 여과지 (Toyo Roshi Kaisha, 5C) 로 여과하여 사용하였다.
- 빵효모를 사용하였다. 알콜증류 폐액은 J사 (경기도 안산시 소재)에서 현미를 원료로 사용하여 주정을 생산하고 폐기되는 폐액을 수집하여 여과지 (Toyo Roshi Kaisha, 5C) 로 여과하여 사용하였다. 여과폐액의 pH는 3.
- 5 로 유지하였다. pH 조정제는 2.0N H2SO4 와 4.0N NHQH를 사용하였다. 배양액의 용존산소농도는 통기량과 교반 속도를 조절함으로써 용존산소포화 백분율을 20% 이상으로 유지하였다.
- 배양액의 용존산소농도는 통기량과 교반 속도를 조절함으로써 용존산소포화 백분율을 20% 이상으로 유지하였다. 소포제는 실리콘소포제 (럭키 디씨 실리콘, LS-300)를 사용하였다.
- 2 pm, 내경 7 mm, 외경 10 mm, 여과면적 10.4 cm?인 원통형의 ceramic filter (제공처: 코바이오텍(주))를 사용하였다. 시료, 두 가지 표준용액 또는 2M NaOH 용액 중 한 가지를 선택하는 valve는 3 inlet-1 outlet valve (Cole-Parmer, H-01367-81) 1 개와 three-way val.
- 시료, 두 가지 표준용액 또는 2M NaOH 용액 중 한 가지를 선택하는 valve는 3 inlet-1 outlet valve (Cole-Parmer, H-01367-81) 1 개와 three-way val.,e (Cole-Parmer, E-01367-72) 2개를 조합하여 사용하였다. FIA 시스템은 carrier solution을 이송하는 tubing pump (Eyela, SMP-23S), 시료, 표준용액 또는 2M NaOH용액을 이송하는 tubing pump (Eyela, SMP-21), injection valve (Rheodyne, 5020), valve actuator (Rheodyne, 5701), air solenoid val.
- ,e (Rheodyne, 7163-033), 질소 압력통, 혼합 coil (50cm) 2개, debubbler(6) 및 흡광도 검출기 (660 nm) (영린기기, M720) 로구성하였다. 모든 tubing은 내경 0.8 mm의 PTFE tubing을 사용하였다. Carrier solution 은 0.
- 6 ml/min였으며, injection valve의 loop 용량은 약 40 虬였다. 10%(w/v) KH2PO4의 공급에 tubing pump (Eyela, SMP-21)를 사용하였다.
- 인산 자동첨가장치를 제작하여 사용하였으며, 그 구성을 Fig. 1의 발효조 오른쪽 부분에 나타내었다. 시료채취장치 중 sampling probe는 공경(孔徑) 0.
이론/모형
- 인원은 인산염의 형태로 첨가하면 되며, 인산을 자동첨가하자면 배양액 인산 농도의 자동측정이 선행되어야 한다. 배양액의 인산을 자동측정하는 연구로써 Gam 등(3)은 on-line FIA법으로 대장균 배양액의 인산을 자동측정하였으며, 분석 방법은 비색법인 ascorbic acid법을 사용하였다. Putten 등(4, 5)은 Bacillus licheaifortnis를 배양하여 alkaline protease# 생산하는 연구에서 on-line FIA 장치로 인산을 자동분석하였다.
- Putten 등(4, 5)은 Bacillus licheaifortnis를 배양하여 alkaline protease# 생산하는 연구에서 on-line FIA 장치로 인산을 자동분석하였다. 분석 방법은 역시 ascorbic acid법이었다. 이들의 방법이 본 연구에도 적용될 수 있다고 생각되었다.
- 암모늄의 자동첨가는 전보(1)의 pH-stat 방법을 사용하였다.
- 포도당 농도는 배양액을 공경 0.45 Jim membrane filter로 여과한 여액에 포도당측정용 시약 (아산제약, AM201)을 첨가하여 발색시킨 후 비색법으로 측정하였다. 암모늄 농도의 측정은 배양액을 membrane filter로 여과한 여액에 대하여 자동화 FIA장치(2)를 사용하여 측정하였다.
- 포도당은 DO를 제어파라미터로 하는 제어방법을 사용하여 자동 첨가함으로서 그 농도를 300 mg/L 이하로 유지하였다. 암모늄은 pH-stat 방법을 사용하여 NHQH로서 자동 첨가함으로서 12.6-17.4 mM의 낮은 농도범위로 유지하였다. 인산의 경우에는 분석 방법으로써 ascorbic acid법을 채택한 자동화 FIA sysetm을 제작하여 사용하였다.
- 연구(1, 2)가 수행되었다. 포도당은 용존산소농도를 제어파라미터로 하여 자동첨가 하였으며, 암모늄은 pH-stat 에 의한 방법 (1) 또는 자동화 FIA 장치(2)을 사용하였다.
성능/효과
- 4 mg/L 의 낮은 농도범위로 유지할 수 있었다. 세 가지 영양성분을 자동첨가하면서 배양한 결과 증식의 정체 없이 균체량을 33.0배 더 증가시킬 수 있었다. 비증식속도는 0.
- 탄소원, 질소원에 이어서 인원까지 자동첨가 한다면 배양액의 균체 농도를 더 높여 배양의 효율성을 더욱 증가시킬 수 있다고 생각되었다. 인원은 인산염의 형태로 첨가하면 되며, 인산을 자동첨가하자면 배양액 인산 농도의 자동측정이 선행되어야 한다.
- 01 inch stainless steel tubing을 연결하여 역압을 걸어줌으로서 침전물이 debubbler(6)의 PTFE membrane (Satorius, 11806-47-N)을 통하여 유로 밖으로 배출되도록 하는 것이었다. 이들 방법을 사용함으로써 결과적으로 원활한 자동분석이 가능하였다.
- 그림에서와같이 자동분석이 무리없이 이루어졌다. 두 가지 표준 용액과 시료의 피크들 사이에 출현하는 낙타등 모양의 작은 피크들은 NaOH 용액으로 세척하는 과정에서 나타나는 피크들로서 NaOH에 씻긴 tubing의 침착물이 flow-through cell을 통과하면서 형성되는 것이라고 생각되었다. 시료의 1회 분석에 소요되는 시간은 약 11분이었다.
- 농도를 정확히 측정하기 위하여 매회 분석시마다 두 가지 표준용액으로 calibration을 실시하였으므로 분석시간이 비교적 길어졌다. 그러나, 20 mg/L 표준용액의 흡광도 값의 평균이 0.398+0.0055 (n=34)이고 변이계수가 1.38%이며, 40 mg/L 표준용액의 흡광도 값의 평균이 0.766±0.010 (n=34)이고 변이계수가 L33%로써 값의 변화가 크지 않은 것을 감안하면 calibration을 매번 수행할 필요는 없다고 생각되었다. 자동첨가시 초기에 한번만 calibration 한다고 가정하면 시료의 1회 분석시간은 약 3.
- 3 이L에 도달하였다. 포도당 첨가를 시작한 배양 4.4시간에 약 0.98 g/L에 도달하는 것으로 추산되었으므로 포도당, 암모늄 및 인산의 첨가에 의하여 26시간까지균체량을 0.98 g/L보다 약 31.3 g/L 더 증가시킬 수 있었으며, 이것은 0.98 g/L보다 약 33.0배 더 증가한 것이다. 또한, 인산이 전부 소모될 경우의 균체량이 약 21.
- 0배 더 증가한 것이다. 또한, 인산이 전부 소모될 경우의 균체량이 약 21.0 g/L로 추산되었으므로 포도당과 암모늄의 첨가에 의하여 0.98 g/L보다 약 20.0 g/L 더 증가시킬 수 있었으며, 이것은 0.98 g/L보다 약 20.4배 더 증가한 것이다’ 인산까지 첨가함으로써 포도당과 암모늄 두 가지만 첨가한 경우보다 균체량을 약 11.3g/L 더 증가시킬 수 있었다.
- 4시간부터 자동분석 및 제어를 시작하였다. 인산의 자동첨가를 시작한 후 배양말기까지 총 34 회의 자동분석이 수행되었으며, PO4-P 농도는 23.3-43.4 mg/L의 낮은 농도범위로 유지되었으므로 자동첨가에 의하여 인산을 효율적으로 첨가할 수 있었고, 또한 효율적으로 증 균할 수 있었다. 분석치들의 평균은 31.
- 암모늄 농도는 4.4시간 이후 12.6-17.4 mM의 낮은 농도 범위로 유지되었으며, 결핍의 가능성은 적다고 생각되었으므로 pH-stat 방법에 의한 암모늄의 자동첨가가 본 연구에서는 효율적임을 확인할 수 있었다.
- 배양 전 기간의 비증식속도는 0.19 hr”이고 배양과정에서 증식의 정체가 일어나지 않았으므로 세 가지 영양성분의 자동첨가에 의하여 비교적 효율적으로 증균시킬 수 있다고 생각되었다. 그러나 증식속도가 배양 초기부터 계속 감소되는 양상을 나타낸 것은 주로 포도당의 제어방법이 간접적인 것과 관련이 있다고 생각되었으며, 포도당을 직접제어(6, 7) 할경우 증식속도가 더욱 커질 수 있다고 생각되었다.
- 검출기 flow cell의 벽에 침착되는 것이다. 본 연구의 측정대상 PO4-P 농도는 20-40 mg/L 범위로서 낮은 농도가 아니므로 분석과정에서 상당량의 침전물이 생성되어 유로의 tubing 안벽에 침착되는 것을 관찰할 수 있었다. 미생물배양액의 인산을 자동제어하기 위해서는 상당히 긴 시간에 걸쳐서 여러 번 자동분석을 수행하여야 하므로 침전물을 효과적으로 제거하여야 한다.
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