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문제 정의
- 본 논문에서는 여러가지 다양한 작은 분자들과 성장인자들이 LC 노르아드레날린성 신경세포에서 BDNF의 분비를 촉진하는지 광범위하게 조사하였다. 살아있는 실험동물의 뇌에서는 이러한 작은분자들의 작용을 탐색하기가 거의 불가능하므로 LC 노르아드레날린성 신경세포주(12)를 사용하여 여러 그룹의 작은 분자들의 BDNF 분비 조절 효과를 조사하였다.
- 가장 실용적인 접근 방법은 BBB를 통과할 수 있는 구강적으로 활동적인 합성물을 투여하고 뇌 속에서 신경영양인자 효과를 생성하거나, 유전자를 이용하여 뇌 속에서 신경영양인자를 생산하는 것이다. 본 연구에서는 BBB를 쉽게 통과할 수 있는 다양한 작은 분자들을 사용해서 LC 노르아드레날린 뉴런에서 BDNF 합성 및 분비를 활성화시킬 수 있는지를 탐색하였다.
- 뇌 유래 신경영양인자, BDNF가 LC 노르아드레날린성 뉴런을 포함한 중추신경계 뉴런들의 분화와 신경세포 생존에 중요한 조절자로 작용한다. 본 연구에서는 LC 노르아드레날린성 신경세포에서 여러가지 작은 분자들과 성장인자들이 BDNF 생산을 촉진할 수 있는지를 조사하였다. 실험에 사용한 분자들로는 neuropeptides, cytokines, 성장인자, 신경전달물질들과 세포 내 신호전달물질들이 포함되었다.
제안 방법
- 24시간 후, 배지를 회수하여 ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay)로 BDNF를 측정하기 전까지 -80℃에 보관하였다. BDNF의 양은 BDNF Emax ImmunoAssay System (Promega, Madison, WI, USA)을 사용해서 자동화된 ELISA plate readei를 통해 측정하였다.
- Neuropeptides와 성장인자들은 신경작용을 조절하는 것으로 잘 알려져 있어서, 대표적인 neuropeptide들과 cytokine들 그리고 성장인자들이 LC 노르아드레날린성 뉴런에서 BDNF 분비를 조절하는지의 여부를 조사하였다. Fig.
- 노르아드레날린성 세포를 6-well plate에서 2x10, cells/well 의 subconfluent 상태로 하룻동안 배양한 후, 1.5 戒의 최소배지 (MEM/F12 + N-2 supplement) 로 바꾸고 나서 BDNF 유도 후보 물질들을 각 well에 첨가하였다. 24시간 후, 배지를 회수하여 ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay)로 BDNF를 측정하기 전까지 -80℃에 보관하였다.
- 광범위하게 조사하였다. 살아있는 실험동물의 뇌에서는 이러한 작은분자들의 작용을 탐색하기가 거의 불가능하므로 LC 노르아드레날린성 신경세포주(12)를 사용하여 여러 그룹의 작은 분자들의 BDNF 분비 조절 효과를 조사하였다.
대상 데이터
- Cytokii此인 interleukin Ip (IL-Ip), tumor necrosis factor-a (TNFa) 성장인자인 fibroblast growth factor 8b (FGF8b), glial cell-line derived neurotrophic factor (GDNF), neurotrophin-3 (NT-3) 는 R & D Systems (Minneapolis, MN, USA) 에서 구입하였다. Bone morphogenic protein 4 (BMPY) 는 Genetics Institute (Cambridge, MA, USA) 로부터 구입하여 사용하였다.
- 신호전달물질로는 forskolin (Fors), dibutyiyl cGMP (cGMP), genistein (Geni), Ca++ ionophore A23187, dexamethasone (Dex), hydrogen peroxide (H2O2) 등올 사용하였다. Cytokii此인 interleukin Ip (IL-Ip), tumor necrosis factor-a (TNFa) 성장인자인 fibroblast growth factor 8b (FGF8b), glial cell-line derived neurotrophic factor (GDNF), neurotrophin-3 (NT-3) 는 R & D Systems (Minneapolis, MN, USA) 에서 구입하였다. Bone morphogenic protein 4 (BMPY) 는 Genetics Institute (Cambridge, MA, USA) 로부터 구입하여 사용하였다.
- Locus coeruleus 유래의 노르아드레날린성 세포주(12) 는 33℃, 5% CO2 조건으로 RF 배지 (10% FBS, 1% glucose, 2 mM L-glutamine, 100 units/m£ penicillin, 100 阐威, streptomycin 첨가 D-MEM 배지)에서 배양하였으며, 실험에는 계대수가 5 이내인 세포를 사용하였다.
- 의 것을 사용하였다. Neuropeptides 로는 neurotensin (NEUT), somatostatin (SOM), adrenocorticotropic hormone (ACTH), dynorphin (DYPN)을 사용하였고, 신경전달 물질로는 noradrenaline (NA), dopamine (DA), serotonin (5-HT), glutamate (GLU) 등을 사용하였다. 신호전달물질로는 forskolin (Fors), dibutyiyl cGMP (cGMP), genistein (Geni), Ca++ ionophore A23187, dexamethasone (Dex), hydrogen peroxide (H2O2) 등올 사용하였다.
- Untreated sample was used as control (CON). The four representative neurotransmitters, such as noradrenaline(NA, 25pM), dopamine(DA, lyM), serotonin(5HT, 2511M) and glutamate(GLU, 25pM) were tested. Glutamate and noradrenaline increased the release of BDNF by 20-40%.
- Cytokine들 중에서는 TNFa가 20% 정도 BDNF 분비를 촉진하였다. 성장인자로는 FGF8b, BMP4, GDNF 그리고 NT-3를 사용하였다. 이들은 LC 노르아드레날린성 뉴런의 성장과 분화에 필요한 것으로 알려져 있다(13).
- Neuropeptides 로는 neurotensin (NEUT), somatostatin (SOM), adrenocorticotropic hormone (ACTH), dynorphin (DYPN)을 사용하였고, 신경전달 물질로는 noradrenaline (NA), dopamine (DA), serotonin (5-HT), glutamate (GLU) 등을 사용하였다. 신호전달물질로는 forskolin (Fors), dibutyiyl cGMP (cGMP), genistein (Geni), Ca++ ionophore A23187, dexamethasone (Dex), hydrogen peroxide (H2O2) 등올 사용하였다. Cytokii此인 interleukin Ip (IL-Ip), tumor necrosis factor-a (TNFa) 성장인자인 fibroblast growth factor 8b (FGF8b), glial cell-line derived neurotrophic factor (GDNF), neurotrophin-3 (NT-3) 는 R & D Systems (Minneapolis, MN, USA) 에서 구입하였다.
- 본 연구에서는 LC 노르아드레날린성 신경세포에서 여러가지 작은 분자들과 성장인자들이 BDNF 생산을 촉진할 수 있는지를 조사하였다. 실험에 사용한 분자들로는 neuropeptides, cytokines, 성장인자, 신경전달물질들과 세포 내 신호전달물질들이 포함되었다. 여러가지 작은 분자들과 성장인자들 중에서 FGF8b, BMP-4, forskolin 그리고 dibutyryl cGMP가 LC 노르아드레날린성 뉴런에서 BDNF 분비를 뚜렷하게 증대시킨 것으로 판명되었다.
데이터처리
- 결과는 GraphPad Prism data analysis program (GraphPad Software, San Diego, CA) 으로 분석하였고, 유의성은 Student's Hest에 의한 2-way ANOVA를 사용하여 검사하였다. 통계적 유의성은 方0。5를 기준으로 하였다.
성능/효과
- 확인하였다. FGF8b, BMP-4, Forskolin과 cGMP가 뚜렷하게 LC 노르아드레날린 성 뉴런에서 BDNF 분비를 촉진하였고, 이러한 인자들이 여러가지 신경퇴행성 질환에서 손상을 받는 LC 노르아드레날린 성 뉴런의 생존에 도움을 줄 수 있는 치료제나 증상 완화제로서의 가능성을 가짐을 제시하고 있다.
- Fig. 1에서 보듯이 중뇌의 locus coeruleus (LC) 부위와 노르아드레날린 성 세포주에서 기본적으로 분비되는 BDNF의 양을 측정한 결과, Img 단백질 당 81~85pg BDNF로 거의 동일하였고, 특히 노르아드레날린성 세포주는 여러 차례 계대 배양한 후 분비되는 BDNF의 양도 일정하게 유지됨을 확인하였다.
- 조절하는지의 여부를 조사하였다. Fig. 2에서 보듯이 24 시간동안 LC 노르아드레날린성 뉴런을 neuropeptides로 자극한 결과 neurotensine 약간 BDNF 분비를 감소시켰다 (17% 감소). Somatostatin과 ACTH, dynorphin 등은 별다른 영향을 주지 못했다.
- 따라서 노르아드레날린이나 glutamate가 보이는 흥분성 작용이 LC 노르아드레날린성 뉴런에서 BDNF의 분비를 증대시킴을 의미한다. Forskolin 과 cGMP 가 뚜렷하게 BDNF 분비를 증가시켰고 (50-60%), 비특이적 tyrosine kinase 저해제인 genistein과 dexamethasone, hydrogen peroxide 등은 별다른 효과를 보이지 않았다. Forskoline 노르아드레날린성 신경세포를 포함한 여러가지 종류의 신경세포에서 cAMP를 증가시키고, protein kinase A (PKA) 를 활성화시키는 기작을통해 신경세포의 생존을 증가시킨다고 보고되었다(13, 17, 18).
- FGF8b는 LC 부위에 존재하고 특히 노르아드레날린성 뉴런에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 중뇌의 발달에 관여한다04). LC의 노르아드레날린 성 뉴런에서 FGF8b가 작용하는 기능에 대해서 아직까지 명확하게 밝혀진 바가 없지만, 이 실험결과로 FGF8b가 LC 노르아드레날린성 뉴런에서 BDNF 분비를 조절하는 것으로 새롭게 밝혀졌다. Bone morphogenic protein (BMP)들은 많은 종류의 세포에서 분화를 시작하도록 유도한다고 알려져 있다.
- 결론적으로, 본 실험에서는 여러가지 작은 분자들과 성장인자들이 LC 노르아드레날린성 뉴런의 분화와 생존에 필요한 BDNF를 분비하도록 촉진한다는 사실을 확인하였다. FGF8b, BMP-4, Forskolin과 cGMP가 뚜렷하게 LC 노르아드레날린 성 뉴런에서 BDNF 분비를 촉진하였고, 이러한 인자들이 여러가지 신경퇴행성 질환에서 손상을 받는 LC 노르아드레날린 성 뉴런의 생존에 도움을 줄 수 있는 치료제나 증상 완화제로서의 가능성을 가짐을 제시하고 있다.
- BDNF는 LC 노르아드레날린 성 뉴런의 분화에 깊이 관여한다고 알려져 있으므로, BMP-4가 신경세포 분화를 유도하는 것이 BDNF를 많이 분비하게 하는 기작을 사용하는 것으로 볼 수 있다. 노르아드레날린 성 뉴런의 생존에 관여한다고 알려진 GDNF와 NT-3는 30-40%의 BDNF 분비 증가를 유도하였다.
- 3). 다양한 신호전달경로가 LC 노르아드레날린성 뉴런에서의 BDNF 발현과 분비에 관여하는 것으로 판정되었다. 노르아드레날린과 glutamate 는 BDNF 수준을 20-40% 정도 증가 시킨 반면, 도파민과 serotonin 은 13-25% 감소 시켰다.
- cGMP 유사체인 dibutyryl cGMP는 세포내에서 cGMP를 증가시키고 protein kinase G만 특이적으로 활성화시킨다(19). 따라서 이 결과는 cAMP, protein kinase A 그리고 protein kinase G가 LC 노르아드레날린성 뉴런에서 BDNF 분비에 중요한 역할을 담당한다고 볼 수 있다. 세포내로 Ca"을 유입시키는 Ca++ ionophore인 A23187은 가장 뚜렷하게 BDNF 분비를 억제시켰다(70% 감소).
- 05). 본 실험결과 놀랍게도 BMP-4는 2.5배 이상의 BDNF 분비 증대 효과를 보여주었다. BDNF는 LC 노르아드레날린 성 뉴런의 분화에 깊이 관여한다고 알려져 있으므로, BMP-4가 신경세포 분화를 유도하는 것이 BDNF를 많이 분비하게 하는 기작을 사용하는 것으로 볼 수 있다.
- 실험에 사용한 분자들로는 neuropeptides, cytokines, 성장인자, 신경전달물질들과 세포 내 신호전달물질들이 포함되었다. 여러가지 작은 분자들과 성장인자들 중에서 FGF8b, BMP-4, forskolin 그리고 dibutyryl cGMP가 LC 노르아드레날린성 뉴런에서 BDNF 분비를 뚜렷하게 증대시킨 것으로 판명되었다. 특히, BMP-4는 BDNF 생산을 2.
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