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문제 정의
- 그러나 benzoyl peroxide에 대한 기존의 독성자료를 검토한 결과 급성독성, 자극성, 과민성 및 피부 발암성 등에 대해서는 많은 연구가 수행되어 있으나, 무독성량(No Observed Adverse Effect Level, NOAEL)의 결정에 필요한 반복투여독성, 생식독성 및 발생독성에 대한 연구자료가 거의 없는 실정이다. 따라서 본 연구는 반복투여독성 및 생식/발생독성에 대한 신뢰성 있는 자료를 생산하고자 OECD에서 제안하고 있는 시험방법(OECD TG 422)에 따라 암수 랫트에 benzoyl peroxide# 28일 이상 반복 경구 투여하여 이에 따른 독성효과와 함께 생식·발생 독성영향을 평가하고자 수행하였다.
제안 방법
- 1일 1회 모든 동물에 대하여 사망여부를 관찰하였다.
- 각 관찰항목과 시험동물 투여는 GLP(Good Laboratory Practice) 규정과 OECD TG 422에 의거 수행하였고 다만, 신경독성항목의 평가는 해당 GLP 시설의 미운영으로 임상증상의 관찰 및 신경조직의 조직병리검사로 대체하였다.
- 관찰 시 피부와 털, 눈과 점막의 변화, 그 밖의 호흡기계, 순환기계, 자율신경 및 중추신경계, 전신운동성 및 행동패턴 등과 함께 경련, 유연, 설사, 졸림, 수면 및 혼수에 대해서도 관찰하였다.
- 이상이 관찰되지 않았다. 따라서 본 시험에서는 투여용량을 250, 500 및 1,000mg/kg/day으로 하여 시험을 실시하였고, 투여군당 암수 각 10마리를 공여하였다. 이와 함께 후속관찰을 위해 음성대조군 및 benzoyl peroxide 1, 000 mg/kg/day 투여군에 회복군을 암수 각 5마리씩 두었다.
- 8 ppm의 benzoyl peroxide를 섭취한 시험군에서 고환위축(testicular atrophy)이 나타났으나, 설정된 투여량은 통상의 인체 섭취량을 기준으로 산정하였고 구체적인 투여농도는 제시하지 않아 명확한 NOAEL 및 최소독성량(Lowest Observed Adverse Effect Level, LOAEL)을 산출할 수 없었다. 따라서 본 시험은 암수 랫트에 28일 이상 반복 경구투여 하여 반복 및 생식·발생독성을 알아보고 개략의 NOAEL을 산정하였다.
- 또한 모든 회복군의 육안적 병리검사를 실시하였다. 장기중량은 처리군별로 암수 각 5마리씩 선택하여 간장, 신장, 부신, 흉선, 비장, 뇌, 심장 등의 중량을 측정하였고, 특히 수컷의 경우 고환 및 부고환의 무게를 측정하였다.
- 부검시 모든 동물에 대해 육안적 병리검사를 실시하였고, 임신동물의 경우 착상수 및 황체수를 파악하였다.
- 분만태자의 체중은 분만 1일째 및 분만 3일째 측정하였다. 투여 15일째 암수 각각 1마리씩 1 : 1로 동거 개시한 후 질정검사를 통해 교미여부를 확인하였고, 교미가 확인된 날을임신 0일째로 하였다.
- 수컷은 교미전 14일간, 교미기간 14일간을 포함하여 총 29일간 연속투여 후 부검하였다. 암컷은 교미전 14일간, 교미기간 14일간, 임신기간 21일간, 분만 후 3일간을 포함하여 총 41일에서 51일간 투여 후 부검하였다.
- 신생자는 분만 후 24시간 이내에 외표검사를 통한 이상 유무를 관찰하였고 분만 3일째까지 성장 및 발달여부를 관찰하였다
- 암수의 체중은 부검 전까지 주 1회 측정하였고, 임신암컷의 경우 임신 0, 7, 14 및 20일에 측정하였다. 분만태자의 체중은 분만 1일째 및 분만 3일째 측정하였다.
- 연속투여 후 부검하였다. 암컷은 교미전 14일간, 교미기간 14일간, 임신기간 21일간, 분만 후 3일간을 포함하여 총 41일에서 51일간 투여 후 부검하였다. 음성 및 1,000 mg/kg/day 회복군은 최초 부체 및 모체동물의 부검 후 14일간 회복기를 거친 후 부검하였다.
- 음성 및 1,000 mg/kg/day 회복군은 최초 부체 및 모체동물의 부검 후 14일간 회복기를 거친 후 부검하였다. 양성대조물질의 용량은 이상소견이 관찰되는 용량인 4.5mg/kg/day 1개 투여군만을 두어 시험을 실시하였다. 음성대조군에는 corn oil만 투여하였고, 양성대조군에는 cyclophosphamide를 투여하였다.
- 암컷은 교미전 14일간, 교미기간 14일간, 임신기간 21일간, 분만 후 3일간을 포함하여 총 41일에서 51일간 투여 후 부검하였다. 음성 및 1,000 mg/kg/day 회복군은 최초 부체 및 모체동물의 부검 후 14일간 회복기를 거친 후 부검하였다. 양성대조물질의 용량은 이상소견이 관찰되는 용량인 4.
- 5mg/kg/day 1개 투여군만을 두어 시험을 실시하였다. 음성대조군에는 corn oil만 투여하였고, 양성대조군에는 cyclophosphamide를 투여하였다.
- 따라서 본 시험에서는 투여용량을 250, 500 및 1,000mg/kg/day으로 하여 시험을 실시하였고, 투여군당 암수 각 10마리를 공여하였다. 이와 함께 후속관찰을 위해 음성대조군 및 benzoyl peroxide 1, 000 mg/kg/day 투여군에 회복군을 암수 각 5마리씩 두었다. 투여방법은 1일 1회 경구 투여하였다.
- 장기중량은 처리군별로 암수 각 5마리씩 선택하여 간장, 신장, 부신, 흉선, 비장, 뇌, 심장 등의 중량을 측정하였고, 특히 수컷의 경우 고환 및 부고환의 무게를 측정하였다.
- 처리군별로 암수 각 5마리씩 선택하여 육안적 병변, 뇌 (대뇌, 소뇌, 뇌교부위), 척수, 위, 공장 및 회장(Peyer's patch포함), 간장, 기관, 폐, 자궁, 방광, 신장, 부신, 비장, 심장, 흉선, 갑상선, 림프절, 말초신경, 골수 등의 장기에 대한 조직병리검사를 실시하였고 수컷의 고환, 부고환 및 부생식선과 암컷의 난소를 고정하여 조직병리검사를 하였다.
- 분만태자의 체중은 분만 1일째 및 분만 3일째 측정하였다. 투여 15일째 암수 각각 1마리씩 1 : 1로 동거 개시한 후 질정검사를 통해 교미여부를 확인하였고, 교미가 확인된 날을임신 0일째로 하였다.
- 이와 함께 후속관찰을 위해 음성대조군 및 benzoyl peroxide 1, 000 mg/kg/day 투여군에 회복군을 암수 각 5마리씩 두었다. 투여방법은 1일 1회 경구 투여하였다.
- 혈액생화학적 검사항목으로는 혈당(GLU), 총콜레스테롤(TCHO), 요소(BUN), 크레아티닌(CRE), 총단백질(TP), 알부민(ALB), 알라닌-아미노트렌스퍼레이즈(ALT), 아스파테이트-아미노트렌스퍼레이즈(AST) 등을 측정하였다.
- 혈액학적 검사는 암수 모두 최종투여 종료 후 다음날 처리군별로 5마리씩 선택하여 복대 정맥으로부터 채혈하여 백혈구(WBC), 적혈구(RBC), 헤모글로빈농도(HGB), 적혈구용적(HCT), 혈소판(PLT) 등의 항목을 검사하였다. 혈액생화학적 검사항목으로는 혈당(GLU), 총콜레스테롤(TCHO), 요소(BUN), 크레아티닌(CRE), 총단백질(TP), 알부민(ALB), 알라닌-아미노트렌스퍼레이즈(ALT), 아스파테이트-아미노트렌스퍼레이즈(AST) 등을 측정하였다.
대상 데이터
- 10일간의 검역 및 적응기간 동안 체중증가 및 일반증상에 이상이 없는 건강한 동물을 시험에 사용하였다. 실험개시시의 체중범위는 수컷은 323.
- Benzoyl peroxide(Cl4H10O4, CAS No. 94-36-0, Sigma, Lot No. 60K3400)을 71.8% 순도로 구입하여 corn oil(Sigma, Lot No. 89H0149)에 넣어 균질화 한 후 랫트 체중 1 kg 당 5 ml 수준으로 경구 투여하였다. 양성대조물질로는 cyclophosphamide(Sigma, Lot No.
- 8% 및 12시간 자동조명으로 유지하였다. 시험기간 동안 방사선 멸균된 설치류 사료(PicoLab® Rodent Diet 20, 미국)와 필터 후 자외선 소독한 상수도수를 자유 섭취시켰고 실험동물 수용에는 스테인레스 재질의 철망케이지 및 폴리카보네이트 케이지를 사용하였다.
- 실험동물로는 7주령의 Sprague-Dawley 계통의 암수 랫트를 (주)바이오제노믹스에서 제공받아 사용하였다. 10일간의 검역 및 적응기간 동안 체중증가 및 일반증상에 이상이 없는 건강한 동물을 시험에 사용하였다.
- 89H0149)에 넣어 균질화 한 후 랫트 체중 1 kg 당 5 ml 수준으로 경구 투여하였다. 양성대조물질로는 cyclophosphamide(Sigma, Lot No. [08H0568)을 멸균 생리식염수에 녹여 사용하였다.
데이터처리
- (Left) male, recoveries (Right) female recoveries. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, onesided Student's t-test.
- 비모수적 데이터는 Kruskal-Wallis 검정을 실시한 후 유의성이 인정되면 Dunn's multiple comparison test를 실시하였다. 범주형 데이터는 자료의 정리로써 표현하거나 혹은 Two-sided Fisher's exact test를 실시하였다. 통계학적 유의성은 위험율 5%에서 검사하였다.
- comparison test를 실시하였다. 비모수적 데이터는 Kruskal-Wallis 검정을 실시한 후 유의성이 인정되면 Dunn's multiple comparison test를 실시하였다. 범주형 데이터는 자료의 정리로써 표현하거나 혹은 Two-sided Fisher's exact test를 실시하였다.
- 측정결과 중 모수적 데이터는 One-way ANOVA를 실시하였고, 검정 결과 유의성이 인정되면 Dunnett's multiple comparison test를 실시하였다. 비모수적 데이터는 Kruskal-Wallis 검정을 실시한 후 유의성이 인정되면 Dunn's multiple comparison test를 실시하였다.
성능/효과
- Benzoyl peroxide를 수컷은, 교미전 14일간, 교미기간 14일을 포함하여 총 29일간 반복 경구투여 하고, 암컷은 교미전 14일간, 교미기간 14일간, 임신기간 21일간, 분만 후 3일간을 포함하여 총 41일에서 51일간 1일 1회 반복 경구투여 한 결과 1,000 mg/kg/day 투여군의 모동물 및 신생 자로부터 독성 효과가 관찰되었다.
- 교배, 임신 및 분만: 교미기간, 교미율, 수태율, 줄산율, 출생률, 임신기간, 황체수, 착상수 및 착상전후 배·태자소실율에 있어서 시험물질에 의한 영향으로 판단되는 변화는 관찰되지 않았다. 그러나 1,000 mg/kg/day 투여군의 수태율이 음성대조군에 비하여 유의적으로 감소하였다.
- RBC, WBC, HGB 및 HCT 농도에서 시험물질에 의한 영향으로 판단되는 변화는 관찰되지 않았다. 그러나 1,000 mg/kg/day 수컷회복군의 RBC 및 WBC 농도는 음성대조군에 비하여 유의적으로 증가한 반면, 1,000 mg/kg/day 암컷회복군의 RBC 농도는 음성대조군에 비하여 유의적으로 감소하였고 HCT 농도는 증가하였다. 수컷의 혈액생화학적 분석 결과, TR ALB, ALT, CRE의 농도에서 시험물질에 의한 영향으로 판단되는 변화는 관찰되지 않았다.
- 신생자의 경우 benzoyl peroxide에 의한 출산수, 성비, 생존율 및 한배체중의 변화는 관찰되지 않았다. 그러나 부가병변에 속하는 미숙아(runt)의 출산율은 1,000 mg/kg/day 투여군에서 유의적으로 증가하였고, 분만 3일째 암수 신생자의 체중은 음성대조군에 비하여 유의적으로 감소하였다. 최고농도 투여군에서의 수태율이 음성대조군에 비하여 유의적으로 감소하였지만 시험계로 사용한 Sprague-Dawley 랫트의 일반적인 수태율인 88.
- 변화는 관찰되지 않았다. 그러나 분만 3일째 암수 신생자의 체중은 음성대조군에 비하여 용량의존적으로 감소하였고, 특히 1,000 mg/kg/day 투여군 암수 신생자의 체중은 유의적으로 감소하였다(Table 6).
- 따라서 benzoyl peroxide의 반복투여에 따른 모동물의 NOAEL과 생식독성에 대한 NOAEL은 각각 500 mg/kg/day로 추정되고, LOAEL은 1,000 mg/kg/day로 추정할 수 있었다. 또한 신생자 발생에 대한 NOAEL 및 LOAEL 도 각각 500 mg/kg/day 및 1,000 mg/kg/day로 추정할 수 있었다.
- 또한 교미기간, 교미율, 수태율, 줄생률, 임신기간, 황체 수, 착상수 및 착상전후 배·태자 소실율에 있어서 benzoyl peroxide에 의한 영향으로 판단되는 변화는 관찰되지 않았다. 신생자의 경우 benzoyl peroxide에 의한 출산수, 성비, 생존율 및 한배체중의 변화는 관찰되지 않았다.
- 있었다. 또한 신생자 발생에 대한 NOAEL 및 LOAEL 도 각각 500 mg/kg/day 및 1,000 mg/kg/day로 추정할 수 있었다.
- 병리소견: 수컷동물의 조직에 대한 현미경 관찰 결과 1,000 mg/kg/day 투여군의 고환 및 부고환에서 퇴행성 병변이 6례 관찰되었는데 그 중 1례에서 심각한 퇴행성 병변이 관찰되었으며 나머지 소견의 경우 미약한 병변으로 관찰되었다. 고환의 퇴행성 병변은 주로 정자세포가 변형된 형태로 관찰이 되었고 세포사멸(apoptosis)에서 보이는 일반적 소견(핵농축,핵분열 등)을 비롯하여 cellular swelling, multinucleated giant cell의 형성 등의 다양한 형태로 관찰되었다.
- 수컷 500 mg/kg/day 투여군과 암컷 1,000 mg/kg/day 투여군에서 각 례의 탈모 및 가피가 관찰되었고 암컷 500 mg/kg/day 투여군에서 2례의 탈모 및 가피가 관찰되었다. 수컷 500 mg/kg/day 투여군에서 시험물질 투여 후 토혈이 1례가 관찰되었으나 대조군과 비교하여 유의한 차이는 보이지 않았다.
- 수컷 500 mg/kg/day 투여군과 암컷 1,000 mg/kg/day 투여군에서 각 례의 탈모 및 가피가 관찰되었고 암컷 500 mg/kg/day 투여군에서 2례의 탈모 및 가피가 관찰되었다. 수컷 500 mg/kg/day 투여군에서 시험물질 투여 후 토혈이 1례가 관찰되었으나 대조군과 비교하여 유의한 차이는 보이지 않았다. 한편, 암컷 1,000 mg/kg/day 회복군에서 설사 및 뇨에 의한 생식기의 오염이 2례 관찰되었다.
- 수컷의 경우 고환 및 부고환의 무게가 유의적으로 감소하였고, 이는 투여물질에 의한 고환 및 부고환의 퇴행성병변에 의하여 유발된 것으로 판단되었다. 암컷의 경우 경미한 생식기관 조직의 이상이 관찰되었다.
- 그러나 1,000 mg/kg/day 수컷회복군의 RBC 및 WBC 농도는 음성대조군에 비하여 유의적으로 증가한 반면, 1,000 mg/kg/day 암컷회복군의 RBC 농도는 음성대조군에 비하여 유의적으로 감소하였고 HCT 농도는 증가하였다. 수컷의 혈액생화학적 분석 결과, TR ALB, ALT, CRE의 농도에서 시험물질에 의한 영향으로 판단되는 변화는 관찰되지 않았다. 암컷에서는 TP ALB, ALT BUN, CRE, TCHO,GLU의 농도에서 시험물질에 의한 영향으로 판단되는 변화는 관찰되지 않았으나 250 mg/kg/day 투여군의 ALT의 농도는 음성대조군에 비하여 유의적으로 감소하였다(Table 4).
- 시험계로 사용한 Sprague-Dawley 랫트의 일반적인 수태율인 88.6%를 상회하여 시험물질에 의한 영향으로 판단되지 않았다(Table 6).
- 시험과정의 신뢰성을 위해 양성대조물질인 cyclophosphamide 4.5 mg/kg/day를 암수에 반복 경구투여 한 결과, 수컷의 비장 무게와 백혈구의 수가 음성대조군에 비하여 유의적으로 감소하였고 착상 후 태자소실율, 출생수 및 신생자의 체중이 음성대조군에 비하여 유의적으로 감소하였다. 이러한 소견은 기존의 연구결과와 유사하였으며 본 시험의 신뢰성을 뒷받침하여 준다(Tanaka 등, 1992).
- 수컷의 혈액생화학적 분석 결과, TR ALB, ALT, CRE의 농도에서 시험물질에 의한 영향으로 판단되는 변화는 관찰되지 않았다. 암컷에서는 TP ALB, ALT BUN, CRE, TCHO,GLU의 농도에서 시험물질에 의한 영향으로 판단되는 변화는 관찰되지 않았으나 250 mg/kg/day 투여군의 ALT의 농도는 음성대조군에 비하여 유의적으로 감소하였다(Table 4).
- 양성대조군의 경우 암컷에서 임신기간 중의 체중증가량이 음성대조군에 비하여 유의적으로 감소하였고 1,000 mg/kg/day 암컷 회복군의 경우 투여 29일째부터 음성회복군에 비해 유의적인 체중의 증가가 관찰되었다(Figs. 1, 2와 3). 수컷 1,000 mg/kg/day 투여군에서 투여 1주 및 4주째의 사료 섭취량이 음성대조군에 비하여 유의적으로 증가하였고, 이외의 투여군은 정상적인 사료섭취량을 나타내었다.
- 외표검사: 신생자의 외표를 관찰한 결과, 250 mg/kg/ day 투여군에서 주요 병변에 속하는 척수골폐쇄부전(Spina bifida)이 1례 발생하였으나 음성대조군과의 유의성은 나타나지 않았다. 그리고 부가병변에 속하는 미숙아 (Runt)는 음성대조군, 250, 500, 1,000 mg/kg/day 투여군 및 양성대조군에서 각각 20, 20, 18, 60 및 8례가 발생하였고, 1,000 mg/kg/day 투여군 및 양성대조군의 부가병변 발생율이 음성대조군에 비하여 유의적으로 증가하였다.
- 이와 같은 결과를 종합하면 benzoyl peroxide를 1,000 mg/kg/day 용량으로 반복 경구 투여한 결과 고환 및 부고환을 포함하는 수컷 랫트의 생식기관에 독성효과가 있는 것으로 판단되며, 미숙아의 출산율과 함께 신생자의 정상적인 발육을 저해하는 효과가 있는 것으로 판단되었다.
- 장기중량: 수컷의 장기중량을 측정한 결과 1,000 mg/kg/day 투여군의 좌측 고환의 절대중량 및 상대중량과 부고환의 상대중량은 음성대조군에 비하여 유의적으로 감소하였다. 기타 장기의 절대중량 및 상대중량에서 시험물질에 의한 영향으로 판단되는 변화는 관찰되지 않았다(Table 2).
- 체중의 변화 및 사료섭취량: 암수 모두 시험기간 동안 전 투여군에서 정상적인 체중변화가 관찰되었다. 양성대조군의 경우 암컷에서 임신기간 중의 체중증가량이 음성대조군에 비하여 유의적으로 감소하였고 1,000 mg/kg/day 암컷 회복군의 경우 투여 29일째부터 음성회복군에 비해 유의적인 체중의 증가가 관찰되었다(Figs.
- 출산수, 성비 및 생존율: 출산수, 성비, 분만 1일 및 3일째 생존율에 있어 시험물질에 의한 영향으로 판단되는 변화는 관찰되지 않았다(Table 6).
- 투여량 설정을 위한 예비시험에서 benzoyl peroxide를 0, 250, 500, 1,000 및 2,000mg/kg/day의 용량으로 시험군당 암수 각 3마리를 대상으로 10일간 경구 투여한 결과 임상증상, 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사 및 부검소견에서 이상이 관찰되지 않았다. 따라서 본 시험에서는 투여용량을 250, 500 및 1,000mg/kg/day으로 하여 시험을 실시하였고, 투여군당 암수 각 10마리를 공여하였다.
- 혈액-생화학적 분석 결과 1,000 mg/kg/day 투여군에서 대조군에 비해 유의한 변화가 관찰되었지만 용량상관성이나 관련장기에 대한 육안 및 조직병리와의 연관성이 없는자연 발생적인 결과로 판단된다.
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