본 실험에서는 C형 간염바이러스 (HCV)의 외피 단백질인 E2 당단백질에 결합하는 세포단백질들을 클로닝하기 위해 간세포 cDNA를 phage 표면에 발현시킨 phage library를 제작하였고, 12-mer peptide library와 함께 E2 단백질에 대해 panning을 실시하였다. 검색결과 세포내 신호전달과 cytoskeleton 구성에 관여하는 tensin, membrane protein band 4.1 등 세포질내 단백질과 CCR7, CKR-L2, insulin-like growth factor-1receptor 등 세포막 단백질 등이 확인되었다. 이들 단백질들을 발현하는 phage들은 수용성 E2단백질을 이용한 결합중화반응 결과 E2 단백질에 특이적으로 결합함이 확인되었다. 사람 T 세포에서 주로 발현되는 CCR7 유전자를 PHA로 활성화된 사람 T 세포의 total RNA를 이용하여 증폭하고 클로닝하였다. 293T 세포에 transfection시켜 단백질 발현양상을 flow cytometer로 분석하여 70% 이상의 세포들이 CCR7을 발현하고 있음을 관찰하였다. 수용성 E2 단백질을 CCR7이 transfection된 세포와 mock transfection된 대조군 세포에 각각 반응시킨 결과 dose-dependent 양상으로 CCR7에 결합하였다.
본 실험에서는 C형 간염바이러스 (HCV)의 외피 단백질인 E2 당단백질에 결합하는 세포단백질들을 클로닝하기 위해 간세포 cDNA를 phage 표면에 발현시킨 phage library를 제작하였고, 12-mer peptide library와 함께 E2 단백질에 대해 panning을 실시하였다. 검색결과 세포내 신호전달과 cytoskeleton 구성에 관여하는 tensin, membrane protein band 4.1 등 세포질내 단백질과 CCR7, CKR-L2, insulin-like growth factor-1 receptor 등 세포막 단백질 등이 확인되었다. 이들 단백질들을 발현하는 phage들은 수용성 E2단백질을 이용한 결합중화반응 결과 E2 단백질에 특이적으로 결합함이 확인되었다. 사람 T 세포에서 주로 발현되는 CCR7 유전자를 PHA로 활성화된 사람 T 세포의 total RNA를 이용하여 증폭하고 클로닝하였다. 293T 세포에 transfection시켜 단백질 발현양상을 flow cytometer로 분석하여 70% 이상의 세포들이 CCR7을 발현하고 있음을 관찰하였다. 수용성 E2 단백질을 CCR7이 transfection된 세포와 mock transfection된 대조군 세포에 각각 반응시킨 결과 dose-dependent 양상으로 CCR7에 결합하였다.
E2 glycoprotein of hepatitis C virus (HCV) comprises a surface of viral particle together with E1 glycoprotein, and is thought to be involved in the attachment of HCV viral particle to receptor (s) on the permissible cells including hepatocytes, B cells, T cells, and monocytes. We constructed a phag...
E2 glycoprotein of hepatitis C virus (HCV) comprises a surface of viral particle together with E1 glycoprotein, and is thought to be involved in the attachment of HCV viral particle to receptor (s) on the permissible cells including hepatocytes, B cells, T cells, and monocytes. We constructed a phage library expressing cellular proteins of hepatocytes on the phage surface, which turned out to be 8.8${\times}$$10^5$ cfu of diversity and carried inserts in 95% of library. We screened both cDNA phage library and 12-mer peptide library to identify the cellular proteins binding to E2 protein. Some intracellular proteins including tensin and membrane band 4.1 which are involved in signal transduction of survival and cytoskeleton organization, were selected from cDNA phage library through several rounds of panning and screening. On the contrary, membrane proteins such as CCR7, CKR-L2, and insulin-like growth factor-1 receptor were identified through screening of peptide library. Phages expressing peptides corresponding to those membrane proteins were bound to E2 protein specifically as determined by neutralization of binding assay. Since it is well known that HCV can infect T cells as well as hepatocytes, we examined to see if E2 protein can bind to CCR7, a member of C-protein coupled receptor family expressed on T cells, using CCR7 transfected tells. Human CCR7 cDNA was cloned into pcDNA3.1(-) vector and transfected into human embryonic kidney cell, 293T, and expressed on the surface of the cell as shown by flow cytometer. Binding assay of E2 protein using CCR7 transfected cells indicated that E2 protein bound to CCR7 by dose-dependent mode, giving rise to the possibility that CCR7 might be a putative cellular receptor for HCV.
E2 glycoprotein of hepatitis C virus (HCV) comprises a surface of viral particle together with E1 glycoprotein, and is thought to be involved in the attachment of HCV viral particle to receptor (s) on the permissible cells including hepatocytes, B cells, T cells, and monocytes. We constructed a phage library expressing cellular proteins of hepatocytes on the phage surface, which turned out to be 8.8${\times}$$10^5$ cfu of diversity and carried inserts in 95% of library. We screened both cDNA phage library and 12-mer peptide library to identify the cellular proteins binding to E2 protein. Some intracellular proteins including tensin and membrane band 4.1 which are involved in signal transduction of survival and cytoskeleton organization, were selected from cDNA phage library through several rounds of panning and screening. On the contrary, membrane proteins such as CCR7, CKR-L2, and insulin-like growth factor-1 receptor were identified through screening of peptide library. Phages expressing peptides corresponding to those membrane proteins were bound to E2 protein specifically as determined by neutralization of binding assay. Since it is well known that HCV can infect T cells as well as hepatocytes, we examined to see if E2 protein can bind to CCR7, a member of C-protein coupled receptor family expressed on T cells, using CCR7 transfected tells. Human CCR7 cDNA was cloned into pcDNA3.1(-) vector and transfected into human embryonic kidney cell, 293T, and expressed on the surface of the cell as shown by flow cytometer. Binding assay of E2 protein using CCR7 transfected cells indicated that E2 protein bound to CCR7 by dose-dependent mode, giving rise to the possibility that CCR7 might be a putative cellular receptor for HCV.
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제안 방법
사람 T 세포에서 주로 발현되는 CCR7 유전자를 PHA로 활성화된 사람 T 세포의 total RNA를 이용하여 증폭하고 클로닝하였다. 293T 세포에 transfection시켜 단백질 발현양상을 flow cytometer로 분석하여 70% 이상의 세포들이 CCR7을 발현하고 있음을 관찰하였다. 수용성 E2 단백질을 CCR7이 transfection된 세포와 mock transfection된 대조군 세포에 각각 반응시킨 결과 dose-dependent 양상으로 CCR7에 결합하였다.
0)와 실온에서 30분간 반응시킨 혼합액을 이용하여 인간 태아 신장세포인 293T 세포에 transfection하였다. 2일 후에 transfection된 세포들을 회수하여 anti-human CCR7 항체 (R&D system, USA) 와 phycoerythrin (PE) conjugated antimouse IgG (Becton Dickinson, USA)를 각각 일차와 이차 항체로 반응시키고, flow cytometer로 관찰한 다음, Cell Quest 프로그램(Becton Dickinson, USA)을 이용하여 CCR7 발현 여부를 분석하였다. 위 반응은 모두 4℃에서 30분간씩 시행하였으며, 3% FBS/PBS buffer로 세포들을 세척하였다.
5×106 T 세포를 5 ㎍/ml phyto-hemagglutin (PHA)이 첨가된 10% FBS/RPMI 배지에서 2 일간 배양한 후 total RNA를 RNeasy column (Qiagen, USA)을 이용하여 정제하였다. 3 ㎍의 total RNA와 200 unit의 역전사효소(SuperScript Ⅱ, Stratagene, USA)를 42℃에서 1시간 반응시켜 first strand cDNA를 제작하였다. 사람 CCR7의 ORF는 forward primer: 5'-ACTGAATTCAT- GGACCTGGGGAAA-3', reverse primer: 5'-ACTAAGCT- TCTATGGGGAGAAGGTGG-3' 를 이용한 PCR 반응으로 증폭시켰다.
세포를 분리하였다. 5×106 T 세포를 5 ㎍/ml phyto-hemagglutin (PHA)이 첨가된 10% FBS/RPMI 배지에서 2 일간 배양한 후 total RNA를 RNeasy column (Qiagen, USA)을 이용하여 정제하였다. 3 ㎍의 total RNA와 200 unit의 역전사효소(SuperScript Ⅱ, Stratagene, USA)를 42℃에서 1시간 반응시켜 first strand cDNA를 제작하였다.
4 kb되게 만들었다. 9종류의 phagemid 벡터에 cDNA library을 ligation한 후 electroporation으로 transfoimation을 시행하였다. 최종 8.
1 ㎍ 서로 다른 9종류의 sense, anti-sense primer 조합을 각각 10 pM씩 사용하고 premixTop (Bioneerz Korea) PCR kit를 이용하여 94℃- 5 분; 94℃-30초, 55℃-30초, 72℃-1분씩 35 cycle; 72℃-10분의 조건으로 PCR을 시행하였다. Agarose 젤에서 전기영동하여 증폭된 벡터 크기를 확인한 후 gel elution (Qiagen gel elution kit, USA)을 시행하였다.
library (Clontech, USA)로부터 얻었다. BglⅡ site에 클로닝 되어 있는 cDNA library를 BglⅡ로 절단하고 전기영동 하여 04 kb이하 부위와 그 이상 부위를 각각 구별하여 DNA를 용출하였다. 0.
사람 CCR7의 ORF는 forward primer: 5'-ACTGAATTCAT- GGACCTGGGGAAA-3', reverse primer: 5'-ACTAAGCT- TCTATGGGGAGAAGGTGG-3' 를 이용한 PCR 반응으로 증폭시켰다. CCR 7 유전자를 Eco RI과 Hin dill로 처리하여 동일 효소로 처리된 pcDNA 3.1(-) 벡터에 클로닝하였다. CCR7 유전자가 확인된 클론의 DNA를 대량으로 정제하여 transfection에 사용하였다.
RT-PCR 반응으로 1,137 bp의 CCR7전체 유전자를 증폭시켰고, 이를 동물세포 발현 벡터에 클로닝하였다. CCR7 유전자가 확인된 재조합 plasmid를 calcium phosphate 법으로 293T 세포에 transfection 시킨 다음, 2일 후 CCR7의 발현을 조사하였다. Mock trans-fection된 대조군과 비교하여 70% 이상의 세포에서 CCR7 이 세포표면에 발현되고 있었다(Fig.
CCR7이 발현된 5×105의 293T 세포와 동일한 수의 mock transfection된 대조군 세포에 각각 4.5, 1.5, 0.5 ㎍의 E2 단백질을 첨가하여 반응시켰다. 부착된 E2 단백질은 anti-E2 단세포군 항체(Dubuisson J, Institue de Lille로부터 분양받음)와 PE conjugated anti-mouse IgG를 이용하여 flow cytometer로 확인하였으며, 반응은 위에서 언급한 동일한 조건으로 실시하였다.
CIAP가 처리된 9종류의 pG8 벡터 DNA (400 ng) 각 각에 BglⅡ/Sau 3AI으로 절단된 간세포 cDNA (1 ㎍)를 4℃ 에서 16시간동안 ligation시켰다. 에탄올로 DNA를 침전시키고 10 µl의 증류수에 녹인 후 E.
ELISA에서 양성으로 확인되고, E2 단백질에 특이적으로 결합하는 phagemid 클론을 골라서 염기서열을 결정하였다. Sequencing primer로는 벡터 염기서열인 5'-CACGA- CGAAAAACGACGG-3'를 이용하였다.
Filamentous phage 벡터(pG8SAET)에 cDNA가 inframe으로 클로닝될 수 있도록 변형된 9종류의 pG8 벡터를 제작하였고, 클로닝 부위의 염기서열을 확인한 후library제작에 사용하였다. 간세포 cDNA library는 human fetal liver matchmaker cDNA library를 BglⅡ로 절단하여 얻었다.
Filamentous phage의 표면단백질인 pVHI에 융합된 형태로 단백질을 발현하는 pG8SAET 벡터에 모든 cDNA가 imframe으로 발현되도록 클로닝 부위를 변형시켰다(Fig. 1). 클로닝 부위의 Neo I 과 Sna BI을 각각 BglⅡ로 바꾸기 위해 BglⅡ 인식부위를 포함하고 nucleotide가 한 개씩 혹은 두 개씩 추가되어 frame shift된 primer를 제작하였다.
다시 한 시간 동안 37℃에서 진탕배양한 뒤,helper phage M13KO7 (1012 plaque forming unit pfu)을첨가하고, 2시간 동안 배양한 후 원침시켰다. Kanamycin (70 ㎍/ml)이 첨가된 SB 배지 (SB-kan) 100 ml로 원침된 세포를 부유시켜, 37℃에서 16시간 동안 진탕배양하여 phage rescue를 시행하였다. 배양액을 4,000rpm으로 15분간 원심 분리한 다음, phage를 포함하는 상청 액을 수집함으로써 간세포 cDNA가 발현된 phage library를 최종 확보하였다.
coli XL1-Blue에 tiansformation시켰다. Miniprep으로 회수한 각 벡터 DNA의 클로닝 부위는 염기서열 결정을 통해 확인하였다. 벡터를 BglⅡ로 절단하고alkaline phosphatase (CIAPZ 1 unit)를 처리하여 간세포 cDNA library를 만드는 template 벡터로 사용하였다.
또한 Echovirus 22에 대한 세포 수용체 integrin β1 chain과 matrix metalloproteinase 9를 확인하는데 이용되어 수용체 연구에 사용가능성이 제기된peptide library [20]를 통해 E2 단백질에 결합하는 peptide를 검색하였다. Peptide의 경우 SwissProt 아미노산 데이터베이스를 검색하여 연관된 세포단백질을 결정하였다. E2 단백질에 결합이 예상되는 세포단백질 중에서 세포 표면에 발현되는 CCR7을 클로닝하여 동물세포에서 발현시킨 다음, E2 결합반응을 시행한 결과 CCR7이 E2 결합에 관여하고 있음을 확인하였다.
16시간 동안 37℃에서 배양한 다음, plate를 800×g에서 10 분간 원심 분리하였다. Phage가 들어있는 상청액 50 µl만을 이용하여 E2 단백질에 대한 ELISA를 시행하였다. Microtiter plate의 각 well에 1 ㎍/ml의 E2 단백질을 panning 단계에서 사용한 동일한 조건으로 부착시키고 blocking하였다.
이용하였다. RT-PCR 반응으로 1,137 bp의 CCR7전체 유전자를 증폭시켰고, 이를 동물세포 발현 벡터에 클로닝하였다. CCR7 유전자가 확인된 재조합 plasmid를 calcium phosphate 법으로 293T 세포에 transfection 시킨 다음, 2일 후 CCR7의 발현을 조사하였다.
사용하였다. 각 panning의 회수결정은 pannin응에 사용한 input phage와 E2 단백질에 결합된 뒤 용출되는 output phage의 비율(O/I ratio)이 정점에 이르는 단계와 각 단계에서 회수한 phage로 E2 단백질에 대한 ELISA를 실시하여 더 이상의 signal 증가가 없는 단계까지로 하였다. Peptide library는 2차 panning 단계에서부터 O/I ratio가 증가하여 4차 단계에서 최대 ratio를 보였으며, cDNA phage library는 7차에서 O/I ratio가 최대이었다(Table 1).
coli XL1-BIue에 electroporator (Gene Pulser Ⅱ, BioRad, USA)를 사용하여 transformation하였다. 균에 SOC 배지 [SB배지 (30g of tryptonz 20g of yeast extract, 10g of MOPS per liter, pH 7.0), 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 0.2% Glucose]를 3 ml첨가하고, 37℃에서 한 시간 동안 진탕배양한 다음, ampicillin (50 ㎍/ml)을 포함하는 SB 배지(SB-amp) 10 ml을 첨가하였다. 다시 한 시간 동안 37℃에서 진탕배양한 뒤,helper phage M13KO7 (1012 plaque forming unit pfu)을첨가하고, 2시간 동안 배양한 후 원침시켰다.
대조군 세포와 CCR7 유전자가 transfection된 293T 세포에 대해 E2 단백질 결합여부를 확인하였다. E2 단백 질 양을 titration하여 반응시켰을 경우 dose-dependent mode로 CCR7 발현세포에 결합하였다.
질을 검색하였다. 또한 Echovirus 22에 대한 세포 수용체 integrin β1 chain과 matrix metalloproteinase 9를 확인하는데 이용되어 수용체 연구에 사용가능성이 제기된peptide library [20]를 통해 E2 단백질에 결합하는 peptide를 검색하였다. Peptide의 경우 SwissProt 아미노산 데이터베이스를 검색하여 연관된 세포단백질을 결정하였다.
클로닝 부위의 Neo I 과 Sna BI을 각각 BglⅡ로 바꾸기 위해 BglⅡ 인식부위를 포함하고 nucleotide가 한 개씩 혹은 두 개씩 추가되어 frame shift된 primer를 제작하였다. 먼저 pG8SAET 벡터 DNA 0.1 ㎍ 서로 다른 9종류의 sense, anti-sense primer 조합을 각각 10 pM씩 사용하고 premixTop (Bioneerz Korea) PCR kit를 이용하여 94℃- 5 분; 94℃-30초, 55℃-30초, 72℃-1분씩 35 cycle; 72℃-10분의 조건으로 PCR을 시행하였다. Agarose 젤에서 전기영동하여 증폭된 벡터 크기를 확인한 후 gel elution (Qiagen gel elution kit, USA)을 시행하였다.
Kanamycin (70 ㎍/ml)이 첨가된 SB 배지 (SB-kan) 100 ml로 원침된 세포를 부유시켜, 37℃에서 16시간 동안 진탕배양하여 phage rescue를 시행하였다. 배양액을 4,000rpm으로 15분간 원심 분리한 다음, phage를 포함하는 상청 액을 수집함으로써 간세포 cDNA가 발현된 phage library를 최종 확보하였다.
Miniprep으로 회수한 각 벡터 DNA의 클로닝 부위는 염기서열 결정을 통해 확인하였다. 벡터를 BglⅡ로 절단하고alkaline phosphatase (CIAPZ 1 unit)를 처리하여 간세포 cDNA library를 만드는 template 벡터로 사용하였다. PCR에 사용한 primer의 염기서열은 다음과 같다.
벡터에 특이적인 primer를 이용하여 각 클론의 염기서열을 결정한 후 NCBI의 BLAST program을 이용하여 유사한 유전자들을 분석하였다. Table 2에서와 같이 peptide library로부터는 세포막 단백질인 insulin-like growth factor-1 receptor, prolactin receptor, 그리고 신호전달과정 에 관여 하는 CKR-L2와 CCR7 단백질 등이 확인되었다.
본 실험에서는 C형 간염바이러스 (HCV)의 외피 단백질인 E2 당단백질에 결합하는 세포단백질들을 클로닝하기위해 간세포 cDNA를 phage 표면에 발현시킨 phage library를 제작하였고, 12-mer peptide library와 함께 E2 단백질에 대해 panning을 실시하였다. 검색결과 세포 내 신호전달과 cytoskeleton 구성에 관여하는 tensin, membrane protein band 4.
본 실험에서는 간세포 cDNA phage library와 peptide library를 검색하여 E2 단백질에 결합하는 단백질들을 검색하였다. cDNA phage library의 경우 phage 표면에 발현시키기 위해 cDNA의 크기를 0.
본 실험에서는 표적단백질에 결합하는 단백질 domain 을 검색하는데 많이 사용되고 있는 phage display 기법을 이용하여 간세포 cDNA library를 phage 표면에 발현시킨 phage library를 이용하여 HCV의 E2 단백질에 결합하는 세포 단백 질을 검색하였다. 또한 Echovirus 22에 대한 세포 수용체 integrin β1 chain과 matrix metalloproteinase 9를 확인하는데 이용되어 수용체 연구에 사용가능성이 제기된peptide library [20]를 통해 E2 단백질에 결합하는 peptide를 검색하였다.
5 ㎍의 E2 단백질을 첨가하여 반응시켰다. 부착된 E2 단백질은 anti-E2 단세포군 항체(Dubuisson J, Institue de Lille로부터 분양받음)와 PE conjugated anti-mouse IgG를 이용하여 flow cytometer로 확인하였으며, 반응은 위에서 언급한 동일한 조건으로 실시하였다.
3 ㎍의 total RNA와 200 unit의 역전사효소(SuperScript Ⅱ, Stratagene, USA)를 42℃에서 1시간 반응시켜 first strand cDNA를 제작하였다. 사람 CCR7의 ORF는 forward primer: 5'-ACTGAATTCAT- GGACCTGGGGAAA-3', reverse primer: 5'-ACTAAGCT- TCTATGGGGAGAAGGTGG-3' 를 이용한 PCR 반응으로 증폭시켰다. CCR 7 유전자를 Eco RI과 Hin dill로 처리하여 동일 효소로 처리된 pcDNA 3.
이들 단백질들을 발현하는 phage들은 수용성 E2 단백질을 이용한 결합중화반응 결과 E2 단백질에 특이적으로 결합함이 확인되었다. 사람 T 세포에서 주로 발현되는 CCR7 유전자를 PHA로 활성화된 사람 T 세포의 total RNA를 이용하여 증폭하고 클로닝하였다. 293T 세포에 transfection시켜 단백질 발현양상을 flow cytometer로 분석하여 70% 이상의 세포들이 CCR7을 발현하고 있음을 관찰하였다.
선택된 phage 클론들이 E2 단백질에 특이적으로 결합하는지를 조사하기 위해 competitive ELISA를 시행하였다. 위에서 언급한 동일한 조건으로 ELISA plate에 E2 단백질을 부착시키고 blocking하였다.
05% Tween 20/TBS로 5회에 걸쳐 well을 세척하였다. 세척회수는 panning이 진행될수록 증가시켜 2차 panning 때는 10회/3차 panning 때는 20회, 4차 panning 때는 40회 시행하였으며, 이후의 panning에서는 40회 세척을 유지하였다. 세척 후 50 µl의 trypsin 용액(10 ㎎/ml)을 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시켜 E2 단백질에 결합된 phage를 용출하였다.
10 ㎍/ml의 E2 단백질과 양성 반응을 보인 peptide phage (5×1010)를 4℃에서 1시간 반응시킨 다음, E2 단백질이 부착된 well에 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 이후 위와 동일한 조건으로 항체를 반응시키고 발색반응을 유도하였다.
45 ㎛ 주사기 fiiter로 여과시켜 다음 번 panning에 사용하였다. 최종 panning단계에서 용출된 phage를 ER2537에 감염시킨 다음 LB/amp plate에 접종하여 콜로니 형태로 확보하였다.
2A). 최종적으로 HCV E2 binder를 검색하기 위해 4차와 7차 단계에서 회수한 각각의 peptide 혹은 cDNA phage clone을 이용하여 E2 단백질에 대한 ELISA를 실시하여, 각각 7개와 8개의 반응성이 높은 클론들을 확보하였다(Fig. 2B). 이들 클론의 특이도를 검증하기 위해 10 ㎍/ml의 수용성 E2 단백질을 competitor로 하여 phage와 함께 혼합한 후 E2 단백질에 대해 ELISA를 시행한 결과, 대부분의 클론들이 20-40%씩 결합이 방해되었다(Fig.
1). 클로닝 부위의 Neo I 과 Sna BI을 각각 BglⅡ로 바꾸기 위해 BglⅡ 인식부위를 포함하고 nucleotide가 한 개씩 혹은 두 개씩 추가되어 frame shift된 primer를 제작하였다. 먼저 pG8SAET 벡터 DNA 0.
1(-) 벡터에 클로닝하였다. CCR7 유전자가 확인된 클론의 DNA를 대량으로 정제하여 transfection에 사용하였다. 먼저 10 ㎍의 plasmid와 250 mM calcium chloride를 혼합한 후 동량의 2x HEPES (pH7.
E2 단백질에 결합하는 간세포 cDNA와 peptide를 확인하기 위하여 cDNA phage library와 12-mer peptide library를 사용하였다. 각 panning의 회수결정은 pannin응에 사용한 input phage와 E2 단백질에 결합된 뒤 용출되는 output phage의 비율(O/I ratio)이 정점에 이르는 단계와 각 단계에서 회수한 phage로 E2 단백질에 대한 ELISA를 실시하여 더 이상의 signal 증가가 없는 단계까지로 하였다.
E2 단백질은 Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포주에서 발현시켜 정제한 E2 단백질을 Chiron사(CA, USA)로부터 분양받아 실험에 사용하였다. 본 실험을 통해 사용한 E2 단백질은 native form을 형성하는 단백질이다[19].
간세포 cDNA library는 human fetal liver matchmaker cDNA library (Clontech, USA)로부터 얻었다. BglⅡ site에 클로닝 되어 있는 cDNA library를 BglⅡ로 절단하고 전기영동 하여 04 kb이하 부위와 그 이상 부위를 각각 구별하여 DNA를 용출하였다.
제작하였고, 클로닝 부위의 염기서열을 확인한 후library제작에 사용하였다. 간세포 cDNA library는 human fetal liver matchmaker cDNA library를 BglⅡ로 절단하여 얻었다. pG8SAET를 이용하여 phage 표면에 단백질을 발현시킬 경우 평균 발현되는 단백질의 분자량은 11 kDa이므로 0.
분양받아 실험에 사용하였다. 본 실험을 통해 사용한 E2 단백질은 native form을 형성하는 단백질이다[19].
본 연구에서는 cDNA library의 발현 vehicle로 filamentous phagemid인 pG8SAET 벡터를 사용하였다. Phage display 기법은 phage 표면에 발현된 단백질과 이를 coding 하는 유전자가 한 unit로 phage를 구성하고 있어서 원하는 phenotype을 보이는 phage를 선택함과 동시에 유전자를 확보하게 되며, biopanning 과정을 통해 한번에 107 이상의 library를 검색하는 high throughput screening이 가능하고, 동시에 panning과정을 반복할수록 특이도가 높은 phage를 증폭시킬 수 있는 장점 때문에 antibody library나 peptide library의 제작에 많이 이용되어 왔다.
주로 T 세포에서 발현되는 CCR7 단백질 유전자를 클로닝 하기 위하여 활성화된 인간 T 림프구로부터 정제된 total RNA를 이용하였다. RT-PCR 반응으로 1,137 bp의 CCR7전체 유전자를 증폭시켰고, 이를 동물세포 발현 벡터에 클로닝하였다.
데이터처리
Sequencing primer로는 벡터 염기서열인 5'-CACGA- CGAAAAACGACGG-3'를 이용하였다. 결정된 염기서열은 NCBI의 BLAST 프로그램을 이용하여 분석하였다.
성능/효과
Peptide의 경우 SwissProt 아미노산 데이터베이스를 검색하여 연관된 세포단백질을 결정하였다. E2 단백질에 결합이 예상되는 세포단백질 중에서 세포 표면에 발현되는 CCR7을 클로닝하여 동물세포에서 발현시킨 다음, E2 결합반응을 시행한 결과 CCR7이 E2 결합에 관여하고 있음을 확인하였다.
Table 2에서와 같이 peptide library로부터는 세포막 단백질인 insulin-like growth factor-1 receptor, prolactin receptor, 그리고 신호전달과정 에 관여 하는 CKR-L2와 CCR7 단백질 등이 확인되었다. cDNA phage library로 부터는 신호전달과정과 actin filament 이동과 재구성에 관여하는 tensir과 membrane protein band 4.1 이 클로닝되었으며, 간세포대사에 관여하는 단백질 등이 확인되었다.
대해 panning을 실시하였다. 검색결과 세포 내 신호전달과 cytoskeleton 구성에 관여하는 tensin, membrane protein band 4.1 등 세포질내 단백질과 CCR7, CKR-L2, insulin-like growth factor-1 receptor 등 세포막 단백질 등이 확인되었다. 이들 단백질들을 발현하는 phage들은 수용성 E2 단백질을 이용한 결합중화반응 결과 E2 단백질에 특이적으로 결합함이 확인되었다.
본 실험에서는 7개의 peptide 클론중에서 4개의 클론이 세포막 단백질의 서열과 일치하고 있었다. 또한 이들의 이차구조를 분석하는 TMHMM server v 2.0 프로그램으로 분석한 결과, E2 단백질에 결합하는 peptide는 이들 세포막 단백질의 세포막 외부(extracellular domain)의 서열과 일치하고 있어서 이들이 E2 단백질에 결합하는 세포막 단백질임을 간접적으로 확인할 수 있었다(Table 2).
이 단백질은 구조상 7개의 세포막내 소수성 부위를 지니고 있어서 바이러스-수용체 복합체를 형성한 후 세포내로 internalization될 가능성은 매우 낮지만 actin filament를 재구성하는데 필요한 신호전달을 매개하므로 다른 수용체 혹은 보조 수용체의 재구성을 촉진시켜 바이러스의 세포 내 침입을 가능하게 하는 것으로 알려져 있다[28]. 마우스, 원숭이, 사람의 CCR7 아미노산 서열을 비교하였을 때, 사람과 원숭이 사이에는 99%의 유사도를, 사람과 마우스 사이 에는 86%의 유사도를 보였으며(Fig. 4), 마우스 CCR7의 3번째 extracellular loop에서 종(species)사이의 변이도가 집중적으로 나타났다. 물론 CCR7의 이 부위가 E2 결합에 결정적인지는 앞으로의 실험을 통해 밝혀져야 할 과제로 생각된다.
1 등 세포질내 단백질과 CCR7, CKR-L2, insulin-like growth factor-1 receptor 등 세포막 단백질 등이 확인되었다. 이들 단백질들을 발현하는 phage들은 수용성 E2 단백질을 이용한 결합중화반응 결과 E2 단백질에 특이적으로 결합함이 확인되었다. 사람 T 세포에서 주로 발현되는 CCR7 유전자를 PHA로 활성화된 사람 T 세포의 total RNA를 이용하여 증폭하고 클로닝하였다.
2B). 이들 클론의 특이도를 검증하기 위해 10 ㎍/ml의 수용성 E2 단백질을 competitor로 하여 phage와 함께 혼합한 후 E2 단백질에 대해 ELISA를 시행한 결과, 대부분의 클론들이 20-40%씩 결합이 방해되었다(Fig. 2C).
대부분의 바이러스처럼 HCV도 외피 단백질인 E1과 E2를 매개로 하여 숙주세포막에 부착하여 세포 내로 침투할 것으로 추정되고 있으며, 다음의 보고들이 이러한 주장을 뒷받침하고 있다[7]. 첫째, 수용성 E2 단백질은 인간 림프종 세포나 간암 세포주에 높은 친화도로 결합하지만 non-permissible cell line에 대해서는 결합하지 않고, 둘째, E2에 대한 단세포군 항체 (mAb)는 간세포에 대한 E2 단백질의 결합을 방해하며, 셋째, HCV에 감염된 침팬지의 혈청이 T 세포주인 MOLT-4세포에 E2 단백질이 결합하는 것을 방해한다.
9종류의 phagemid 벡터에 cDNA library을 ligation한 후 electroporation으로 transfoimation을 시행하였다. 최종 8.8×105 cfu의 cDNA phage libraiy를 얻었으며, library의 효율을 알아보기위해 insert를 확인한 결과 약 95%의 library가 cDNA insert를가지고 있었다.
후속연구
앞으로의 실험에서 E2 단백질에 대한 blocking antibody을 개발하고 이를 이용하여 CCR7에 대한 E2 단백질의 결합이 중화됨을 증명하고, antisense RNA에 의해 CCR7 단백질의 발현이 차단된 T 세포나 CCR7 발현세포주에서 E2 결합이 소실됨을 밝히고, 실제 환자혈청내에 존재하는 바이러스 입자가 CCR7 발현세포에 직접 결합함을 확인함으로 CCR7이 직접적인 HCV 세포막 수용체임을 밝혀야 할 것으로 생각된다.
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