내병성 관련유전자의 운반체 재조합 및 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)의 형질전환 Vector Construction and Transformation of Ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) Using Disease Resistant Genes원문보기
인삼의 형질전환 시스템의 개발과 내병성관련 유전자의 도입에 관한 연구의 일환으로 soybean에서 cloning한 chitinase 유전자와 내병성 관련유전자(DR gene)가 식물에서 발현 및 형질전환될 수 있도록 운반체를 재조합하여 Agrobacterium을 이용해서 인삼에 형질전환시키고자 수행하였다. 식물세포에서 발현될 수 있는 promoter(35S-35S-AMV)에 내병성유전자인 DR-49 gene을 부착한 후 다시 식물형질전환용 binary vector에 도입하여 인삼에 도입되어 발현될 수 있도록 재조합하였으며, Disarmed Ti-plasmid 함유 Agrobacterium에 내병성유전자인 chitinase(pCH18)와 disease resistant gene(pDR)가 도입되었다. 인삼 callus 배양 과정을 거치지 않고 바로 multi-shoots를 생산하여 형질전환체 획득에 사용하고자 인삼 embryo와 petiole를 이용하여 direct shoots 생산을 유도한 결과 2,4-D 1 mg/ι와 kinetin 0.5 mg/ι 복합처리구에서 multi-shoot가 형성되었다. 또한 인삼 자엽을 이용한 형질전환에서도 MS 기본배지에 2,4-D 1 mg/ι와 kinetin 0.5 mg/ι를 첨가한 복합처리구에서 가장 효과적이었으며, dieases resistant와 chitinase 유전자에 의한 형질전환율은 각각 14%,그리고 18%를 나타내었다. 자엽으로부터 유기된 형질전환된 조직은 pre-embryoid 상태이기 때문에 성숙배의 과정을 거쳐 정상적인 shoot의 형성이 필요하였다.
인삼의 형질전환 시스템의 개발과 내병성관련 유전자의 도입에 관한 연구의 일환으로 soybean에서 cloning한 chitinase 유전자와 내병성 관련유전자(DR gene)가 식물에서 발현 및 형질전환될 수 있도록 운반체를 재조합하여 Agrobacterium을 이용해서 인삼에 형질전환시키고자 수행하였다. 식물세포에서 발현될 수 있는 promoter(35S-35S-AMV)에 내병성유전자인 DR-49 gene을 부착한 후 다시 식물형질전환용 binary vector에 도입하여 인삼에 도입되어 발현될 수 있도록 재조합하였으며, Disarmed Ti-plasmid 함유 Agrobacterium에 내병성유전자인 chitinase(pCH18)와 disease resistant gene(pDR)가 도입되었다. 인삼 callus 배양 과정을 거치지 않고 바로 multi-shoots를 생산하여 형질전환체 획득에 사용하고자 인삼 embryo와 petiole를 이용하여 direct shoots 생산을 유도한 결과 2,4-D 1 mg/ι와 kinetin 0.5 mg/ι 복합처리구에서 multi-shoot가 형성되었다. 또한 인삼 자엽을 이용한 형질전환에서도 MS 기본배지에 2,4-D 1 mg/ι와 kinetin 0.5 mg/ι를 첨가한 복합처리구에서 가장 효과적이었으며, dieases resistant와 chitinase 유전자에 의한 형질전환율은 각각 14%,그리고 18%를 나타내었다. 자엽으로부터 유기된 형질전환된 조직은 pre-embryoid 상태이기 때문에 성숙배의 과정을 거쳐 정상적인 shoot의 형성이 필요하였다.
For study about introduce of gene connected with disease and transformation system of gingseng, chitinase gene cloned from soybene and disease resistant gene were carried out for expression and transformation of plant using Agrobacterium. The disease resistance gene(DR-49), 35S-35S-AMV, has been con...
For study about introduce of gene connected with disease and transformation system of gingseng, chitinase gene cloned from soybene and disease resistant gene were carried out for expression and transformation of plant using Agrobacterium. The disease resistance gene(DR-49), 35S-35S-AMV, has been constructed. The disease resistance gene and chitinase gene were introduced into the binary vector pRD 400, which were mobilized into Agrobacterium tumefaciens faciens strain MP 90 and LBA 4404 harboring disarmed Ti-plasmid. As a result of induce transformants using ginseng embryo and petiole, multi shoots were formed on MS medium supplemented 1 mg/ι 2,4-D and 0.5 mg/ι kinetin. Also transformation by cotyledonwas effective on MS medium supplemented 1 mg/ι 2,4-D and 0.5 mg/ι kinetin, transformation percent of disease resistant gene and chitinase gene were showed 18%, 14% respectively. As transformed tissue is under pre-embryoid condition, normal shoot is required through the process of matured embryo.
For study about introduce of gene connected with disease and transformation system of gingseng, chitinase gene cloned from soybene and disease resistant gene were carried out for expression and transformation of plant using Agrobacterium. The disease resistance gene(DR-49), 35S-35S-AMV, has been constructed. The disease resistance gene and chitinase gene were introduced into the binary vector pRD 400, which were mobilized into Agrobacterium tumefaciens faciens strain MP 90 and LBA 4404 harboring disarmed Ti-plasmid. As a result of induce transformants using ginseng embryo and petiole, multi shoots were formed on MS medium supplemented 1 mg/ι 2,4-D and 0.5 mg/ι kinetin. Also transformation by cotyledonwas effective on MS medium supplemented 1 mg/ι 2,4-D and 0.5 mg/ι kinetin, transformation percent of disease resistant gene and chitinase gene were showed 18%, 14% respectively. As transformed tissue is under pre-embryoid condition, normal shoot is required through the process of matured embryo.
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문제 정의
본 연구는 주로 곰팡이에 대해 저항성을 나타내는 disease resistant gene(DR gene) 과 soybean에서 cloning한 chitinase 유전자를 식물에서 발현 및 형질전환될 수 있도록 재조합하여 Agbactoriu*에 의해서 인삼의 형질전환을 유도하고 자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
1). Cassette vector를 식물형질 전환용 binary vector에 도입하기 위하여 DR gene이 식둘세포에서 발현될 수 있도록 조립된 cassette vector를 다시 Xbal으로 절단하였으며, 또한 식물형질전환용 binary vector인 pRD 400도 동일 제한효소로 절단한 후 ligation시켰다(Fig. 1). Ligation시켜 재조립된 pDR을 E.
DR genee 주로 곰팡이에 대해 저항성을 나타내는 내병성 관련 유전자로서6), 인삼 근부병을 나타내는 곰팡이에 대해서 DR gene이 저항성을 나타낼 것으로 판단하고 우선 이 유전자를 이용하여 인삼 자엽조직을 형질전환시켜 재분화된 인삼의 근부 발생균에 대해서 내성 가능성을 조사하고자 DR gene cDNA가 식물세포에서 발현될 수 있도록 재조합하였다. 우선 식물세포에서 발현할 수 있는 강력한 promoter(35S- 35S-AMV)와 Tnos terminator를 가지고 있는 cassette vector 524-Xba에 내병성 유전자인 DR gene를 purification하여 ligation시킨 후 E.
DR gene과 chitinase genee 곰팡이에 대해서 내성을 나타내는 유전자6, 8)로 식물체에 강력한 promoter를 도입하여 발현시켰을때 인삼 등에서 근부병을 유발하는 Fusarium so등에 대해서 저항성을 보일 것으로 사료되는 봐, 본 실험은 soybean에서 cloning된 chitinase gene이 식물에서 발현 및 형질전환될 수 있도록 재조립된 pCH18 vector와 pDR vector> 식물호르몬 자가합성 유전자가 제거된 disarmed Ti-plasmid 함유 Agrobacterium tumefaciens LBA- 4404 및 MP90을 tri-parental mating에 의해 실시하였다. Helper로는 E.
DR gene과 chitinase genee 곰팡이에 대해서 내성을 나타내는 유전자6, 8)로 식물체에 강력한 promoter를 도입하여 발현시켰을때 인삼 등에서 근부병을 유발하는 Fusarium so등에 대해서 저항성을 보일 것으로 사료되는 봐, 본 실험은 soybean에서 cloning된 chitinase gene이 식물에서 발현 및 형질전환될 수 있도록 재조립된 pCH18 vector와 pDR vector> 식물호르몬 자가합성 유전자가 제거된 disarmed Ti-plasmid 함유 Agrobacterium tumefaciens LBA- 4404 및 MP90을 tri-parental mating에 의해 실시하였다. Helper로는 E. coli DH5a pRK2013을 사용하였으며 특성상 LBA4404을 배양하기 위한 배지로는 2YT 및 AB배지에 kanamycin 50 μg/m/을 첨가하여 사용하였고, MP9은 gen- tamycin을 50μg/m/ 첨가하여 배양하였다. 그 결과 pDR gene과 pCH18 gene0] Agrobarm에 도입된 A.
Soybean에서 cloning한 산Htinase 유전자의 도입을 확인하기 위하여 25 ng와 50 ng의 DNA를 추출한 후 5, 10, 15 pm 농도별로 primer를 처리하여 96℃에서 2분간 predenaturation 한 후, 94℃에서 30초간 denaturation, 60℃에서 30초간 annealing, 그리고 extension으로 72℃에서 2분간 36cycling한 후에 post-extension 에서 15분, 4℃에서 보관으로 programming하여 PCR(Perkin Elmer Cetus, R)todyne IrcorpoiNted)로 도입 여부를 확인하였다,
5mg/7를 첨가한 1/2 MS 배지에 casein hydrolysate, AgNO3, gibberellic acid, active charcoal, inosine, C11SO4등의 화학제를 각각의 농도 별로 처리하였으며 cold treatment를 병행실시하여 shoot 발 생에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 형질전환체의 재분화에 미치는 STS 용액과 sucrose의 효과를 알아보기 위하여 각각의 농도별로 복합처리하여 처리구에 따른 생장 양상을 조사 하였다.
세포벽물질이 chitin으로 구성되어 있는 곰팡이 및 곤충에 효과가 있는 chitinase gene을 인삼에 도입하기 위해서 식물핵 내에서 발현될 수 있는 cassette vector와 형질전환이 가능한 binary vector 사용하여 Fig. 2와 같이 재조합하였다.
인삼의 형질전환을 유도하기 위해서 선발된 Agrobacterium tumefaciens LBA4404/ pCH18과 MP90/pDR 균주를 kana- mycin 25 μg/ml과 gentamycin 25μg/mZ이 첨가 된 ABe)에서 2일간 배양한 후 형질전환을 위하여 인삼의엽과 공동 배양하였다. 식물호르몬 무첨가 MS배지에서 2일간 공동배양 된 인삼의 자엽 절편은 2, 4-D lmg//와 kinetin 0.5mg/Z가 함유된 MS배지에 kanamycin 100μg/m/과 ciirbenicillin 500 μg/ml를 첨가하여 형질전환체를 선발하였다. 인삼 자엽으 로부터 형질전환된 pre-embryoid는 kanamycin 100m/이 함유된 상기배지에서 계속 계대배양하여 증식시켰으며, 형질 전환된 1개의 pre-embryoid로부터 더 많은 양의 pre- embryoid를 유도하고 그로부터 정상적인 shoot* 발생시키기 위하여 2, 4-D g/Z과 kinetin 0.
5mg/Z가 함유된 MS배지에 kanamycin 100μg/m/과 ciirbenicillin 500 μg/ml를 첨가하여 형질전환체를 선발하였다. 인삼 자엽으 로부터 형질전환된 pre-embryoid는 kanamycin 100m/이 함유된 상기배지에서 계속 계대배양하여 증식시켰으며, 형질 전환된 1개의 pre-embryoid로부터 더 많은 양의 pre- embryoid를 유도하고 그로부터 정상적인 shoot* 발생시키기 위하여 2, 4-D g/Z과 kinetin 0.5mg/7를 첨가한 1/2 MS 배지에 casein hydrolysate, AgNO3, gibberellic acid, active charcoal, inosine, C11SO4등의 화학제를 각각의 농도 별로 처리하였으며 cold treatment를 병행실시하여 shoot 발 생에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 형질전환체의 재분화에 미치는 STS 용액과 sucrose의 효과를 알아보기 위하여 각각의 농도별로 복합처리하여 처리구에 따른 생장 양상을 조사 하였다.
대상 데이터
인삼의 형질전환을 유도하기 위해서 선발된 Agrobacterium tumefaciens LBA4404/ pCH18과 MP90/pDR 균주를 kana- mycin 25 μg/ml과 gentamycin 25μg/mZ이 첨가 된 ABe)에서 2일간 배양한 후 형질전환을 위하여 인삼의엽과 공동 배양하였다. 식물호르몬 무첨가 MS배지에서 2일간 공동배양 된 인삼의 자엽 절편은 2, 4-D lmg//와 kinetin 0.
이론/모형
인 pRD 400'&과 ligation시켰다. Binary vectory에 유전자가 도입된 것이 확인된 pDR과 pCH vector를 Agaci에 다시 도입하기 위해서 disarmed Ti-plasmid*)를 함유하고 있는 A. tumefaciens LBA4404 및 MP90 각각을 tri-parental mating 방법에 의해 수행하였다.
성능/효과
1). Ligation시켜 재조립된 pDR을 E. coli에 다시 도입하여 plasmid를 isolation 한 후 Xbal으로 절단한 결과 DR gene 을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 내병성을 나타내는 DR gene이 식물형질 전환용 binary vector에 효과적으로 도입되었음을 의미한다고 할 수 있다.
Tri-parental mating에 의해서 선발한 2종의 transconju- gants A. tumefaciens MP90/pDR와 LBA4404/pCH18 각각을 2, 4-D 1와 kinetin 0.5가 함유된 MS배지에 kanamycin 100 와 carbenicillin 500 μ를 첨가한 선발배지에서 동시배양법에 의하여 인삼조직의 헝질전환을 유도한 결과 성공적으로 형질전환이 가능하여 각각의 형질전 환율은 MP90/pDR의 경우에는 18%, LBA4404/pCH18의 경우에는 14%을 나타내었다Cble 2). 그러나 형질전환된 조직이 모두 pre-embryoid(Fig.
coli DH5a pRK2013을 사용하였으며 특성상 LBA4404을 배양하기 위한 배지로는 2YT 및 AB배지에 kanamycin 50 μg/m/을 첨가하여 사용하였고, MP9은 gen- tamycin을 50μg/m/ 첨가하여 배양하였다. 그 결과 pDR gene과 pCH18 gene0] Agrobarm에 도입된 A. tume~ fdciens MP90/pDR과 LBA4404/pCH18 2종의 transconju- gants을 획득할 수 있었다(Eble 1).
형질전환된 인삼 pre-embryoid로 부터 shoot의 형성을 유도하기 위하여 우선 preembryoid의 대량증식이 요구되었다. 따라서 형질전환된 pre-embryoid 1개를 절취하여 2, 4-D lm와 kinetin 0.1mg/Z가 함유된 MS 배지에 겨대배양하여 1개월 간 암 및 광상태에서 배양한 결과 많은 컁의 pre-embryoid(Fig. 4)를 증식시킬 수 있었다. 그러나 암상태에서는 pre-embryoid 수는 적었지만 embryoid 상태에 가까웠으나, 광상태에서는 암상태보다 더 많은 량의 pre-embryoid가 형성되고, 녹색을 띄우고 있었으나, 암상태보다는 embryoid 에 가까운 것이 더 적은 편이였다.
상기 chemical 처리에서 shoot의 생장이 용이하지 않았기 때문에 STS 및 sucrose 용액을 몇 가지 농도별로 처리하여 pre-errryoid의 생장을 조사한 결과 STS solution 6mM과 sucrose 60g/l 복합처리에서 양호한 경향을 보였으며 (Fig. 5), shoot의 분화에도 효과가 있었다(Eble 4).
coli에 다시 도입하여 plasmid를 isolation 한 후 Xbal으로 절단한 결과 DR gene 을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 내병성을 나타내는 DR gene이 식물형질 전환용 binary vector에 효과적으로 도입되었음을 의미한다고 할 수 있다.
형질진환된 pre-embryoid에서 shoot 형성을 유도하기 위하여 각종 화학물질을 첨가하여 생장 양상를 조사한 결과 AgNO3 10과 10일간의 cold 처리에서만 생장이 가능했을 뿐 다른 처리구에서는 거의 shoot 형성을 관찰할 수 없었다. 그러나 AgN엉 10|iM과 10일간의 cold 처리에서도 뿌리 형성은 전혀 나타나지 않았다(Table 3).
후속연구
그러나 암상태에서는 pre-embryoid 수는 적었지만 embryoid 상태에 가까웠으나, 광상태에서는 암상태보다 더 많은 량의 pre-embryoid가 형성되고, 녹색을 띄우고 있었으나, 암상태보다는 embryoid 에 가까운 것이 더 적은 편이였다. 따라서 추후 대량 형성된 pre-embryoid을 이용하여 성숙된 embryoid을 유기한 후 정상적인 shoot를 발생시켜야 할 것으루- 사료된다.
참고문헌 (19)
Ahmad, J. S. and R. Baker. Phytopathol. 77, 182-189 (1987)
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