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문제 정의
- 본 연구는 주로 곰팡이에 대해 저항성을 나타내는 disease resistant gene(DR gene) 과 soybean에서 cloning한 chitinase 유전자를 식물에서 발현 및 형질전환될 수 있도록 재조합하여 Agbactoriu*에 의해서 인삼의 형질전환을 유도하고 자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 1). Cassette vector를 식물형질 전환용 binary vector에 도입하기 위하여 DR gene이 식둘세포에서 발현될 수 있도록 조립된 cassette vector를 다시 Xbal으로 절단하였으며, 또한 식물형질전환용 binary vector인 pRD 400도 동일 제한효소로 절단한 후 ligation시켰다(Fig. 1). Ligation시켜 재조립된 pDR을 E.
- DR genee 주로 곰팡이에 대해 저항성을 나타내는 내병성 관련 유전자로서6), 인삼 근부병을 나타내는 곰팡이에 대해서 DR gene이 저항성을 나타낼 것으로 판단하고 우선 이 유전자를 이용하여 인삼 자엽조직을 형질전환시켜 재분화된 인삼의 근부 발생균에 대해서 내성 가능성을 조사하고자 DR gene cDNA가 식물세포에서 발현될 수 있도록 재조합하였다. 우선 식물세포에서 발현할 수 있는 강력한 promoter(35S- 35S-AMV)와 Tnos terminator를 가지고 있는 cassette vector 524-Xba에 내병성 유전자인 DR gene를 purification하여 ligation시킨 후 E.
- DR gene과 chitinase genee 곰팡이에 대해서 내성을 나타내는 유전자6, 8)로 식물체에 강력한 promoter를 도입하여 발현시켰을때 인삼 등에서 근부병을 유발하는 Fusarium so등에 대해서 저항성을 보일 것으로 사료되는 봐, 본 실험은 soybean에서 cloning된 chitinase gene이 식물에서 발현 및 형질전환될 수 있도록 재조립된 pCH18 vector와 pDR vector> 식물호르몬 자가합성 유전자가 제거된 disarmed Ti-plasmid 함유 Agrobacterium tumefaciens LBA- 4404 및 MP90을 tri-parental mating에 의해 실시하였다. Helper로는 E.
- DR gene과 chitinase genee 곰팡이에 대해서 내성을 나타내는 유전자6, 8)로 식물체에 강력한 promoter를 도입하여 발현시켰을때 인삼 등에서 근부병을 유발하는 Fusarium so등에 대해서 저항성을 보일 것으로 사료되는 봐, 본 실험은 soybean에서 cloning된 chitinase gene이 식물에서 발현 및 형질전환될 수 있도록 재조립된 pCH18 vector와 pDR vector> 식물호르몬 자가합성 유전자가 제거된 disarmed Ti-plasmid 함유 Agrobacterium tumefaciens LBA- 4404 및 MP90을 tri-parental mating에 의해 실시하였다. Helper로는 E. coli DH5a pRK2013을 사용하였으며 특성상 LBA4404을 배양하기 위한 배지로는 2YT 및 AB배지에 kanamycin 50 μg/m/을 첨가하여 사용하였고, MP9은 gen- tamycin을 50μg/m/ 첨가하여 배양하였다. 그 결과 pDR gene과 pCH18 gene0] Agrobarm에 도입된 A.
- Soybean에서 cloning한 산Htinase 유전자의 도입을 확인하기 위하여 25 ng와 50 ng의 DNA를 추출한 후 5, 10, 15 pm 농도별로 primer를 처리하여 96℃에서 2분간 predenaturation 한 후, 94℃에서 30초간 denaturation, 60℃에서 30초간 annealing, 그리고 extension으로 72℃에서 2분간 36cycling한 후에 post-extension 에서 15분, 4℃에서 보관으로 programming하여 PCR(Perkin Elmer Cetus, R)todyne IrcorpoiNted)로 도입 여부를 확인하였다,
- 5mg/7를 첨가한 1/2 MS 배지에 casein hydrolysate, AgNO3, gibberellic acid, active charcoal, inosine, C11SO4등의 화학제를 각각의 농도 별로 처리하였으며 cold treatment를 병행실시하여 shoot 발 생에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 형질전환체의 재분화에 미치는 STS 용액과 sucrose의 효과를 알아보기 위하여 각각의 농도별로 복합처리하여 처리구에 따른 생장 양상을 조사 하였다.
- 세포벽물질이 chitin으로 구성되어 있는 곰팡이 및 곤충에 효과가 있는 chitinase gene을 인삼에 도입하기 위해서 식물핵 내에서 발현될 수 있는 cassette vector와 형질전환이 가능한 binary vector 사용하여 Fig. 2와 같이 재조합하였다.
- 인삼의 형질전환을 유도하기 위해서 선발된 Agrobacterium tumefaciens LBA4404/ pCH18과 MP90/pDR 균주를 kana- mycin 25 μg/ml과 gentamycin 25μg/mZ이 첨가 된 ABe)에서 2일간 배양한 후 형질전환을 위하여 인삼의엽과 공동 배양하였다. 식물호르몬 무첨가 MS배지에서 2일간 공동배양 된 인삼의 자엽 절편은 2, 4-D lmg//와 kinetin 0.5mg/Z가 함유된 MS배지에 kanamycin 100μg/m/과 ciirbenicillin 500 μg/ml를 첨가하여 형질전환체를 선발하였다. 인삼 자엽으 로부터 형질전환된 pre-embryoid는 kanamycin 100m/이 함유된 상기배지에서 계속 계대배양하여 증식시켰으며, 형질 전환된 1개의 pre-embryoid로부터 더 많은 양의 pre- embryoid를 유도하고 그로부터 정상적인 shoot* 발생시키기 위하여 2, 4-D g/Z과 kinetin 0.
- 5mg/Z가 함유된 MS배지에 kanamycin 100μg/m/과 ciirbenicillin 500 μg/ml를 첨가하여 형질전환체를 선발하였다. 인삼 자엽으 로부터 형질전환된 pre-embryoid는 kanamycin 100m/이 함유된 상기배지에서 계속 계대배양하여 증식시켰으며, 형질 전환된 1개의 pre-embryoid로부터 더 많은 양의 pre- embryoid를 유도하고 그로부터 정상적인 shoot* 발생시키기 위하여 2, 4-D g/Z과 kinetin 0.5mg/7를 첨가한 1/2 MS 배지에 casein hydrolysate, AgNO3, gibberellic acid, active charcoal, inosine, C11SO4등의 화학제를 각각의 농도 별로 처리하였으며 cold treatment를 병행실시하여 shoot 발 생에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 형질전환체의 재분화에 미치는 STS 용액과 sucrose의 효과를 알아보기 위하여 각각의 농도별로 복합처리하여 처리구에 따른 생장 양상을 조사 하였다.
대상 데이터
- 인삼의 형질전환을 유도하기 위해서 선발된 Agrobacterium tumefaciens LBA4404/ pCH18과 MP90/pDR 균주를 kana- mycin 25 μg/ml과 gentamycin 25μg/mZ이 첨가 된 ABe)에서 2일간 배양한 후 형질전환을 위하여 인삼의엽과 공동 배양하였다. 식물호르몬 무첨가 MS배지에서 2일간 공동배양 된 인삼의 자엽 절편은 2, 4-D lmg//와 kinetin 0.
이론/모형
- 인 pRD 400'&과 ligation시켰다. Binary vectory에 유전자가 도입된 것이 확인된 pDR과 pCH vector를 Agaci에 다시 도입하기 위해서 disarmed Ti-plasmid*)를 함유하고 있는 A. tumefaciens LBA4404 및 MP90 각각을 tri-parental mating 방법에 의해 수행하였다.
성능/효과
- 1). Ligation시켜 재조립된 pDR을 E. coli에 다시 도입하여 plasmid를 isolation 한 후 Xbal으로 절단한 결과 DR gene 을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 내병성을 나타내는 DR gene이 식물형질 전환용 binary vector에 효과적으로 도입되었음을 의미한다고 할 수 있다.
- Tri-parental mating에 의해서 선발한 2종의 transconju- gants A. tumefaciens MP90/pDR와 LBA4404/pCH18 각각을 2, 4-D 1와 kinetin 0.5가 함유된 MS배지에 kanamycin 100 와 carbenicillin 500 μ를 첨가한 선발배지에서 동시배양법에 의하여 인삼조직의 헝질전환을 유도한 결과 성공적으로 형질전환이 가능하여 각각의 형질전 환율은 MP90/pDR의 경우에는 18%, LBA4404/pCH18의 경우에는 14%을 나타내었다Cble 2). 그러나 형질전환된 조직이 모두 pre-embryoid(Fig.
- coli DH5a pRK2013을 사용하였으며 특성상 LBA4404을 배양하기 위한 배지로는 2YT 및 AB배지에 kanamycin 50 μg/m/을 첨가하여 사용하였고, MP9은 gen- tamycin을 50μg/m/ 첨가하여 배양하였다. 그 결과 pDR gene과 pCH18 gene0] Agrobarm에 도입된 A. tume~ fdciens MP90/pDR과 LBA4404/pCH18 2종의 transconju- gants을 획득할 수 있었다(Eble 1).
- 형질전환된 인삼 pre-embryoid로 부터 shoot의 형성을 유도하기 위하여 우선 preembryoid의 대량증식이 요구되었다. 따라서 형질전환된 pre-embryoid 1개를 절취하여 2, 4-D lm와 kinetin 0.1mg/Z가 함유된 MS 배지에 겨대배양하여 1개월 간 암 및 광상태에서 배양한 결과 많은 컁의 pre-embryoid(Fig. 4)를 증식시킬 수 있었다. 그러나 암상태에서는 pre-embryoid 수는 적었지만 embryoid 상태에 가까웠으나, 광상태에서는 암상태보다 더 많은 량의 pre-embryoid가 형성되고, 녹색을 띄우고 있었으나, 암상태보다는 embryoid 에 가까운 것이 더 적은 편이였다.
- 상기 chemical 처리에서 shoot의 생장이 용이하지 않았기 때문에 STS 및 sucrose 용액을 몇 가지 농도별로 처리하여 pre-errryoid의 생장을 조사한 결과 STS solution 6mM과 sucrose 60g/l 복합처리에서 양호한 경향을 보였으며 (Fig. 5), shoot의 분화에도 효과가 있었다(Eble 4).
- coli에 다시 도입하여 plasmid를 isolation 한 후 Xbal으로 절단한 결과 DR gene 을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 내병성을 나타내는 DR gene이 식물형질 전환용 binary vector에 효과적으로 도입되었음을 의미한다고 할 수 있다.
- 형질진환된 pre-embryoid에서 shoot 형성을 유도하기 위하여 각종 화학물질을 첨가하여 생장 양상를 조사한 결과 AgNO3 10과 10일간의 cold 처리에서만 생장이 가능했을 뿐 다른 처리구에서는 거의 shoot 형성을 관찰할 수 없었다. 그러나 AgN엉 10|iM과 10일간의 cold 처리에서도 뿌리 형성은 전혀 나타나지 않았다(Table 3).
후속연구
- 그러나 암상태에서는 pre-embryoid 수는 적었지만 embryoid 상태에 가까웠으나, 광상태에서는 암상태보다 더 많은 량의 pre-embryoid가 형성되고, 녹색을 띄우고 있었으나, 암상태보다는 embryoid 에 가까운 것이 더 적은 편이였다. 따라서 추후 대량 형성된 pre-embryoid을 이용하여 성숙된 embryoid을 유기한 후 정상적인 shoot를 발생시켜야 할 것으루- 사료된다.
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