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문제 정의
- 7) 이같은 차이는 시판되고 있는 인삼마다 함유되어 있는 사포닌의 함량이 다르고 또한 사포닌의 조성에도 상당한 차이를 보일 수 있는데 이것이 항당뇨 활성에 차이를 나타내는 원인이 될 수 있다(본 연구실에서 진행하고 있는 실험의 결과 인삼의 항당뇨 활성은 사포닌 분획에서 유래된다는 결론을 내리고 있음). 따라서 본 연구에서는 화기삼, 백삼, 홍삼에탄올 엑스에 대해 항당뇨 활성과 진세노사이드 조성을 비교함으로 항당뇨 활성이 우수한 인삼제품을 개발하는 데 기초자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
- 2주간 백삼, 홍삼 및 화기삼 시료를 투여한 후 multiple low dose streptozotocin으로 유도된 당뇨 흰 쥐의 체중, 혈당, 식이 및 음용수 섭취량 그리고 인슐린 수치에 미치는 영향을 살펴본 결과는 아래와 같다.
- 3일에 한 번씩 체중의 변화를 측정하였고, 안와 채혈하여 얻어진 혈액으로부터 혈당을 측정하였고 투여 2주 후 채취한 혈액에서는 혈당과 insulin 수치를 측정하였다. 식이 및 음용수 섭취량 역시 2주째에 측정하였다.
- 백삼, 홍삼, 화기삼은 300 mg/kg의 용량으로 복강을 통하여 매일 일정한 시간에 투여하였다. 6시간 절식시킨 SD rat에 STZ(100mM citrate buffer(pH 4.5)에 녹임) 20 mg/kg 용량을 복강으로 총 5일간 투여하는 방식으로12) 고혈당을 유도하였으며 당뇨는 6시간 절식 후 240 mg/dl 이상의 혈당으로 정의하였다.
- 5주령의 수컷 ICR mouse를 한림 실험동물(화성, 대한민국)로부터 구입하여 사용하였다. Glucose는 L5g/kg의 용량 으로 12시간 절식 시킨 ICR mouse의 복강을 통하여 투여 하였고 시료는 각 500mg/kg의 용량으로 glucose 투여 30분 전에 복강을 통하여 투여하였다. 그 후 정해진 시간(0, 30, 60 90, 120분)에 안와 정맥을 통하여 채혈한 후 혈당을 측정하였다.
- 백삼, 홍삼, 화기삼의 ginsenoside 분석을 위하여 다음과 같은 방법을 사용하였다. 각 인삼에서 Scheme 1과 같은 방법으로 조사포닌을 분리한 후 protopanaxadiol(PPD)계 ginsenoside에서 Rb1, Rb2, Rc, Rd를, protopanaxatriol (PPT)계 ginsenodides에서 Re, Rf, Rgl을 HPLC를 사용하여 분석하였다. 본 실험에서는 두 개의 LC-6AD pump, CBM- 10A communication bus module과 SPD-10A UV-VTS detector로 구성된 HPLC system(Shimadzu, Japan)을 사용하였고 column은 Luna 5 gm, 250×4.
- Glucose는 L5g/kg의 용량 으로 12시간 절식 시킨 ICR mouse의 복강을 통하여 투여 하였고 시료는 각 500mg/kg의 용량으로 glucose 투여 30분 전에 복강을 통하여 투여하였다. 그 후 정해진 시간(0, 30, 60 90, 120분)에 안와 정맥을 통하여 채혈한 후 혈당을 측정하였다.
- 6주령의 수컷 Sprague-Dawley (SD) rat은 한림실험동물(화성, 대한민국)에서 구입하여 1주일간 실험실에 적응시킨 후 다음과 같이 군을 나누어 본 실험에 착수하였다 : vehicle 로 물만 투여한 정상 대조군(NC), STZ를 투여하여 당뇨를 유발시킨 당뇨대조군(DC), 백삼투여군(GRA), 홍삼투여군(GRR), 화기삼투여군(PQR). 백삼, 홍삼, 화기삼은 300 mg/kg의 용량으로 복강을 통하여 매일 일정한 시간에 투여하였다. 6시간 절식시킨 SD rat에 STZ(100mM citrate buffer(pH 4.
- 0 mm C18 reverse phase column(Phenomenex, USA)을 사용하였다. 이동상으로는 solvent A (water)와 solvent B (10% acetonitrd)을 이용한 gradient system으로서 다음과 같은 방법으로 분석하였다. 0-20 min, 10-23% B; 20-30 min, 23-30% B; 30—40 min, 30-35% B; 40—50 min, 35% B.
- 인삼 종류에 따른 혈당강하 활성과 ginsenoside profile간 의 상관 관계를 규명할 목적으로 각 인삼 시료로부터 사포닌 분획을 얻은 후 HPLC로 ginsenoside profile(protopanaxa- diol계 성분 4개, protopanaxatriol 계 성분 3개)을 분석한 결 과를 Table 3에 나타내었다. Table 3에서 보는 바와 같이 7개 사포닌 성분 간에 홍삼과 백삼의 경우는 커다란 차이가 없는 반면 화기삼의 경우는 Rb1 Rb2, Re, Rf, Rg1에서 한국 인삼과 커다란 차이를 보이고 있다.
대상 데이터
- (주)일화 중앙연구소로부터 공급받은 백삼, 화기삼 그리고 정관장으로부터 구입한 홍삼을 50% 에탄올로 추출한 후 동결건조하여 실험 전까지 -70℃ deep freeze에 보관하였다.
- 5주령의 수컷 ICR mouse를 한림 실험동물(화성, 대한민국)로부터 구입하여 사용하였다. Glucose는 L5g/kg의 용량 으로 12시간 절식 시킨 ICR mouse의 복강을 통하여 투여 하였고 시료는 각 500mg/kg의 용량으로 glucose 투여 30분 전에 복강을 통하여 투여하였다.
- 6주령의 수컷 Sprague-Dawley (SD) rat은 한림실험동물(화성, 대한민국)에서 구입하여 1주일간 실험실에 적응시킨 후 다음과 같이 군을 나누어 본 실험에 착수하였다 : vehicle 로 물만 투여한 정상 대조군(NC), STZ를 투여하여 당뇨를 유발시킨 당뇨대조군(DC), 백삼투여군(GRA), 홍삼투여군(GRR), 화기삼투여군(PQR). 백삼, 홍삼, 화기삼은 300 mg/kg의 용량으로 복강을 통하여 매일 일정한 시간에 투여하였다.
- 각 인삼에서 Scheme 1과 같은 방법으로 조사포닌을 분리한 후 protopanaxadiol(PPD)계 ginsenoside에서 Rb1, Rb2, Rc, Rd를, protopanaxatriol (PPT)계 ginsenodides에서 Re, Rf, Rgl을 HPLC를 사용하여 분석하였다. 본 실험에서는 두 개의 LC-6AD pump, CBM- 10A communication bus module과 SPD-10A UV-VTS detector로 구성된 HPLC system(Shimadzu, Japan)을 사용하였고 column은 Luna 5 gm, 250×4.0 mm C18 reverse phase column(Phenomenex, USA)을 사용하였다. 이동상으로는 solvent A (water)와 solvent B (10% acetonitrd)을 이용한 gradient system으로서 다음과 같은 방법으로 분석하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과들은 mean±SE로 나타내었고 통계처리는 Student's t-test를 실시하여 p<0.05를 기준으로 유의성 여부를 판정하였다.
이론/모형
- 혈액 지표 분석을 위한 혈액 채취는 안와 정맥을 통해 채혈하여 3, 000 rpm에서 15분간 원심분리 후 얻어진 혈장을 사용하였다. 혈장 포도당 농도는 glucose oxidase method13)를 이용한 Trinder kit(Sigma Diagnostic, St. Louis, USA)을 사용하여 측정하였고 혈장 insulin 농도는 anti-rat insu lin antibody를 사용한 insulin enzyme immunoassay kit(Rat Insulin ELISA KIT} Shibayagi, Japan)을 이용하여 측 정하였다.
성능/효과
- 1. 복강 내당능시험에서 백삼은 효과를 나타내지 못한 반면 홍삼과 화기삼은 대조군에 대하여 유의적인 변화를 나타내었다. MLD STZ로 당뇨를 유발시킨 SD계 흰 쥐에 백삼, 홍삼, 화기삼을 2주간 투여 후 혈당강하 활성을 비교한 결과 홍삼투여군의 혈당이 가장 낮았으며 백삼과 화기삼은 비슷한 크기의 활성을 나타내었다.
- 2. 백삼과 홍삼, 화기삼은 모두 고혈당에 의한 체중 감소 현상을 개선시켰으며 각 투여군 간에는 유의적인 차이는 없 었다.
- 3. 당뇨의 대표적인 증상인 다식(多食)과 다음(多飮) 현상이 백삼, 홍삼, 화기삼투여에 의하여 개선되었으며 그 중 홍삼에 의한 효과가 가장 컸다.
- 4. 할당강하 활성과 ginsenoside profle간의 상관관계를 살펴본 결과 PPT/PPD ratio가 가장 큰 홍삼의 혈당강하 활성이 백삼과 화기삼에 비해 높은 것으로 보아 PPT/PPD ratio가 혈당강하 활성의 key ratio가 아닌가 추측된다.
- 8-11) 그러나 Vuksan 등이 최근에 보고한 바와 같이 한 회사에서 시판되고 있는 인삼도 batch마다 항당뇨 활성에 상당한 차이가 있을 수 있다.7) 이같은 차이는 시판되고 있는 인삼마다 함유되어 있는 사포닌의 함량이 다르고 또한 사포닌의 조성에도 상당한 차이를 보일 수 있는데 이것이 항당뇨 활성에 차이를 나타내는 원인이 될 수 있다(본 연구실에서 진행하고 있는 실험의 결과 인삼의 항당뇨 활성은 사포닌 분획에서 유래된다는 결론을 내리고 있음). 따라서 본 연구에서는 화기삼, 백삼, 홍삼에탄올 엑스에 대해 항당뇨 활성과 진세노사이드 조성을 비교함으로 항당뇨 활성이 우수한 인삼제품을 개발하는 데 기초자료를 제공하고자 한다.
- 1과 같다. Fig. 1에서 보는 바와 같이 백삼투여군은 대조군과 비교시 유의적인 혈당 변화의 차이를 보여주지 못했으나 화기삼투여군에서는 30분에서 16.0±1.6mM로 대조군에 비해 유의적인 차이(P<0.05)를 나타내었고 홍삼투여군은 30, 60, 90분 모두에^ 혈당치가 12.0±2.6, 8.0±0.8, 8.0±0.6mM로서 대조군에 비해 유의적인 차이를 나타내었다(F<0.05). 당 부하를 한 후 120분간 혈당 변화의 추이를 곡선하면적으로 그룹 간 비교한 결과는 Fig.
- 복강 내당능시험에서 백삼은 효과를 나타내지 못한 반면 홍삼과 화기삼은 대조군에 대하여 유의적인 변화를 나타내었다. MLD STZ로 당뇨를 유발시킨 SD계 흰 쥐에 백삼, 홍삼, 화기삼을 2주간 투여 후 혈당강하 활성을 비교한 결과 홍삼투여군의 혈당이 가장 낮았으며 백삼과 화기삼은 비슷한 크기의 활성을 나타내었다.
- MLD STZ로 유도한 당뇨쥐에서 체중 변화는 Fig. 2에서 보는 바와 같이 정상 대조군에 비해 당뇨 대조군은 STZ에 의한 영향으로 체중이 거의 증가하지 않고 조금씩 감소하였다. 한편 백삼, 홍삼, 화기삼투여군의 체중은 투이 7일째까지 체중이 거의 증가하지 않았으나 그 이후 서서히 증가하기 시작하여 14일째에는 백삼 (210±4g, P<0.
- Table 2에서 보는 바와 같이 당뇨 대조군의 경우 식이량이 40.6±1.3 g/day/nit으로서 정상 대조군과 비교해볼 때 두 배 가량 유의적으로 증가된 반면 백삼, 홍삼, 화기삼투여군에서 당뇨 대조군과 비교시 37%, 43%, 34% 유의적인 감소를 보 여주었다.
- 05)를 나타내었다. 곡선하면적을 비교시 본 실험에서 혈당강하 활성이 가장 큰 것은 홍삼, 화기삼순이었으며 백삼의 경우는 단회투여로 인한 혈당강하 활성은 보이지 못하였다.
- 곧 홍삼, 백삼, 화기삼의 순으로 총 사포닌의 함량이 커짐을 알 수 있었다. 다시 말해 총 사포닌 함량이 가장 적은 홍삼이 총 사 포닌 함량이 가장 많은 화기삼에 비해 혈당강하 활성이 더 큰 것으로 본 실험 결과 나타났다. 이 결과로부터 총 사포닌 함량은 혈당강하 활성을 나타내는 중요한 지표라고 생각되지 않으며, 오히려 총 사포닌 함량보다는 사포닌 성분 중 혈당 강하 활성을 나타내는 유효 성분의 함량 혹은 구성비율이 더 중요하지 않나 여겨진다.
- 본 실험에서 사용한 용량인 300 mg의 백삼, 홍삼, 화기삼에 함유된 Re의 함량을 Table 3에 나타난 비율로 계산하면 백삼은 42 mg, 홍삼은 54 mg, 화기삼은 249 mg의 Re를 함유하고 있으며 이는 Attelle 등의 논문에서 사용한 Re의 용량 범위(5-20mg/kg)를 모두 넘어서는 용량이다. 따라서 20 mg/kg의 Re가 혈당 강하를 일으킬 수 있는 최대 용량이라 가정한다면 본 실험에서 사용한 백삼, 홍삼, 화기삼 간의 혈당강하 활성에 차이가 있을 수 없다는 결론이다.
- 물 섭취량에서도 당뇨 대조군은 정상 대조군에 비해 3.6배 증가한 반면 백삼, 홍삼, 화기삼투여군은 당뇨 대조군에 비해 17%, 29%, 15% 감소 효과를 나타내었다. 이 결과로부터 백삼, 홍삼, 화기삼은 당뇨의 대표적인 증상인 다식(多食)과 다음(多飮) 현상을 개선시켜주며 이들 중 홍삼이 가장 뛰어난 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 01)를 나타낸 것을 비롯하여 14일째에는 백삼, 홍삼, 화기삼투여군 모두에서 181±18, 155±40, 186±48mg/dl의 혈당치를 나타냄으로써 당뇨 대조군에 대하여 모두 유의적인 차이를 나타내었다. 본 실험 결과 홍삼의 혈당강하 활성이 가장 크고 백삼과 화기삼의 경우는 비슷한 크기의 혈당강하 활성을 나타내었다. 또한 홍삼의 경우 혈당을 떨어뜨리는 속도에서도 다른 인삼투여군에 비해 상대적으로 빠름을 알 수 있었다.
- 표에서 보는 바와 같이 Re의 경우 화기삼에 가장 많이 들어있으며 홍삼과 백삼의 경우는 화기삼의 1/4-1/6 정도 Re가 들어있지만 혈당강하 활성에서는 오히려 화기삼보다 높다는 사실은 인삼 시료에 들어있는 특정 사포닌의 약효를 나타내기 위한 용량 범위를 규명하는 것이 보다 중요하다고 사료된다. 본 실험에서 사용한 용량인 300 mg의 백삼, 홍삼, 화기삼에 함유된 Re의 함량을 Table 3에 나타난 비율로 계산하면 백삼은 42 mg, 홍삼은 54 mg, 화기삼은 249 mg의 Re를 함유하고 있으며 이는 Attelle 등의 논문에서 사용한 Re의 용량 범위(5-20mg/kg)를 모두 넘어서는 용량이다. 따라서 20 mg/kg의 Re가 혈당 강하를 일으킬 수 있는 최대 용량이라 가정한다면 본 실험에서 사용한 백삼, 홍삼, 화기삼 간의 혈당강하 활성에 차이가 있을 수 없다는 결론이다.
- 6배 증가한 반면 백삼, 홍삼, 화기삼투여군은 당뇨 대조군에 비해 17%, 29%, 15% 감소 효과를 나타내었다. 이 결과로부터 백삼, 홍삼, 화기삼은 당뇨의 대표적인 증상인 다식(多食)과 다음(多飮) 현상을 개선시켜주며 이들 중 홍삼이 가장 뛰어난 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 05) 각 투여군에서 당뇨 대조군에 비해 유의적인 차이를 나타내었다. 이 결과로부터 홍삼, 백삼, 화기삼은 고혈당으로 인해 야기되는 체중 감소에 대한 억제 활성이 있음을 알 수 있었다.
- 당뇨 대조군의 경우 STZ 투여로 인한 췌장 베타세포의 파괴로 인해 혈중 인슐린 수치가 480에서 167pg/ml로 현저히 낮아진대 반해 시료 투여군 모두에서 당뇨 대조군과 비교시 뚜렷한 인슐린치의 상승을 보여주었다. 특히 홍삼투여군의 경우 정상 대조군과 거의 비슷한 인슐린 수치를 나타내어 STZ에 의한 췌장 베타세포의 파괴를 상당 부분 차단시키는 활성이 탁월함을 알 수 있었다. 혈중 인슐린 수치에 근거하여 볼 때 췌장 베타세포를 보호하는 능력은 홍삼, 백삼, 화기삼의 순 이었다.
- 2에서 보는 바와 같이 정상 대조군에 비해 당뇨 대조군은 STZ에 의한 영향으로 체중이 거의 증가하지 않고 조금씩 감소하였다. 한편 백삼, 홍삼, 화기삼투여군의 체중은 투이 7일째까지 체중이 거의 증가하지 않았으나 그 이후 서서히 증가하기 시작하여 14일째에는 백삼 (210±4g, P<0.0l), 홍삼(205±7g, P<0.05), 화기삼(210±10g, P<0.05) 각 투여군에서 당뇨 대조군에 비해 유의적인 차이를 나타내었다. 이 결과로부터 홍삼, 백삼, 화기삼은 고혈당으로 인해 야기되는 체중 감소에 대한 억제 활성이 있음을 알 수 있었다.
후속연구
- 42로서 홍삼이 가장 높고 백삼과 화기삼은 비슷한 수준임을 알 수 있다. PFr/PPD 비율이 본 실험의 결과와 관련성이 있다고는 하지만 인삼의 항 당뇨 활성을 결정하는 데 PPT/PPD ratio가 중요한 비율인지에 대하여는 추후 여러 다른 batch를 사용하여 규명할 필요가 있다고 사료된다.
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