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문제 정의
- 도꼬마리 추출물 및 정제물이 TNFa, IL-1JJ 및 IL-2의 생성에 미치는 영향으로 면역 증강 활성을 검토하였다. Fig.
- 이처럼 도꼬마리가 다양한 약리 작용을 하는 것으로 보아 항균성 및 항암성 물질의 존재가 예상되어, 본 연구자는 한국산 도꼬마리로부터 새로운 항균 및 항암효과 등 다양한 생리활성기능이 있는 신규물질의 탐색과 응용을 위한 일환으로서 도꼬마리로부터 추출한 성분이 광범위한 항균효과 및 항암효과를 가진다는 사실과 더 불어분자량 386, 230 및 248인 항균 및 항암성 물질을 분리 ■ 정제한 결과를 보고하였다(11, 12). 따라서 본 연구에서는 도꼬마리 추출물과 정제물질을 부가가치가 높은 신규 약제로서 개발하고자 변이원성 등의 생리활성 효과를 검토한 결과를 보고하고자 한다.
- )는 국내에 자원이 풍부하고 민간요법에서 창이자라 하여 감기, 두통, 류머티스, 관절염, 해열 및 발한 등 각종 질병에 빈번히 응용되고 있다<10). 이처럼 도꼬마리가 다양한 약리 작용을 하는 것으로 보아 항균성 및 항암성 물질의 존재가 예상되어, 본 연구자는 한국산 도꼬마리로부터 새로운 항균 및 항암효과 등 다양한 생리활성기능이 있는 신규물질의 탐색과 응용을 위한 일환으로서 도꼬마리로부터 추출한 성분이 광범위한 항균효과 및 항암효과를 가진다는 사실과 더 불어분자량 386, 230 및 248인 항균 및 항암성 물질을 분리 ■ 정제한 결과를 보고하였다(11, 12). 따라서 본 연구에서는 도꼬마리 추출물과 정제물질을 부가가치가 높은 신규 약제로서 개발하고자 변이원성 등의 생리활성 효과를 검토한 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- HBS (HEPES buffer saline: NaCl 0.8%, KC1 0.04%, NaHPO4 . 12H2O 0.025%, Glucose 0.1%, HEPES 0.59%, pH 7.0)로 세척한 다음, 50 11M H2O2가 첨가된 HBS buffer를 넣고 30분간 다시 배양한 후 10% FBS가 첨가된 MEM 배지를 넣어 5일간 배양하였다. 다시 MEM배지를 제거하고 99% 메탄올을 첨가하여 cell을 고정시킨 다음 Giemsa stain 용액으로 염색한 후 세포수를 측정하였다.
- Salmonella typhimurium TA98 및 Salmonella typhimurium TA100을 하룻밤 배양시킨 배양액 100 111을 가한 후 XE-N (ether 중성 추출물) 및 XEA-N (ethylacetate 중성 추출물)의 최종 농도를 각각 1 ug/ml, 10 Jig/ml로 조제하여 분주하고, 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4)로 전체 용량이 700 μ1가 되도록 하였다. 이것을 37 ℃ 에서 20분간 incubation한 후 histidine/biotin 이 첨가된 top agar를 2 ml씩 가하여 잘 혼합한 후 minimal glucose agar plate 상에 평판 고화시킨 후, 37 ℃ 에서 48시간 배양하여 His* 복귀변이 colony수를 계측하여 돌연변이 원성의 유무를 판정하였다.
- V79 cell을 2일간 배양한 후, 200 cells/ml이 되도록 조정하여 dish (60 nun)당 10% FBS가 함유된 MEM 배지에서 3 7℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 배양 毛 배지를 제거하고 무혈청 MEM배지에 시료를 첨가한 후 다시 4시간 동안 배양하였다. HBS (HEPES buffer saline: NaCl 0.
- 추출하였다. 무수 NazSO, 로 건조한 후, 농축하여 항균 및 항암효과를 검토한 다음, 농축액을 소량의 methanol로용해시켜 TLC (Silica gel 60 F254)를 사용하여 정성 분석하고 항균 활성이 우수한 signal을 silica gel column을 사용하여 분리하였다. 분리된 물질은 HPLC (Shimadzu LC-10AD, Shimpak column Ci8) 및 GC/MS를 통하여 분석하여 정제 도와 분자량을 확인하였으며, 정제과정 중의 항균성 물질의 확인은 E.
- 이것을 37 ℃ 에서 20분간 incubation한 후 histidine/biotin 이 첨가된 top agar를 2 ml씩 가하여 잘 혼합한 후 minimal glucose agar plate 상에 평판 고화시킨 후, 37 ℃ 에서 48시간 배양하여 His* 복귀변이 colony수를 계측하여 돌연변이 원성의 유무를 판정하였다. 변이원으로는 4-nitro-o-phenylenediamine (NPD), 4-nitroquinoline-N-oxide (NQNO) 및 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoquanidine (NTG)를 대조구로서 비교하였다.
- , USA)하였다. 전기 영동한 gel의 단백질을 PVDF membrane으로 전사시킨 후, 이 membrane을 5% skim milk/}- 함유된 TBS buffei■에 넣어 4℃ 에서 1일간 방치하여 membranee! 비특이성 부위들을 차단하였다. 이 skim milk를 제거한 후 membrane을 1차 항체인 p53 (Ab-3)을 1 : 500 비율로 희석한 용액에 담가 실온에서 2시간 반응시킨 후 세척하여 2차 항체인 peroxide Goat anti Mouse IgG를 넣어 실온에서 1~2시간 반응하였다.
- 이 skim milk를 제거한 후 membrane을 1차 항체인 p53 (Ab-3)을 1 : 500 비율로 희석한 용액에 담가 실온에서 2시간 반응시킨 후 세척하여 2차 항체인 peroxide Goat anti Mouse IgG를 넣어 실온에서 1~2시간 반응하였다. 세척한 membrane을 ECL detection kit (Amersham Co., USA)의 발색 시약 혼합액으로 도포한 다음, X-ray 필름에 노출하여 현상한 후 필름상의 띠를 관찰하였다.
- , Japan)와 정제수는 자유로이 공급하였다. 실험동물은 각각 5마리씩 네 군으로 나누었으며, 도꼬마리의 정제 물과 추출물은 각각 사료의 0.2% 및 1% 농도로 첨가하여 제공하였고 발암물질인 MNNG는 10% DMSO에 용해한 후 150 ㎎/㎏ b. w.
- w.으로 1회 경구 투여하였다. 즉 MNNG 투여 4시간 후부터 시료가 혼합된 사료를 3일간 공급하였으며, 이때 대조군은 10% DMSO를 150 ㎎/㎏ b.
- w.으로 1회 경구 투여한 다음 사료만 3일간 공급하였다. 동물의 처치는 CO2로 마취 시켜 복부 정중선을 따라 개복하였다.
- 4)로 전체 용량이 700 μ1가 되도록 하였다. 이것을 37 ℃ 에서 20분간 incubation한 후 histidine/biotin 이 첨가된 top agar를 2 ml씩 가하여 잘 혼합한 후 minimal glucose agar plate 상에 평판 고화시킨 후, 37 ℃ 에서 48시간 배양하여 His* 복귀변이 colony수를 계측하여 돌연변이 원성의 유무를 판정하였다. 변이원으로는 4-nitro-o-phenylenediamine (NPD), 4-nitroquinoline-N-oxide (NQNO) 및 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoquanidine (NTG)를 대조구로서 비교하였다.
- 사용하여 ?회 열수 추출하여 감압 농축한 열수 추출액 (1 L)을 ether 및 ethylacetate를 이용하여 분별 추출하고, 각 추출물을 다시 중성, 산성, 염기성의 6개 fraction으로 나누어 추출하였다. 무수 NazSO, 로 건조한 후, 농축하여 항균 및 항암효과를 검토한 다음, 농축액을 소량의 methanol로용해시켜 TLC (Silica gel 60 F254)를 사용하여 정성 분석하고 항균 활성이 우수한 signal을 silica gel column을 사용하여 분리하였다.
대상 데이터
- 6주령된 Wistar male rat을 SLC, Inc. (Shizuoka, Japan)으로부터 분양받아 사용하였고, 이들 rate 23±2℃, 상대습도 55±10%를 유지하고 밤, 낮의 길이를 12시간씩 인공 조명으로 조절하여 사육하였다. 이때 사료 (CRF-1, Japan Charles River Co.
- 본 실험에서 사용된 재료는 경남 . 경북 지역의 산야에 자생하는 Xanthium strumarium L. (한국명: 도꼬마리)을 2000년 10월 중 채취하여 음건, 세절한 후 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 재료는 경남 . 경북 지역의 산야에 자생하는 Xanthium strumarium L.
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세포배양
세포주는 Raw 264.7 (대식세포주) 그리고 Chinease Hamster V79 (lung fibroblast) 등을 동경공업대학으로부터 분양 받아 10% FBS (fetal bovain serum) 와 1% antibiotics (streptomycin /penicillin)?]- 함유된 RPMI-1640 배지를 사용하여 37℃, 5% C6에서 배양하였다.
이론/모형
- 대식세포의 IL-W, IL-2 및 TNFa의 활성은 rat anti mouse IL-10 단클론항체 (Endogen), rat anti mouse IL-2 단크론 항체 및 rat anti mouse TNFa 단크론항체와 ELISA법을 이용하여 측정하였다. 먼저 5xl05 cells/m로 대식세포를 조정하여 96 well culture plate 의 각 well 에 180 ]11씩 분주하고 적당한 농도로 조절한 각 시료들을 20 μ1씩 넣어 37V, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다.
- 도꼬마리 추출물의 변이원성을 검토하기 위하여 Ames법 (13)을 이용하여 변이원성의 유무를 확인하였다. Salmonella typhimurium TA98 및 Salmonella typhimurium TA100을 하룻밤 배양시킨 배양액 100 111을 가한 후 XE-N (ether 중성 추출물) 및 XEA-N (ethylacetate 중성 추출물)의 최종 농도를 각각 1 ug/ml, 10 Jig/ml로 조제하여 분주하고, 0.
- 무수 NazSO, 로 건조한 후, 농축하여 항균 및 항암효과를 검토한 다음, 농축액을 소량의 methanol로용해시켜 TLC (Silica gel 60 F254)를 사용하여 정성 분석하고 항균 활성이 우수한 signal을 silica gel column을 사용하여 분리하였다. 분리된 물질은 HPLC (Shimadzu LC-10AD, Shimpak column Ci8) 및 GC/MS를 통하여 분석하여 정제 도와 분자량을 확인하였으며, 정제과정 중의 항균성 물질의 확인은 E. coli K-12 및 B. subtilis PCI-219주를 사용하여 agar diffusion법으로 확인하였다.
- 조직 중의 glutathione 함량은 Ellman의 방법(14)에 의하여 측정하였고, 그 함량은 조직 lg 당 umole로 나타내었다.
성능/효과
- Table 2에서 보는 바와 같이 压。2만 처리시 세포의 생존율은 23.5% 정도인데 비하여 压。2와 XEA-A, XEA-B 및 XE-A 추출물을 함께 처리하였을 때는 각각 58%, 53%, 63%로서 생존율이 2배 이상 증가하여 H2O2 에 의해 야기된 cytotoxicity를 예방할 수 있다고 사료되었다. 한편 XE-N 및 XE-N에서 분리된 항균, 항암효과를 가지는 XE-N-S1(12)은 대조구에 비하여 약 10% 정도의 항산화 효과가 있다고 추정되었다.
- 4배 증가)으로 높은 활성을 나타내었다. IL-”의 생성은 XE-B 추출물에서 높게 나타났으며(Fig. 2), IL-2의 생성에는 뚜렷한 활성을 나타내지 않았다(Fig. 3). 따라서 도꼬마리 추출물 중 몇 종이 대식세포 활성화 및 cytokine 류 생성에 관여한다고 사료되었으며, XE-N의 경우 대식세포를 활성화하여 가장 높은 cytokine류를 유리함을 확인하였다.
- 또한 DNA 손상 정도가 심하여 복구가 불가능할 경우 세포사 (apoptosis)를 일으켜 손상된 DNA로부터 증식되는 세포를 미리 제거시키는 암 억제 유전자로 알려져 있다(17). 도꼬마리 정제물 (XE-N-S1) 및 추출물 (XE-N)과 MNNG를 투여한 rat의 microsome을 이용한 immunoblot 분석에서 p53의 수준이 MNNG 투여군에 비하여도 꼬마리 추출물을 함께 투여한 경우에 증가하였다(Fig. 5). 이는 p53 암억제 유전자의 발현으로 MNNG에 의해서 손상된 세포의 무절제한 증식이 억제되어 종양으로의 발전이 차단된 효과로 생각된다.
- 도꼬마리 추출물 (XE-N) 및 정제물 (XE-N-S1)의 GSH의 함량 변화에 대한 영향을 MNNG를 투여한 rat을 통하여 살펴본 결과, Fig. 4와 같이 MNNG를 투여한 GSH 함량을 살펴보면 MNNG 단독 투여로 감소한 GSH 함량이 도꼬마리 정제 물 0.2% 투여군에서 약 44.6%, 도꼬마리 추출물 투여군에서 약 41.5% 증가되었음을 알 수 있었다. GSH는 생체 내에서 환원상태로 존재하며 DNA 합성물질의 이동, 효소활성 조절, 활성산소나 free radical에 의한 세포손상 예방 등에 직접 또는 간접적으로 관여한다(15).
- 따라서 산화상태 혹은 산화적 스트레스의 영향을 받아 그 함량이 낮을 경우, 세포손상 및 독성에 대한 민감도가 높아져 간 질환, AIDS 등의 질병을 일으키게 된다(16). 따라서 MNNG가 체내로 흡수되면서 조직에 산화상태 혹은 산화적 스트레스 환경을 유발하여 이를 해독하기 위한 GSH의 소모로 인해 체내 GSH가 감소하였으며, 도꼬마리 정제물 및 추출물의 투여로 체내의 GSH 소모를 덜어주어 그 함량이 증가된 것으로 추측된다.
- 3). 따라서 도꼬마리 추출물 중 몇 종이 대식세포 활성화 및 cytokine 류 생성에 관여한다고 사료되었으며, XE-N의 경우 대식세포를 활성화하여 가장 높은 cytokine류를 유리함을 확인하였다.
- typhimurium TA98 및 TA100에 대한 변이원성 실험 결과를 Table 1에 나타내었다. 변이원으로는 NPD, NQNO 및 NTG를 사용하여 대조구로서 비교하였으며, 시료인 추출물 XE-N과 XEA-N의 농도가 증가해도 TA 98 및 TA100 두 균주의 복귀변이 colony수가 대조구에 비해 변화가 크지 않은 점을 미루어 보아 각 추출물은 변이원성이 없는 것으로 확인되었다.
- 이상의 결과에서 도꼬마리 추출물은 전반적으로 항산화능, 면역증강효과, 암 예방효과 등의 기능성이 있는 것으로 입증되었으며, 각 기능에 따른 다양한 물질을 분리하여 신소재로의 개발 가능성이 큰 약제임이 확인되었다.
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