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문제 정의
- 그러므로 TAR cloning 과정에서 상동성재조합 과정에 직접 관여하는 target hook의 염기 조 성비는 TAR cloning법의 유전자 분리빈도에 중요한 요인으로 작용할 수 있을 것이다. 그러므로 본 연구에서는 TAR cloning 법에 이용되는 target hook의 염기서열 정보에 따른 상동성재조 합과정에 미치는 영향을 조사하기 위하여, mouse 모델계(v-Ha- ras: Tg-AC transgene)(12)를 사용하여 60bp hook 염기서열 내의 GC content에 따른 유전자 클로닝빈도를 비교 분석하였다. 그 결과 hook 염기서열 내의 GC content가 약 40%일 때 형질전환빈도 및 목적재조합체의 분리빈도가 가장 높은 것으로 나타났다.
제안 방법
- The functional DNA segments of the plasmid are indicated as follows: CEN6 = a 196 bp fragment of the yeast centromere VI; HIS3 = selective marker for yeast cells; Amp = ampicillin-resistance gene. A set of TAR vectors with targeting hook sequences (60 bp SV-hook) 3' to the end of the transgene, containing different GC contents was constructed. A 130 bp mouse Bl element was cloned into Sall-Smal sites of a pSV-GC-Bl vector.
- 1). Mouse의 130 bp Bl 반복 서열 은 pWJ522 vectorS- 사용하여 PCR 방법으로 중폭후, pVC604 vector의 SaH-Smal 자리에 삽입하여 pVC604-Bl vector를 제작하였다(Fig. 2A).다양한 GC contend 가지는 60 bpel target hook 의 제작은 mouse model system의 SV40 polyA 서열을 이용하여 각각 18.
- 이 primary gene pool에서 positive PCR 밴드가 확인되면 이로부터 각각의 colony를 사용하여 두 번째 colony PCR을 수행하여 확인하였다(Table 1). PCR 반응은 9700 Thermocycler(Perkin-Elmer)를 사용하여 94℃, 2분간 1 cycle, 그리고 94℃, 30초→58℃, 30초→68℃, 1분의 반응을 30 cycles 반응시킨 후, 72℃에서 10분 1 cycle의 연장 반응을 수행하였다. PCR 산물은 1.
- PCR 반응은 9700 Thermocycler(Perkin-Elmer)를 사용하여 94℃, 2분간 1 cycle, 그리고 94℃, 30초→58℃, 30초→68℃, 1분의 반응을 30 cycles 반응시킨 후, 72℃에서 10분 1 cycle의 연장 반응을 수행하였다. PCR 산물은 1.5%의 SeaKem GTG agarose gel을 사용하여 전기영동을 통하여 확인하였다.
- )를 이용하여 세 번 이상의 독립적인 실험을 통해 얻어진 1, 600개의 형질 전환체를 비교 분석하였다(Table 4). Positive clone의 선별에는 transgene system의 1.0 kb zeta globin-promoter 부위를 ZG-F, ZG-R primer (Table 1)를 사용하여 PCR 방법으로 증폭한 후 전기영동으로 확인하였다(재료 및 방법 참조).그 결과 가장 낮은 형질전환빈도를 보였던 pSV-GClO vector를 사용한 실험에서 1, 600개의 형질전환 체중 8개의 positive clone이 확인되어 0.
- Positive clone의 확인을 위하여 먼저 gene pool로부터 뽑은 DNA를 사용하여 Tg-AC transgene의 zeta globin-promoter 내의 54 bp 에서 469bp(416bp PCR product)까지의 영역으로 PCR을 수행하였다. 이 primary gene pool에서 positive PCR 밴드가 확인되면 이로부터 각각의 colony를 사용하여 두 번째 colony PCR을 수행하여 확인하였다(Table 1).
- SC-His plate에서 자란 형질 전환체를 멸균된 이쑤시개를 이용하여 한plate에 30개의 colony를 patch하여 하나의 gene pool로 정하였다. 30℃에서 2~3일 배양 후 다시 SC-His plate에 복제하여 복제본을 만들고 원본은 4℃에 보관하고 복제본은 30℃에서 2일 배양하였다.
- Target hook의 GC content 비율에 따른 유전자 분리빈도를 조사하기 위해 먼저 5종류의 vector(pSV-GClt), pSV-GC20, pSV-GC30, pSV-GC40, pSV-GC50)를 이용하여 세 번 이상의 독립적인 실험을 통해 얻어진 1, 600개의 형질 전환체를 비교 분석하였다(Table 4). Positive clone의 선별에는 transgene system의 1.
- 그러나 염색체상의 염기서열은 hook의 길이에 비례적으로 항상 균일한 염기 조성비를 나타내지는 않는다. 그러므로 본 실험에서는 60 bp 의 hook을 세 영역으로 나누고, 비교적 높은 GC content(65%)를 지닌 염기서열을 왼쪽(L; Left)과 중앙(M; Middle), 오른쪽(R; Right)으로 분포되게 세 종류의 TAR vector (pSV-GC65L, pSV-GC65M, pSV-GC65R)를 제작하였다. 이 vector 들의 최종 GC content는 각각 45.
- 2A).다양한 GC contend 가지는 60 bpel target hook 의 제작은 mouse model system의 SV40 polyA 서열을 이용하여 각각 18.5%, 23.3%, 28.5%, 38.3%, 45.0%의 GC content# 포함하도록 PCR 방법을 이용하여 제작하였으며 (Table 1, Table 2), ApaleSall 자리에 각각의 절편을 삽입하여 pSV-GC10(18.5%), pSV-GC20(23.3%), pSV-GC30(28.5%), pSV-GC40(38.5%), pSV- GC50(45.0%) vector로 제작하였다(Fig. 2). 또한, GC content의 분포 위치가 TAR Zoning 빈도에 미치는 영향을 조사하기 위해, 60 bp의 target hook을 20 bp씩 세부분으로 나누어 각각 왼쪽(L; Left), 중앙(M; Middle), 오른쪽(R; Right) 부분에 65%의 GC content가 분포되게 target hook을 제작하고 pVC604-B 1 vectore! Apal-Sall 자리에 삽입하여 각각 pSV-GC65L, pSV-GC65M, pSV-GC65R vector라고 명하였다(Fig.
- Yeast spheroplasts를 만들기 위하여 50 ml YPD 액체배지에 VL6-48 균주를 접종한 후 30℃에서 O/N culture 하였다. 다음날, 분광광도계를 사용하여 O.D600= 0.13~0.14 정도에서 균주를 집균하고 침전된 균체를 멸균수로 50 ml로 혼탁한 후 다시 집균하여 20ml의 IM sorbitol로 혼탁한 후 4℃에 30분간 두었다. 이 균주를 700 xg, 4, C에서 5분간 원심 분리하여 집균한 후 20ml SPE 용액(IM sorbitol, 0.
- 한 번의 형질전환 실험에 각각 1 μg의 선형 1AR vector와 2 μg의 게놈 DNA를 사용하였다. 또한 실험오차를 줄이 기 위하여 한 번의 형질전환 실험마다 각 vector별로 10번의 실험을 동시에 수행하여 오차가 적은 실험군 만을 선별하였으며, 이러한 형질전환 실험을 독립적으로 세 번 수행하여 평균을 나타내었다. 그 결과 오차값의 범위는 약 10% 이내로 나타났다.
- 상동성재조합에 미치는 GC content 비율를 조사하기 위하여 target hook 서열의 GC content# 달리한 5종류의 TAR vector를 제작하여 target hook의 최적 GC content 비율을 조사하였다. 그러나 염색체상의 염기서열은 hook의 길이에 비례적으로 항상 균일한 염기 조성비를 나타내지는 않는다.
- 5 M ED1A)을 첨가하여 현탁하고 20 μ1의 zymolyase (10 mg/ ml)와 40μ1의 14 Mmercaptoethanol을 넣어 잘 섞은 후, 30℃에서 약 20분간 매우 느리게 진탕배양하였다. 세포의 spheroplast 정도를 조사하기 위해 현탁액을 IM sorbitole 2% SDS에 넣어 혼탁한 후, O.D600 값을 측정하여 O.D600 값의 차이가 3~5배 정도가 되도록 하였다. Zymolyase의 처리가 끝난 세포를 100 X g, 41에서 5분간 원심분리하여 집균한 뒤 [J-mercaptoethanol 제거를 위해 차가운 IM sorbitol로 2번 씻어주었다.
- Positive clone의 확인을 위하여 먼저 gene pool로부터 뽑은 DNA를 사용하여 Tg-AC transgene의 zeta globin-promoter 내의 54 bp 에서 469bp(416bp PCR product)까지의 영역으로 PCR을 수행하였다. 이 primary gene pool에서 positive PCR 밴드가 확인되면 이로부터 각각의 colony를 사용하여 두 번째 colony PCR을 수행하여 확인하였다(Table 1). PCR 반응은 9700 Thermocycler(Perkin-Elmer)를 사용하여 94℃, 2분간 1 cycle, 그리고 94℃, 30초→58℃, 30초→68℃, 1분의 반응을 30 cycles 반응시킨 후, 72℃에서 10분 1 cycle의 연장 반응을 수행하였다.
- 이에 앞서 Ma 등(16)에 의해 DNA 단편과, 이 DNA 단편과 상동 성 서열을 양 끝에 포함하는 선형 vector를 동시에 효모 내로 형질전환할 경우, 효모 내에서 일어나는 상동성재조합에 의해선형 vector와 DNA 단편이 환형의 DNA 분자로 재구성됨이 밝혀졌다. 이러한 결과를 기초로 TAR cloning법이 개발되었고, 이 방법은 목적 유전자의 양쪽 말단에 존재하는 유전자 정보를 이용하여 vector를 제작하게 된다. TAR vector는 먼저 목적 유전자(혹은 특정 염색체 부위)의 양쪽 끝에 존재하는 염기배열 정보를 이용하여 짧은 DNA 단편(200- 800 bp)을 target hook으로 만들어 TAR vector내의 multi-cloning site에 삽입한다(11).
- 그러므로 상동성 재조합을 기본으로 한 TAR cloning 법에서 이러한 과정에 가장 중요한 역할을 하는 hook 염기 조성의 비율은 중요한 요인으로 작용할 수 있다. 이러한 목적으로 제작된 GC content 비율을 달리한 5종의 vector와 GC content 분포를 달리한 3종의 vector를 이용하여 spheroplast transformation0], 대한형질 전환빈도를 비교하였다 3). 한 번의 형질전환 빈도를 비교하였 다(Table 3).
- 이러한 목적으로 제작된 GC content 비율을 달리한 5종의 vector와 GC content 분포를 달리한 3종의 vector를 이용하여 spheroplast transformation0], 대한형질 전환빈도를 비교하였다 3). 한 번의 형질전환 빈도를 비교하였 다(Table 3). 한 번의 형질전환 실험에 각각 1 μg의 선형 1AR vector와 2 μg의 게놈 DNA를 사용하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용되는 transgenic mouse 인 Tg.AC mouse (Taconic Inc.)에는 1.0 kb의 zeta-globin promotor 부위와 돌연변이 된 1.8 kb의 V-Ha-ras gene, 그리고 0.9 kb의 3'SV40 polyA부우]가 transgene되어 있으며, Tg-AC transgenic mouse의 간에서 게놈DNA를 직접 주줄 하여 사용하였다. Vector 내의 target hooks의 한쪽은 mouse의 반복 서열인 130bp의 B1 서열을 가지고, 다른 한쪽은 다양한 GC content (18.
- Vladimir Larionov로부터 제공받았다. Vector DNA의 증폭에는 대장균 균주인 DH5a(wpE44, AlacU169(<D80lacZAM15), hsdR17, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, 를 이용하였다.
- 본 실험에 사용된 줄아효모(Sacc/wwsnyces cerevisiae)는 VL6- 48(M47h his3-^200 trpl-Al met 14 ura3-52 ade2-l0l Zys2)로서 spheroplast tamsformation에 대해 매우 높은 형질 전환률을 나타내며(10), 미국 National Institute of Health (NIH)의 Dr. Vladimir Larionov로부터 제공받았다. Vector DNA의 증폭에는 대장균 균주인 DH5a(wpE44, AlacU169(<D80lacZAM15), hsdR17, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, 를 이용하였다.
- 한 번의 형질전환 빈도를 비교하였 다(Table 3). 한 번의 형질전환 실험에 각각 1 μg의 선형 1AR vector와 2 μg의 게놈 DNA를 사용하였다. 또한 실험오차를 줄이 기 위하여 한 번의 형질전환 실험마다 각 vector별로 10번의 실험을 동시에 수행하여 오차가 적은 실험군 만을 선별하였으며, 이러한 형질전환 실험을 독립적으로 세 번 수행하여 평균을 나타내었다.
이론/모형
- (17)의 방법을 사용하였고, spheroplast transformation0, ]사용된 배지와 배양조건은 Leem et d.(15)에 의한 방법을 사용하였다.
성능/효과
- GC content의 분포를 달리한 pSV-GC65L, pSV-GC65M, pSV- GC65R vector에서는 비교적 유사한 형질전환빈도(240, 220, 210 colonies/plate)를 나타내었으나, GC content의 비율을 달리한 5종의 vector에서는 그 비율에 따라 형질 전환 빈도가 두 배 이상의 차이를 나타내었다(Table 3). pSV-GC40(38.
- R vector에서는 비교적 유사한 형질전환빈도(240, 220, 210 colonies/plate)를 나타내었으나, GC content의 비율을 달리한 5종의 vector에서는 그 비율에 따라 형질 전환 빈도가 두 배 이상의 차이를 나타내었다(Table 3). pSV-GC40(38.5%) vector> 사용한 경우 가장 높은 형질전환빈도(290colnies/plate)를 나타내었고, 이에 비해 가장 낮은 GC content의 비율을 지닌 pSV- GC10(18.5%) vector를 사용한 경우에는 다른 vector를 사용한 경우에 비해 두 배 이상 낮은 빈도(110 colonies/plate)를 나타내었다(Table 3).이 결과는 GC content 비율이 재조합과정에 영향을 줄 수 있다는 것을 시사하는 것으로 앞서 발표된 targeted gene replacement의 연구(5)와도 유사한 경향을 나타내었다.
- 그러므로 본 연구에서는 TAR cloning 법에 이용되는 target hook의 염기서열 정보에 따른 상동성재조 합과정에 미치는 영향을 조사하기 위하여, mouse 모델계(v-Ha- ras: Tg-AC transgene)(12)를 사용하여 60bp hook 염기서열 내의 GC content에 따른 유전자 클로닝빈도를 비교 분석하였다. 그 결과 hook 염기서열 내의 GC content가 약 40%일 때 형질전환빈도 및 목적재조합체의 분리빈도가 가장 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 hook 길이에 대한 정보와 함께 target hook의 제작에 있어 매우 유용한 정보로 이용될 것으로 사료 된다.
- 0 kb zeta globin-promoter 부위를 ZG-F, ZG-R primer (Table 1)를 사용하여 PCR 방법으로 증폭한 후 전기영동으로 확인하였다(재료 및 방법 참조).그 결과 가장 낮은 형질전환빈도를 보였던 pSV-GClO vector를 사용한 실험에서 1, 600개의 형질전환 체중 8개의 positive clone이 확인되어 0.5%의 빈도 를 나타내었다. 이와 동일한 빈도가 pSV-GC20 vector에서도 나타났으나 그 이상의 GC content# 지닌 vector에서는 1.
- 3%로 서 비율에는 차이를 두지 않았다. 그 결과 위에서 언급한 것과 같이 모두에서 형질전환빈도에 차이를 나타내지 않았으며, positive clone 의 분리빈도에 있어서도 각각 0.75%, 0.81%, 0.75%로 유사한 결과를 나타내었다(Table 4).
- 또한 약 45%의 GC content를 지닌 pSV-GC65L, pSV-GC65M, pSV-GC65R vectorS- 각각 사용한 경우 모두 비슷한 형질전환 빈도와 positive clone 분리빈도를 나타내어 60 bp target hook내 GC content의 분포 차이는 상동성재조합에 크게 영향을 미치지 않음을 보여주었다. 따라서 본 연구를 통해 target hook의 GC content는 TAR cloning에 중요한 인자로서 작용하며, 약 40%가량의 염기서열을 선택하였을 때 형질전환빈도 및 positive clone의 분리빈도가 가장 높게 나타났다. 이러한 결과는 TAR cloning의 빈도개선에 매우 유용한 자료로 사용될 것으로 사료된다.
- 5-2배 정도 증가하였으며, 그 중 pSV-GC40 vector는 가장 많은 13개의 positive clone이 확인되었다(Table 4). 따라서 약 40%가량의 GC content 를 가진 hook을 사용하였을 때 형질전환빈도 및 유전자 분리빈도가 동시에 가장 높게 나타나, TAR cloning의 hook 배열 선정에 있어 중요한 정보로 사용될 것으로 사료 된다.
- 3%일 때 가장 높게 나타났다. 또한 약 45%의 GC content를 지닌 pSV-GC65L, pSV-GC65M, pSV-GC65R vectorS- 각각 사용한 경우 모두 비슷한 형질전환 빈도와 positive clone 분리빈도를 나타내어 60 bp target hook내 GC content의 분포 차이는 상동성재조합에 크게 영향을 미치지 않음을 보여주었다. 따라서 본 연구를 통해 target hook의 GC content는 TAR cloning에 중요한 인자로서 작용하며, 약 40%가량의 염기서열을 선택하였을 때 형질전환빈도 및 positive clone의 분리빈도가 가장 높게 나타났다.
- 위의 결과를 종합하면, 형질전환빈도 및 유전자 분리빈도가 target hook 서열의 GC content가 18.5%일 때 가장 낮게 나타났으며, 38.3%일 때 가장 높게 나타났다. 또한 약 45%의 GC content를 지닌 pSV-GC65L, pSV-GC65M, pSV-GC65R vectorS- 각각 사용한 경우 모두 비슷한 형질전환 빈도와 positive clone 분리빈도를 나타내어 60 bp target hook내 GC content의 분포 차이는 상동성재조합에 크게 영향을 미치지 않음을 보여주었다.
- 5%의 빈도 를 나타내었다. 이와 동일한 빈도가 pSV-GC20 vector에서도 나타났으나 그 이상의 GC content# 지닌 vector에서는 1.5-2배 정도 증가하였으며, 그 중 pSV-GC40 vector는 가장 많은 13개의 positive clone이 확인되었다(Table 4). 따라서 약 40%가량의 GC content 를 가진 hook을 사용하였을 때 형질전환빈도 및 유전자 분리빈도가 동시에 가장 높게 나타나, TAR cloning의 hook 배열 선정에 있어 중요한 정보로 사용될 것으로 사료 된다.
후속연구
- 따라서 본 연구를 통해 target hook의 GC content는 TAR cloning에 중요한 인자로서 작용하며, 약 40%가량의 염기서열을 선택하였을 때 형질전환빈도 및 positive clone의 분리빈도가 가장 높게 나타났다. 이러한 결과는 TAR cloning의 빈도개선에 매우 유용한 자료로 사용될 것으로 사료된다.
- 그 결과 hook 염기서열 내의 GC content가 약 40%일 때 형질전환빈도 및 목적재조합체의 분리빈도가 가장 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 hook 길이에 대한 정보와 함께 target hook의 제작에 있어 매우 유용한 정보로 이용될 것으로 사료 된다.
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