CHO 세포와 형질전환 닭에 있어서 Retrovirus Vector System에 의한 hFSH 재조합 유전자의 전이와 발현 Transfer and Expression of the Recombinant hFSH Gene in CHO Cells and Transgenic Chickens using Retrovirus Vector System원문보기
hFSH는 $\alpha$와 $\beta$ subunit으로 구성된 heterodimer로서 두 subunit의 조합은 활성을 지닌 호르몬의 생산에 있어서 매우 중요한 단계이다. 이 조합과정의 효율을 증대하기 위하여 본 연구에서는 hFSH를 단일사슬의 단백질로 구축하고자 하였으며, 이의 일환으로 각 subunit 대한 cDNA단편을 연결하는 서열로 CTP linker를 도입하였다. 재조합한 hFSH-CTP 유전자는 pseudotype의 retrovirus vector system을 이용하여 CHO 세포와 닭의 배로 각각 전이되었다. CHO 세포에서의 FSH의 생산은 $\alpha$와 $\beta$를 각각 전이한 경우에 비해 hFSH-CTP를 전이한 경우에서 17배 이상 높은 것으로 나타났다. 닭에서는 유전자 전이를 시도한 62개체 중에서 11마리가 부화하였으며 그 중 10마리가 형질전환된 닭인 것으로 RT-PCR을 통하여 확인되었다. 그러나 개체의 혈중 FSH의 생산은 확인하지 못하였다. 이상의 실험 결과를 바탕으로 하여 재조합된 hFSH-CTP는 FSH의 발현에 매우 효율적인 구조로 생각되며, 또한 retrovirus를 이용한 유전자 전이 방법은 형질전환 가금의 생산에 있어서 매우 적절한 방법으로 사료된다.
hFSH는 $\alpha$와 $\beta$ subunit으로 구성된 heterodimer로서 두 subunit의 조합은 활성을 지닌 호르몬의 생산에 있어서 매우 중요한 단계이다. 이 조합과정의 효율을 증대하기 위하여 본 연구에서는 hFSH를 단일사슬의 단백질로 구축하고자 하였으며, 이의 일환으로 각 subunit 대한 cDNA단편을 연결하는 서열로 CTP linker를 도입하였다. 재조합한 hFSH-CTP 유전자는 pseudotype의 retrovirus vector system을 이용하여 CHO 세포와 닭의 배로 각각 전이되었다. CHO 세포에서의 FSH의 생산은 $\alpha$와 $\beta$를 각각 전이한 경우에 비해 hFSH-CTP를 전이한 경우에서 17배 이상 높은 것으로 나타났다. 닭에서는 유전자 전이를 시도한 62개체 중에서 11마리가 부화하였으며 그 중 10마리가 형질전환된 닭인 것으로 RT-PCR을 통하여 확인되었다. 그러나 개체의 혈중 FSH의 생산은 확인하지 못하였다. 이상의 실험 결과를 바탕으로 하여 재조합된 hFSH-CTP는 FSH의 발현에 매우 효율적인 구조로 생각되며, 또한 retrovirus를 이용한 유전자 전이 방법은 형질전환 가금의 생산에 있어서 매우 적절한 방법으로 사료된다.
hFSH (human follicle stimulating hormone) is heterodimer consisting of $\alpha$ and $\beta$ subunits. Since assembly of the both subunits in the cell is often the rate-limiting step in production of functional hormone, single-chain hormones have been engineered by genetically l...
hFSH (human follicle stimulating hormone) is heterodimer consisting of $\alpha$ and $\beta$ subunits. Since assembly of the both subunits in the cell is often the rate-limiting step in production of functional hormone, single-chain hormones have been engineered by genetically linking two different cDNA fragments with a linker sequence. Using retrovirus vector system, the resulting recombinant hFSH gene was transferred in CHO cells and chicken embryos, and the expression of the gene was investigated. In CHO cells, protein synthesis from the single-chain FSH gene was 17 fold higher than that from the heterodimeric counterpart. In the study of transgenic chickens, ten of the eleven chicks hatched from 62 embryos manupulated with recombinant retrovirus stock was determined to carry transgenic genes. RT-PCR analyses confirmed transcription of the single-chain FSH gene, however, no recombinant FSH was detected from the blood samples.
hFSH (human follicle stimulating hormone) is heterodimer consisting of $\alpha$ and $\beta$ subunits. Since assembly of the both subunits in the cell is often the rate-limiting step in production of functional hormone, single-chain hormones have been engineered by genetically linking two different cDNA fragments with a linker sequence. Using retrovirus vector system, the resulting recombinant hFSH gene was transferred in CHO cells and chicken embryos, and the expression of the gene was investigated. In CHO cells, protein synthesis from the single-chain FSH gene was 17 fold higher than that from the heterodimeric counterpart. In the study of transgenic chickens, ten of the eleven chicks hatched from 62 embryos manupulated with recombinant retrovirus stock was determined to carry transgenic genes. RT-PCR analyses confirmed transcription of the single-chain FSH gene, however, no recombinant FSH was detected from the blood samples.
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문제 정의
본 연구에서는, 당단백질의 합성시 사람의 뇌하 수체에서 분비되는 경우와 유사한 형태로 올리고 당의 부가가 이루어지는 것으로 알려진 CHO (Chinese hamster ovary) 세포를 표적세포로 하여(Takeshi 등, 1989), in 에서 재조합 FSH의 발현을 확인하고자 하였다. 또한 생산된 retrovirus vector 를 이용하여 재조합 FSH 유전자를 닭의 genome 내로 전이시켜서 형질전환 닭을 생산하고자 하였다.
본 연구에서는, 당단백질의 합성시 사람의 뇌하 수체에서 분비되는 경우와 유사한 형태로 올리고 당의 부가가 이루어지는 것으로 알려진 CHO (Chinese hamster ovary) 세포를 표적세포로 하여(Takeshi 등, 1989), in 에서 재조합 FSH의 발현을 확인하고자 하였다. 또한 생산된 retrovirus vector 를 이용하여 재조합 FSH 유전자를 닭의 genome 내로 전이시켜서 형질전환 닭을 생산하고자 하였다.
부화 후 2주가량 경과한 병아리의 조직에서 FSH-CTP 유전자의 발현을 확인하고자 하였다. 절 취한 날개 말단 조직은 액체질소에 넣어서 동결시 킨 후 미세하게 파쇄하여 Trizol (Gibco BRL, USA)을 사용하여 RNA를 분리하였다.
hFSH는 a와 P subunit으로 구성된 heterodimer 로서 두 subunit의 조합은 활성을 지닌 호르몬의 생산에 있어서 매우 중요한 단계이다. 이 조합과정의 효율을 증대하기 위하여 본 연구에서는 hFSH 를 단일사슬의 단백질로 구축하고자 하였으며, 이 의 일환으로 각 subunit에 대한 cDNA 단편을 연결 하는 서열로 CTP linker를 도입하였다. 재조합한 hFSH-CTP 유전자는 pseudotype 의 retrovirus vector system을 이용하여 CHO 세포와 닭의 배로 각각 전이되었다.
본 실험에서 linker로 사용한 CTP (carboxyl-terminal peptides)-^ hCG (human chorionic gonadotropin)의 p subunit의 113에서 145 아미노산 잔기에 해당하는 서열로, in 와 in 祈vo에서의 hCG의 생물학적 안정성에 기여하고(Sugahara 등, 1995; Matzuk 등, 1990), post-translational processing에 관여하여 효율적인 분비를 촉진하는 것으로 보고되었다 (Muyan and Boime, 1998). 이상의 보고에 근거하여 본 연구에서는 CTP에 해당하는 DNA 단편을 와 a의 유전자 사이에 linker 서 열로 도입함으로써 최종산물에 있어서 FS7邓의 카르복시말단과 a의 아미노말단의 연결 부위에 CTP linker를 삽입 하여 으〕분비와 신호 전달의 조절, 호르몬에 특이적인 post-translational modification의 효율을 증대시키고자 하였다.
성선자극호르몬이나 갑상선자극호르몬과 같이 2개의 subunit로 구성되는 호르몬에 있어서 각 subunit을 단일 사슬 유도체로 생산하는 것은 호르 몬 단백질의 생물학적 활성과 안정성을 증가시키 기 위한 시도이다. 이에 본 연구에서는 두 subunit 의 보다 효율적인 연결을 위하여 CTP를 linkerS. 도입하였는데, 이 CTP의 요소는 몇몇의 proline과 serine 잔기를 포함하고 있어서 두드러진 이차구조 가 나타나지 않는다.
In 에서 발현이 확인된 재조합 FSH를 in vivo인 닭의 genome 내로 전이시키기 위하여 고농 축된 retrovirus stock을 닭의 배반엽층에 주입하였다. 조작한 유정란의 부화율을 증가시키기 위하여 window 제작시 발생하는 물리적인 손상을 최소화 하고자 하였다. 그의 일환으로 window의 크기를 최소화하고 window의 제작시 발생하는 난각 파편 이 안으로 들어가지 않도록 하였으며 배자를 상단 부에 위치하도록 하여 조작 거리를 짧게 확보함으 로써 기실의 손상에 의한 부화율의 저하를 방지하고 micropipette의 말단을 경사진 형태로 제작하여 배반엽 층의 구멍이 최소화되도록 하였다.
가설 설정
FSH를 단일 사슬로 구축하기 위해서 iin- kei를 사용할지의 여부에 대한 결정은 이 linker.가 호르몬의 분비와 생물학적 활성에 필수적인가 하는 것이다. CTP를 두 subunit에 위치시킨 경우는 그렇지 않은 경우에 비해서 분비가 4배 정도 높게 나타났다{Klein 등, 2002).
제안 방법
Plasmid DNA를 지칭하는 경우에는 접두어로 "P"를 사용하였으며(예를 들어 pLNB-FSH-CTP), virus 생산세포에서 생산된 virus를 명명하는 경우에는 "P"를 사용하지 않았다(예를 들어 LN0Z). 보 조세포(helper cell) 에 plasmid DNA를 transfection 하거나 virus를 infection하여 구축된 virus 생산세 포의 명명은 전자의 경우에 있어서는 보조세포의 명칭 뒤에 plasmid 명칭을 연결하였고(예를 들면 PT67-pLN[5-F, SH-CTP), 후자의 경우에는 세포의 명칭 뒤에 virus 명칭을 결합시켰다(예를 들면 293mGPHy-LN"3H-CTP).
본 실험에 사용된 유정란은 이사브라운 산란계 의 종란 중에서 60+3 g 무게의 것으로서, 배자가 계란의 적도 상단부에 위치하도록 하기 위해서 stage X의 종란을 측상향 위치 상태로 10시간 정치 한 후 window를 제 작하였다. 10)定/ml 의 polybrene 을 첨가한 virus stock의 주입은 특수가공한 microinjection pipette (SIGMA, pipette, microcapillary, 50 yl, 100 mm length)을 이용하여 배의 하층에 주 입하였으며, virus의 주입이 끝난 계란은 window 를 paraUlm으로 3회 감아서 밀봉한 후 측상향 위치 상태로 26℃의 부화기에서 1시간 가량 정치함 으로써 온도 충격과 물리적 충격을 안정화시켰다. 37.
Virus의 titer# 측 정하기 위하여 농축 전과 후의 virus stock을 NIH3T3 세포에 감염시켰다. 24시간 경과 후 세포 를 3일 간격으로 G418이 첨가된 선별배양액으로 갈아주어 NeoR colony forming unit per milliliter (CFU/ml)를 측정하였다.
FS0a에 대한 primer로는 Cla I 의 제 한효소 부위 를 첨가한 + strand primer로 5'ATCGATGCTCCTGATGTG CA GGATTGC3'와 BamH I 부위를 첨가한 - strand primer로 5'GGATCCGGATAAGGAGGAA GGCA GTAA3, 를 사용하였다. CTP linker에 대한 primer 는 Bgl II 부위 를 첨가한 + strand primer로 5'AGA TCTTCCTCCTCTTCCTCAAAGGCC3', Cla I 부 위를 첨가한 - strand primer로 5'ATCGATGCTTT GTGGGAGGATCGGGGT3', 그리고 FS部에 대한 primer로는 Hind 皿 를 첨가한 + strand primer로 5'A AGCTTAGGATGAAGACACTCCAGTTTTTCTTC 3', 그리고 Bgl II site를 첨가한 - strand primer로 5' AGATCTTTCTTTCATTTCACCAAAGGAGCAGT A3, 를 사용하였다.
FSH의 발현율을 증가시키기 위하여 각 subunit 를 CTP linker로 연결하여 한 vector 내에서 FSH가 발현되도록 계획하였다.
In 에서 발현이 확인된 재조합 FSH를 in vivo인 닭의 genome 내로 전이시키기 위하여 고농 축된 retrovirus stock을 닭의 배반엽층에 주입하였다. 조작한 유정란의 부화율을 증가시키기 위하여 window 제작시 발생하는 물리적인 손상을 최소화 하고자 하였다.
절 취한 날개 말단 조직은 액체질소에 넣어서 동결시 킨 후 미세하게 파쇄하여 Trizol (Gibco BRL, USA)을 사용하여 RNA를 분리하였다. RT-PCRe 분리한 RNA 1 昭을 50 pmole의 primer, 0.2 mM dNTP, 1 mM MgSQ, 5 U AMV 역 전사 효소(Pro- mega), 5 U TeZDNA 중합효소(Promega), AMV/Tfl 5x 반응 완충액(Promega)으로 만든 반응액과 혼합 한 후, 일차적 cDNA를 합성하기 위하여 48'C에서 45분간 반응한 다음 AMV 역전사효소의 활성화와 RNA/cDNA/primer의 변성을 위해 94℃에서 2분간 반응시켰다. 2차 cDNA 합성과 PCR 증폭을 위하여 94℃ 에서 30초, 60℃ (FSH。의 경우), 52℃ (Neo 의 경우)에서 30초, 72'C 에서 30초간 반응하는 횟 수를 35회 반복 실시한 후, 최종 신장을 위해 72℃ 에서 5분간 방치하였다.
Virus를 주입한 군은 18%의 부화율을 나타내었는데 이는 retrovirus의 주입이 배발생이나 부화에 부 정적인 영향을 나타내는 것을 의미한다(Table 1). Retrovirus vector에 의한 성공적인 유전자 발현 에 대한 확인은 virus를 주입한 군 중 부화한 병아 리의 날개 말단 조직에서 분리한 RNA를 이용한 RT-PCR에 의해서 수행 되었다. 사용한 primer는 성 선자극호르몬의 종류에 따라서 특이적 subunit인 (3 subunit에 해당하는 primer와 Neo 유전자에 대한 primer를 사용하였으며, 그 결과 11마리 중 10마리 에서 396 bp의 FSHP와 600 bp의 Neo 유전자에 대한 산물을 전기영동 상에서 확인하였으며 형질전 환율은 약 91%로 나타났다
To each freshly laid egg, 10 M of DMEM/FBS, 100X post-concentrated virus stock was injected into the subgerminal cavity of stage X chicken embryos, then incubated for 21 days before RT-PCR assay.
45 网 pore-size의 cellulose acetate filter를 이용하여 여과한 후 - 에 보관하였다. Virus의 titer# 측 정하기 위하여 농축 전과 후의 virus stock을 NIH3T3 세포에 감염시켰다. 24시간 경과 후 세포 를 3일 간격으로 G418이 첨가된 선별배양액으로 갈아주어 NeoR colony forming unit per milliliter (CFU/ml)를 측정하였다.
5% agarose gel에서 전기영동을 실시하였다. 각각의 산물은 추출하여 pGEM-T Easy vector 내로 도입하였으며 각각의 절편을 단일 vector로 통합하여 pGEM-Teasy-FS/7-CTP를 구축한 다음 (Fig. 1), 각 절편의 DNA 염기서열을 sequencing을 통하여 확인하였다. 최종적인 retrovirus vector pla- smid는 pGEM-Teasy-FSH-CTP로부터 약 1 Kb의 FSH-CTP 절편을 분리하여 retroviral vector인 pLN 0Z의 E.
NIH3T3와 마찬가지로 G418 (800 i定/ml)을 첨가한 선별배양액으로 2주간 배양하였다. 감염과 선별과 정이 끝난 CHO-LN肝3H-CTP 세포를 24시간 배 양한 후 배양액을 수확하여 FSH를 정량하였다. 의 정 량은 Elecsys FSH reagent kit로 electro- chem-iluminescence immunoassay (ECLIA) 분석기 (Elecsys 2010, Roche)를 사용하여 수행하였다.
조작한 유정란의 부화율을 증가시키기 위하여 window 제작시 발생하는 물리적인 손상을 최소화 하고자 하였다. 그의 일환으로 window의 크기를 최소화하고 window의 제작시 발생하는 난각 파편 이 안으로 들어가지 않도록 하였으며 배자를 상단 부에 위치하도록 하여 조작 거리를 짧게 확보함으 로써 기실의 손상에 의한 부화율의 저하를 방지하고 micropipette의 말단을 경사진 형태로 제작하여 배반엽 층의 구멍이 최소화되도록 하였다.
의 정 량은 Elecsys FSH reagent kit로 electro- chem-iluminescence immunoassay (ECLIA) 분석기 (Elecsys 2010, Roche)를 사용하여 수행하였다. 대 조구로는 virus에 infection되지 않은 CHO 세포의 배양액을 사용하였으며 도출된 결과를 이용하여 FSH-CTP 유전자의 발현 정도를 비교하였다.
본 실험에서는 FSH a와 P subunit를 human pituitary gland cDNA library에서 직접 cloning하였으며, 그 결과 102 bp의 CTP, 454 bp의 FSHa, 그리고 402 bp의 FS/邓의 단편을 얻을 수 있었다. 또한 FSHa와 FSH$ subunit을 CTP linker로 연 결하여 한 vector 내에서 FSH가 단일사슬로 발현이 되도록 계획하였다. Sequence가 확인된 FSH-CTP는 retrovirus vector 인 pLNeZ 의 P-actin promoter의 down- stream의 위치에 cloning하였다(Fig.
7℃의 온도와 상대습도 55% 조건의 부화기에 입란하여 2시간 주기로 전란시키면서 18일간 발생 시킨 후, 19일째 부터는 계란을 37℃의 온도와 상 대습도 75% 조건의 발생기로 옮긴 후 전란하지 않는 상태에서 부화할 때까지 배양시켰다. 배양하는 동안 10U 18일, 21일째에 계란의 발생 진행 여부 를 검란기를 통하여 관찰하였으며 부화한 병아리 는 25℃에서 사육하였다.
(Keene 등, 1989; Hard 등, 1990). 본 연구에서도 CHO 세포에 LNPFS//-CTP# 도입하여 CHO-LN0 -FSH-CTP 세포를 구축한 후 배양액을 수확하여 FSH를 정량하였다. 그 결과, FSH-CTP7} 전이되지 않은 CHO 세포와 HSHq와 °가 co-infectione 세포 에서는 각각 0.
Chimerasme 수 대에 걸쳐 germ line에 유전자가 전이된 개체들 간의 교잡과 선발을 통하여 해결할 수 있을 것으로 생각된다. 생리적인 불균형에 의한 문제점을 해결하기 위하여 본 연구실에서는 현재 널리 사용되고 있는 P -actin promoter나 CMV (cytomegalovirus) promoter 대신에 조직특이적 promoter나 유도적 promoter를 사용한 retrovirus vector system을 구축 중이다. 이 system이 구축되면 보다 효율적이고 성공적으로 외래 유전자가 전이된 형질전환 가금을 생산할 수 있을 것이다.
이 virus를 본 실험실에서 구축한 pseudotype의 retrovirus 생산세포인 293mG PHy (Kim 등, 2001)에 감염시켜 G418 (600 四/ml) 이 첨가된 선별용액으로 2주간 선별하였다. 선별 된 NeoR (G418 resistant) 293mGPHy-LNpZ 세포에 calcium phosphate 방법으로 20 昭의 pHCMV-G를 일시적으로 transfection하여 37℃, 5% CO2 조건에서 8시간 배양 후 새 배양액으로 교환하였다. 48시간이 경과한 후 retrovirus?]- 포함된 배 양액을 수확 하였다.
재조합한 pLN[3FS//-CTP는 pseudotyped retrovirus producing cell인 293mGPHy에 도입하여 293 mGPHy-LN(3-FSH-CTP를 구축하고 VSV-G 피막 유전자를 가진 pHCMV-G plasmid를 일시적으로 transfection하여 LN0-FSH-CTP retrovirus stock을 수확하였다. 수확한 virus stock을 초원심분리로 고 농축하여 NIH3T3에 감염시켜서 LacZ* TU/ml와 NeoR CFU/ml titer를 측정하였다. 농축하기 전의 retrovirus의 titer는 정도로 나타났으며 1,000 배로 농축한 후의 titer는 1x1"으로 나타났다.
본 실험에서 구축한 retrovirus vector system을 이용한 FSH-CTP의 in wTr。에서의 발현 여부를 확 인하기 위하여 CHO 세포에 virus를 감염시켰다. NIH3T3와 마찬가지로 G418 (800 i定/ml)을 첨가한 선별배양액으로 2주간 배양하였다.
재조합된 retroviral vector는 PT67에 calcium phosphate 방법으로 transfection하여 G418 (500 询 ml)이 첨가된 선별용액으로 2주간 선별하였으며 형성된 NeoR (G418 resistant) PT67 세포군을 DMEM/FBS (10%)에서 48시간 배양한 후 virus stock을 수확하였다. 이 virus를 본 실험실에서 구축한 pseudotype의 retrovirus 생산세포인 293mG PHy (Kim 등, 2001)에 감염시켜 G418 (600 四/ml) 이 첨가된 선별용액으로 2주간 선별하였다. 선별 된 NeoR (G418 resistant) 293mGPHy-LNpZ 세포에 calcium phosphate 방법으로 20 昭의 pHCMV-G를 일시적으로 transfection하여 37℃, 5% CO2 조건에서 8시간 배양 후 새 배양액으로 교환하였다.
재조합된 retroviral vector는 PT67에 calcium phosphate 방법으로 transfection하여 G418 (500 询 ml)이 첨가된 선별용액으로 2주간 선별하였으며 형성된 NeoR (G418 resistant) PT67 세포군을 DMEM/FBS (10%)에서 48시간 배양한 후 virus stock을 수확하였다. 이 virus를 본 실험실에서 구축한 pseudotype의 retrovirus 생산세포인 293mG PHy (Kim 등, 2001)에 감염시켜 G418 (600 四/ml) 이 첨가된 선별용액으로 2주간 선별하였다.
이 조합과정의 효율을 증대하기 위하여 본 연구에서는 hFSH 를 단일사슬의 단백질로 구축하고자 하였으며, 이 의 일환으로 각 subunit에 대한 cDNA 단편을 연결 하는 서열로 CTP linker를 도입하였다. 재조합한 hFSH-CTP 유전자는 pseudotype 의 retrovirus vector system을 이용하여 CHO 세포와 닭의 배로 각각 전이되었다. CHO 세포에서의 FSH의 생산은 a 와。를 각각 전이한 경우에 비해 hFSH-CTP를 전 이한 경우에서 17배 이상 높은 것으로 나타났다.
재조합한 pLN[3FS//-CTP는 pseudotyped retrovirus producing cell인 293mGPHy에 도입하여 293 mGPHy-LN(3-FSH-CTP를 구축하고 VSV-G 피막 유전자를 가진 pHCMV-G plasmid를 일시적으로 transfection하여 LN0-FSH-CTP retrovirus stock을 수확하였다. 수확한 virus stock을 초원심분리로 고 농축하여 NIH3T3에 감염시켜서 LacZ* TU/ml와 NeoR CFU/ml titer를 측정하였다.
1), 각 절편의 DNA 염기서열을 sequencing을 통하여 확인하였다. 최종적인 retrovirus vector pla- smid는 pGEM-Teasy-FSH-CTP로부터 약 1 Kb의 FSH-CTP 절편을 분리하여 retroviral vector인 pLN 0Z의 E. coll LacZ 유전자의 위치에 cloning함으로 써 구축하였다(Fig. 1). 새로 재조합된 pLNp-FSH- CTP는 Qiagen maxiprep kit을 이용하여 대량 분리 한 후 다음 실험에 사용하였다.
대상 데이터
5 잉 2 fucose, GibcoBRL 12800-017, USA)을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. CHO 세포는 10%의 FBS와 penicillin (100 U/ml) - streptomycin (100 tzg/nl)이 첨가된 Ham's F-12 Medium (GibcoBRL 21700-075, US A) 을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
Ml6646 (exon 1), Ml6647 (exon 2))를 선택하였다. FS0a에 대한 primer로는 Cla I 의 제 한효소 부위 를 첨가한 + strand primer로 5'ATCGATGCTCCTGATGTG CA GGATTGC3'와 BamH I 부위를 첨가한 - strand primer로 5'GGATCCGGATAAGGAGGAA GGCA GTAA3, 를 사용하였다. CTP linker에 대한 primer 는 Bgl II 부위 를 첨가한 + strand primer로 5'AGA TCTTCCTCCTCTTCCTCAAAGGCC3', Cla I 부 위를 첨가한 - strand primer로 5'ATCGATGCTTT GTGGGAGGATCGGGGT3', 그리고 FS部에 대한 primer로는 Hind 皿 를 첨가한 + strand primer로 5'A AGCTTAGGATGAAGACACTCCAGTTTTTCTTC 3', 그리고 Bgl II site를 첨가한 - strand primer로 5' AGATCTTTCTTTCATTTCACCAAAGGAGCAGT A3, 를 사용하였다.
NM_000737) 중에서 발현 후 아미노산 서열 113에서 145 잔기 에 해당하는 부분을 택하였고, FSH&는 exon 1과 exon 2 (genbank accession no. Ml6646 (exon 1), Ml6647 (exon 2))를 선택하였다. FS0a에 대한 primer로는 Cla I 의 제 한효소 부위 를 첨가한 + strand primer로 5'ATCGATGCTCCTGATGTG CA GGATTGC3'와 BamH I 부위를 첨가한 - strand primer로 5'GGATCCGGATAAGGAGGAA GGCA GTAA3, 를 사용하였다.
PCR의 수행에 있어서 사용한 주형은 human pituitary gland cDNA (Clontech 639324, USA) 0.1 ng을 사용하였으며, 중합효소는 실패율이 현저히 낮은 것으로 알려져 있는 Advantage-HF2 (Clontech, USA) 효소를 선택하였다. PCRe 0.
2차 cDNA 합성과 PCR 증폭을 위하여 94℃ 에서 30초, 60℃ (FSH。의 경우), 52℃ (Neo 의 경우)에서 30초, 72'C 에서 30초간 반응하는 횟 수를 35회 반복 실시한 후, 최종 신장을 위해 72℃ 에서 5분간 방치하였다. 반응에 사용한 primer의 서열은 FSH& 유전자에 대해서는 + strand primer로 5'AAGCTTAGGATGAAGACACTCCAGTTTTTC TTC3', - strand primer로 5'AGATCTTTCTTTCAT TTCACCAAAGGAGCAGTA3't 사용하였으며, Neo 유전자에 대한 primer 서 열로는 + strand primer 서 열 로 5'ATTCCGATCTGATCAAGAGAC3'과 - strand primer 서열로는 5'TTTCCACCATGATATTCGGC A3, 을 사용하였다. 반응이 끝난 후 72'C 에서 5분간 방치한 후 1% agarose gel을 이용하여 전기영동을 실시하였다.
본 실험에 사용된 유정란은 이사브라운 산란계 의 종란 중에서 60+3 g 무게의 것으로서, 배자가 계란의 적도 상단부에 위치하도록 하기 위해서 stage X의 종란을 측상향 위치 상태로 10시간 정치 한 후 window를 제 작하였다. 10)定/ml 의 polybrene 을 첨가한 virus stock의 주입은 특수가공한 microinjection pipette (SIGMA, pipette, microcapillary, 50 yl, 100 mm length)을 이용하여 배의 하층에 주 입하였으며, virus의 주입이 끝난 계란은 window 를 paraUlm으로 3회 감아서 밀봉한 후 측상향 위치 상태로 26℃의 부화기에서 1시간 가량 정치함 으로써 온도 충격과 물리적 충격을 안정화시켰다.
본 실험에서 사용한 PT67 (Clontech, USA)과 293mGPHy (Kim 등, 2001) 세포는 10%의 FBS (HyClone, USA)와 penicillin (100 U/ml) - streptomycin (100 昭/ml) (Pen/Strep; GibcoBRL, USA)°] 첨가된 Dulbeccds Modified Eagle Medium (DMEM, 4.5 잉 2 fucose, GibcoBRL 12800-017, USA)을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. CHO 세포는 10%의 FBS와 penicillin (100 U/ml) - streptomycin (100 tzg/nl)이 첨가된 Ham's F-12 Medium (GibcoBRL 21700-075, US A) 을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
이론/모형
이 system의 장점은 다른 외래유전자 도입방 식에 日'해 유전적으로 안정성을 나타내며(Temin, 1989), 외래유전자가 표적세포의 genome에 삽입될 때 반복되지 않는 단일 유전자만이 진정염색질 부 위 내로 선택적으로 도입될 수 있으며, 다양한 종 류의 세포에 다양한 종류의 외래유전자를 높은 효 율로 감염시킬 수 있다는 점이다(Rohdewohld 등, 1987). 반면에 이 방법은 고농도의 virus stock을 수확하는데 있어서 감염성 저하 등의 현상이 나 타나는데, 본 연구에서는 이러한 문제점을 해결하기 위하여 VSV-G 당단백질을 피막으로 하는 retrovirus vector system (Kim 등, 2001)을 사용하였다. 이 system에 의해 생산되는 virus는 초원심분리로 농축시켜서 감염도를 1,000 배 이상 증가시킬 수 있으며 또한 pantropic이기 때문에 어류를 포함하여 거의 모든 동물세포를 감염시킬 수 있는 장점 을 가지고 있다(Lin 등, 1994).
이 재조합 FSH 유전자의 전이와 발현을 위하여 본 연구에서는 retroviral vector system을 이용하였다. 이 system의 장점은 다른 외래유전자 도입방 식에 日'해 유전적으로 안정성을 나타내며(Temin, 1989), 외래유전자가 표적세포의 genome에 삽입될 때 반복되지 않는 단일 유전자만이 진정염색질 부 위 내로 선택적으로 도입될 수 있으며, 다양한 종 류의 세포에 다양한 종류의 외래유전자를 높은 효 율로 감염시킬 수 있다는 점이다(Rohdewohld 등, 1987).
성능/효과
본 연구에서도 CHO 세포에 LNPFS//-CTP# 도입하여 CHO-LN0 -FSH-CTP 세포를 구축한 후 배양액을 수확하여 FSH를 정량하였다. 그 결과, FSH-CTP7} 전이되지 않은 CHO 세포와 HSHq와 °가 co-infectione 세포 에서는 각각 0.18 rnlU/ml, 0.19 mIU/ml로 나타난 데 비하여 CHO-LN&/SH-CTP의 배양액에서는 3.16 mIU/ml로 나타났다(Fig. 2). 즉, 단일사슬로 재조합된 FSH의 발현이 대조군에 비하여 약 17배 의 발현율을 보였으며 이는 두 개의 subunit를 linker를 이용하여 연결한 형태의 호르몬 단백질의 분비가 증가함을 나타내는 것이다.
CHO 세포에서의 FSH의 생산은 a 와。를 각각 전이한 경우에 비해 hFSH-CTP를 전 이한 경우에서 17배 이상 높은 것으로 나타났다. 닭에서는 유전자 전이를 시도한 62개체 중에서 11 마리가 부화하였으며 그 중 10마리가 형질전환된 닭인 것으로 RT-PCR을 통하여 확인되었다. 그러나 개체의 혈중 FSH으、생산은 확인하지 못하였다.
본 실험에서는 FSH a와 P subunit를 human pituitary gland cDNA library에서 직접 cloning하였으며, 그 결과 102 bp의 CTP, 454 bp의 FSHa, 그리고 402 bp의 FS/邓의 단편을 얻을 수 있었다. 또한 FSHa와 FSH$ subunit을 CTP linker로 연 결하여 한 vector 내에서 FSH가 단일사슬로 발현이 되도록 계획하였다.
부화한 병아리의 91%가 형질전환 개체로 판명 된 결과는 적어도 형질전환 닭의 생산에 있어서 본 연구진의 retrovirus vector system이 타 방법에 비해 우월함을 증명하고 있다. 그러나 60, 000 여개의 모든 배세포에 완전한 외래 유전자의 전이가 성공적으로 이루어지기는 매우 어려운 실정이다.
Retrovirus vector에 의한 성공적인 유전자 발현 에 대한 확인은 virus를 주입한 군 중 부화한 병아 리의 날개 말단 조직에서 분리한 RNA를 이용한 RT-PCR에 의해서 수행 되었다. 사용한 primer는 성 선자극호르몬의 종류에 따라서 특이적 subunit인 (3 subunit에 해당하는 primer와 Neo 유전자에 대한 primer를 사용하였으며, 그 결과 11마리 중 10마리 에서 396 bp의 FSHP와 600 bp의 Neo 유전자에 대한 산물을 전기영동 상에서 확인하였으며 형질전 환율은 약 91%로 나타났다
그러나 개체의 혈중 FSH으、생산은 확인하지 못하였다. 이상의 실험결과를 바탕으로 하여 재조합된 hFSH-CTP는 FSH의 발현에 매우 효율적인 구조로 생각되며, 또한 retrovirus를 이용한 유전자 전이 방법은 형질전환 가금의 생산에 있어서 매우 적절한 방법으로 사료된다.
조작전의 유정란의 부화율은 거의 100%를 나타 냈으며 DMEM/FBS를 주입한 경우에는 부화율이 45%로 감소하였다(Table 1). 이러한 현상은 window 제작시 발생하는 물리적인 손상과 주입시 나타나는 배반엽층의 구멍에 의한 것으로 추정된다.
2). 즉, 단일사슬로 재조합된 FSH의 발현이 대조군에 비하여 약 17배 의 발현율을 보였으며 이는 두 개의 subunit를 linker를 이용하여 연결한 형태의 호르몬 단백질의 분비가 증가함을 나타내는 것이다.
후속연구
생리적인 불균형에 의한 문제점을 해결하기 위하여 본 연구실에서는 현재 널리 사용되고 있는 P -actin promoter나 CMV (cytomegalovirus) promoter 대신에 조직특이적 promoter나 유도적 promoter를 사용한 retrovirus vector system을 구축 중이다. 이 system이 구축되면 보다 효율적이고 성공적으로 외래 유전자가 전이된 형질전환 가금을 생산할 수 있을 것이다.
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