작약(Paeonia lactiflora Pall.)씨 추출물과 Resveratrol이 흰쥐 체내 지질 상태에 미치는 영향 Effects of Peonia Seed Extracts and Resveratrol on Lipid Metabolism in Rats Fed High Cholesterol Diets원문보기
본 연구는 작약(Paeonia lactiflora Pall.)씨 추출물 및 작약씨에서 분리한 resveratrol의 체내 지질대사에 미치는 영향을 조사하기 위하여 시행되었다. 고콜레스테롤 식이에 작약씨 메탄올 추출물을 0.1%(MP1)와 0.2%(MP2) 첨가시키거나 메탄올 추출물을 탈지시킨 후 에테르로 분획한 에테르가용성 추출물을 0.05%(EP1), 0.1%(EP2), 작약씨 resveratrol은 0.02%씩 각각 첨가시킨 식이를 조제하여 초기체중 120$\pm$11g의 Sprague-Dawley종 숫쥐에게 섭취시켜 3주간 사육하였고, 시험물질을 첨가하지 않은 식이를 섭취시킨 control군과 비교 조사하였다. 사육 후 EP2군은 나머지 5군에 비하여 체중증가량과 식이효율이 떨어지는 경향이었으나 나머지 5군에서 차이가 없었다. 그러나 간 무게(g/100g 체중)는 EP2군이 대조군에 비하여 낮았고 혈청 GOT와 GPT도 5개의 작약군이 대조군에 비하여 차이가 없었다. 혈청 총 콜레스테롤은 EP2군과 resveratrol군이 control군에 비하여 유의하게 낮았고, 다른 군들은 차이가 없었으나 HDL-cholesterol은 5군의 작약군이 대부분이 높았으며 HDL-/총 콜레스테롤의 비율은 EP1군을 제외한 나머지 4군의 작약군에서 대조군에 비하여 모두 유의하게 높았다. 그러나 혈청중성지방은 EP2군만이 대조군에 비하여 낮았다. 간조직 콜레스테롤 함량은 5개의 작약군이 모두, 중성지방은 MP2군과 EP1, EP2군이 대조군에 비하여 유의하게 낮았다. 분변으로의 콜레스테롤 배설은 MP2, EP1 및 EP2군에서 대조군에 비하여 높았으나 담즙산 배설은 차이가 없었으며 EP2군에서는 오히려 낮았다. 본 연구의 결과로서 작약씨에는 체내 총 콜레스테롤 및 중성지방의 상태를 저하시키는 물질이 있으며 이러한 변화는 HDL-콜레스테롤 대사를 활성화시켜 분변으로의 콜레스테롤 배설을 증가시키는 것이 주요기전으로 판단된다. 이 역할을 하는 성분으로 작약씨에 존재하는 monomer형태의 resveratrol이 일익을 담당하지만 추출물속에 함유된 resveratrol oligomer 및 비 resveratrol 화합물도 작용하였으리라고 사료되어 이에 대한 확인이 필요하다. 작약씨에 함유된 물질들의 지질대사 개선효과는 이미 보고된 항산화기능과 함께 동맥경화 예방에 유효할 것으로 기대되며 기능성 식품에 활용에 대한 연구가 필요하다
본 연구는 작약(Paeonia lactiflora Pall.)씨 추출물 및 작약씨에서 분리한 resveratrol의 체내 지질대사에 미치는 영향을 조사하기 위하여 시행되었다. 고콜레스테롤 식이에 작약씨 메탄올 추출물을 0.1%(MP1)와 0.2%(MP2) 첨가시키거나 메탄올 추출물을 탈지시킨 후 에테르로 분획한 에테르가용성 추출물을 0.05%(EP1), 0.1%(EP2), 작약씨 resveratrol은 0.02%씩 각각 첨가시킨 식이를 조제하여 초기체중 120$\pm$11g의 Sprague-Dawley종 숫쥐에게 섭취시켜 3주간 사육하였고, 시험물질을 첨가하지 않은 식이를 섭취시킨 control군과 비교 조사하였다. 사육 후 EP2군은 나머지 5군에 비하여 체중증가량과 식이효율이 떨어지는 경향이었으나 나머지 5군에서 차이가 없었다. 그러나 간 무게(g/100g 체중)는 EP2군이 대조군에 비하여 낮았고 혈청 GOT와 GPT도 5개의 작약군이 대조군에 비하여 차이가 없었다. 혈청 총 콜레스테롤은 EP2군과 resveratrol군이 control군에 비하여 유의하게 낮았고, 다른 군들은 차이가 없었으나 HDL-cholesterol은 5군의 작약군이 대부분이 높았으며 HDL-/총 콜레스테롤의 비율은 EP1군을 제외한 나머지 4군의 작약군에서 대조군에 비하여 모두 유의하게 높았다. 그러나 혈청중성지방은 EP2군만이 대조군에 비하여 낮았다. 간조직 콜레스테롤 함량은 5개의 작약군이 모두, 중성지방은 MP2군과 EP1, EP2군이 대조군에 비하여 유의하게 낮았다. 분변으로의 콜레스테롤 배설은 MP2, EP1 및 EP2군에서 대조군에 비하여 높았으나 담즙산 배설은 차이가 없었으며 EP2군에서는 오히려 낮았다. 본 연구의 결과로서 작약씨에는 체내 총 콜레스테롤 및 중성지방의 상태를 저하시키는 물질이 있으며 이러한 변화는 HDL-콜레스테롤 대사를 활성화시켜 분변으로의 콜레스테롤 배설을 증가시키는 것이 주요기전으로 판단된다. 이 역할을 하는 성분으로 작약씨에 존재하는 monomer형태의 resveratrol이 일익을 담당하지만 추출물속에 함유된 resveratrol oligomer 및 비 resveratrol 화합물도 작용하였으리라고 사료되어 이에 대한 확인이 필요하다. 작약씨에 함유된 물질들의 지질대사 개선효과는 이미 보고된 항산화기능과 함께 동맥경화 예방에 유효할 것으로 기대되며 기능성 식품에 활용에 대한 연구가 필요하다
To study the effects of substances in paeonia seeds (Paeonia lactiflora Pall.) on lipid metabolism, crude methanol extract and secondary ether-soluble fraction out of defatted methanol extract and trans-resveratrol were prepared from the seeds and added to 0.5% (w/w) cholesterol diets for rats. Male...
To study the effects of substances in paeonia seeds (Paeonia lactiflora Pall.) on lipid metabolism, crude methanol extract and secondary ether-soluble fraction out of defatted methanol extract and trans-resveratrol were prepared from the seeds and added to 0.5% (w/w) cholesterol diets for rats. Male Sprague-Dawley rats weighing 120$\pm$11 g were divided into six experimental groups: control group with no extra supplement, 0.1% (MP1) and 0.2% methanol extract (MP2) supplemented groups, 0.05% (EP1) and 0.1% ether-soluble fraction (EP2) supplemented groups and 0.02% resveratrol supplemented group. Experimental diets were fed ad libitum to the rats for 3 weeks. Body weight gains and food efficiencies were not different among the six experimental groups. Relative liver weights were lower in EP2 group compared to those in control group, but serum GOT and GPT levels of paeonia seed groups including trans-resveratrol group were not different from those of the control group. Serum total cholesterol levels reduced in EP2 and resveratrol groups but HDL-/total cholesterol ratios significantly increased in the four paeonia groups except EP1 group compared with the control group and serum triglyceride level lowered only in EP2 group than that of the control. However, liver cholesterol levels lowered in the five paeonia groups but triglyceride level lowered in MP2, EP1, EP2 groups than that of the control group. Fecal cholesterol excretion significantly increased in MP2, EP1, and EP2 groups than that of the control group, but bile acid excretions were not changed except that a reduction in EP2 group. These results suggest that paeonia seeds contain substances improving serum lipid status mostly via HDL pathway and resveratrol as monomer is one of the effective components but others including resveratrol oligmer are involved in the lipid improving effect.
To study the effects of substances in paeonia seeds (Paeonia lactiflora Pall.) on lipid metabolism, crude methanol extract and secondary ether-soluble fraction out of defatted methanol extract and trans-resveratrol were prepared from the seeds and added to 0.5% (w/w) cholesterol diets for rats. Male Sprague-Dawley rats weighing 120$\pm$11 g were divided into six experimental groups: control group with no extra supplement, 0.1% (MP1) and 0.2% methanol extract (MP2) supplemented groups, 0.05% (EP1) and 0.1% ether-soluble fraction (EP2) supplemented groups and 0.02% resveratrol supplemented group. Experimental diets were fed ad libitum to the rats for 3 weeks. Body weight gains and food efficiencies were not different among the six experimental groups. Relative liver weights were lower in EP2 group compared to those in control group, but serum GOT and GPT levels of paeonia seed groups including trans-resveratrol group were not different from those of the control group. Serum total cholesterol levels reduced in EP2 and resveratrol groups but HDL-/total cholesterol ratios significantly increased in the four paeonia groups except EP1 group compared with the control group and serum triglyceride level lowered only in EP2 group than that of the control. However, liver cholesterol levels lowered in the five paeonia groups but triglyceride level lowered in MP2, EP1, EP2 groups than that of the control group. Fecal cholesterol excretion significantly increased in MP2, EP1, and EP2 groups than that of the control group, but bile acid excretions were not changed except that a reduction in EP2 group. These results suggest that paeonia seeds contain substances improving serum lipid status mostly via HDL pathway and resveratrol as monomer is one of the effective components but others including resveratrol oligmer are involved in the lipid improving effect.
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문제 정의
따라서 본 연구진이 작약씨에 들어 있는 성분들이 체내 지질을 변화시켜 동맥경화 발생을 억제시켜 줄 수 있는가를 보기 위하여 2단계의 작약추출물과 작약으로부터 분리한 res veratrol 을 고콜레스테롤식에 첨가하여 흰쥐에게 섭취 시켜 체내 지질상태를 조사하였다. 특히 작약씨에는 포도씨 에 존재하는 resveratrol monomer가 배당체를 포함하여 약 0, 13%가 함유된 반면 dimer, trimer 등 oligomer들이 거의 2%에 달한다는 차이점이 있어(7) 기존의 연구에서 사용된 포도씨에서 분리된 것과 동일한 monomer인 순수 trans-resveratrol과 작용의 차이를 비교 조사하고자 하였다.
증감에 영향을 받는다. 따라서 콜레스테롤의 체외 배설을 보기 위하여 분변내의 콜레스테롤과 대사산물인 담즙산의 배설량을 조사하였다. Table 5에서 보여지는 바와 같이 작약 추출물들(MP, EP)의 정제도와 섭취량에 따라 분변으로의 콜레스테롤 배설량이 대조군에 비하여 유의하게 증가되는 것을 볼 수 있었다.
지질상태를 조사하였다. 특히 작약씨에는 포도씨 에 존재하는 resveratrol monomer가 배당체를 포함하여 약 0, 13%가 함유된 반면 dimer, trimer 등 oligomer들이 거의 2%에 달한다는 차이점이 있어(7) 기존의 연구에서 사용된 포도씨에서 분리된 것과 동일한 monomer인 순수 trans-resveratrol과 작용의 차이를 비교 조사하고자 하였다.
제안 방법
일반 배합사료로 1주일간 사육시켜 환졍에 적응시킨 후 난괴법으로 군당 8마리씩 배정하여 6군으로 나눈 뒤 Table 1에 보여진 바와 같은 6종의 조제식이로서 3주간 사육하였다. 식이는 AIN-93(16) 조성에 따른 기본식이에 콜레스테롤을 0, 5% 수준으로 첨가하여 대조군(control)의 식이로 하였으며, 작약 실험군들의 졍우 메탄올 추출물을 0, 1, 0, 2%(w/w) 수준으로 식이에 첨가한 MP1, MP2군, 2차 에테르 분획물을 0, 05, 0.1%(w/w) 수준으로 첨가한 EPl, EP2군, 정제된 작약 res veratrol 을 0, 02%(w/w) 수준으로 첨가한 resveratrol군으로 총 5군이었다. 식이와 식수는 자유공급시켰으며 동물사육실의 온도는 20〜23°C, 상대습도는 55〜60%로 조절하고 7: 00〜19: 00의 dark-light cycle을 유지하였다.
1%(w/w) 수준으로 첨가한 EPl, EP2군, 정제된 작약 res veratrol 을 0, 02%(w/w) 수준으로 첨가한 resveratrol군으로 총 5군이었다. 식이와 식수는 자유공급시켰으며 동물사육실의 온도는 20〜23°C, 상대습도는 55〜60%로 조절하고 7: 00〜19: 00의 dark-light cycle을 유지하였다.
실험식이로 3주 동안 사육한 흰쥐들은 16〜18시간 절식시킨 다음 에테르로 가볍게 마취시켜 복부를 절개한 후 대동맥으로부터 혈액을 취하여 2, 000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 혈청을 얻었다. 혈청 총콜레스테롤 및 HTL-콜레스테롤과 중성지방은 각각 kit시약을 사용하여 분광광도법으로 측정하였고, GOT와 GPT 활성도 Sigma사의 분석 kit를 사용하여 측정하였다.
이 농축물 25, 5 g을 20% 메탄올에 다시 용해시킨 후에 테르 1 L로 2회 반복 추출한 2차 에테르 분획물 7, 88 g을 얻었다. 이 에테르 추출물을 silica gel 60 컬럼크로마토그라피에서 클로로포름/메탄올(5: 1, v/v) 혼액으로 용출시킨 후 TLC상에서 동일물질로 확인된 분획들끼리 모아 6종으로 나누었고, 이 중 2번 분획 0, 71 g을 다시 Sephadex LH-20 칼럼크로마토그라피로 정제하여 resveratrol 0, 18 g을 얻었다(7). 본 연구의 식이실험에서는 작약씨 메탄올 조추출물과 2차 에테르 분획물 및 정제된 작약 resveratrol을 사용하였다.
일반 배합사료로 1주일간 사육시켜 환졍에 적응시킨 후 난괴법으로 군당 8마리씩 배정하여 6군으로 나눈 뒤 Table 1에 보여진 바와 같은 6종의 조제식이로서 3주간 사육하였다. 식이는 AIN-93(16) 조성에 따른 기본식이에 콜레스테롤을 0, 5% 수준으로 첨가하여 대조군(control)의 식이로 하였으며, 작약 실험군들의 졍우 메탄올 추출물을 0, 1, 0, 2%(w/w) 수준으로 식이에 첨가한 MP1, MP2군, 2차 에테르 분획물을 0, 05, 0.
혈청을 얻었다. 혈청 총콜레스테롤 및 HTL-콜레스테롤과 중성지방은 각각 kit시약을 사용하여 분광광도법으로 측정하였고, GOT와 GPT 활성도 Sigma사의 분석 kit를 사용하여 측정하였다.
대상 데이터
이 에테르 추출물을 silica gel 60 컬럼크로마토그라피에서 클로로포름/메탄올(5: 1, v/v) 혼액으로 용출시킨 후 TLC상에서 동일물질로 확인된 분획들끼리 모아 6종으로 나누었고, 이 중 2번 분획 0, 71 g을 다시 Sephadex LH-20 칼럼크로마토그라피로 정제하여 resveratrol 0, 18 g을 얻었다(7). 본 연구의 식이실험에서는 작약씨 메탄올 조추출물과 2차 에테르 분획물 및 정제된 작약 resveratrol을 사용하였다.
실험동물은 체중 120 g 내외의 Sprague-Dawley종 숫쥐를 바이오 제노믹스사(서울에서 구입하여 사용하였다. 일반 배합사료로 1주일간 사육시켜 환졍에 적응시킨 후 난괴법으로 군당 8마리씩 배정하여 6군으로 나눈 뒤 Table 1에 보여진 바와 같은 6종의 조제식이로서 3주간 사육하였다.
졍북 의성에서 재배된 작약으로부터 씨를 채취하여 건조한 후 사용하였다. 건조 작약씨 300 g을 분쇄한 후 메탄올 2 L을 가하여 상온에서 24시간씩 3차례 추출한 후 4CTC에서 감압 농축하여 메탄올 추출물 37, 5 g을 얻었다.
조제식이에 기본성분인 casein, vitamin mix, mineral mix 와 고콜레스테롤식 에 첨가된 콜레스테롤은 Teklad사(Teklad Test Diets, Madison, USA)에서 구입하였고, cellulose는 Sigma-Aldrich사(St. Louis, USA)에서, 옥수수 전분은 삼양사 제품을, 기타 유지성분과 설탕은 슈퍼마켓에서 구입하여 사용하였다. 지질 분석에 필요한 kit 시약은 아슨k제약에서, 혈청 GOT와 GPT 활성과 분변의 bile acid kit 시 약은 Sigma-Al血ch사에서 지질 추출에 필요한 유기용매 및 기타 일반시약은 특급을 사용하였다.
데이터처리
실험결과는 SAS 통계프로그램으로 이용하여 분산분석 법(analysis of variance)으로 군간의 차이를 조사하였고, Tukey's test에 의하여 차이의 유의성을 검 증하였다
이론/모형
분석 시료로 사용하였다. 간조직은 Folch 법 CL7) 에 준하여 조직지질을 추출한 다음에, triton X-100으로 처리하여 (18) 콜레스테롤과 중성지방을 혈청에서와 같은 kit 시약을 사용하여 정량하였다.
사용하였다. 분변 내의 콜레스테롤과 담즙산은 건조시료를 사용하여 Crowell과 Macdonald법CL9)에 의하여 추출한 후 콜레스테롤과 담즙산을 각각 효소 kit 시약을 사용하여 정량하였다.
성능/효과
결론적으로, 본 연구 결과에서 보여진 작약 추출물 및 작약 resveratrol의 체내 지질 개선 효과는 이미 보고한 작약추출물의 in vitro 항산화 작용 ⑺ 및 최근 발표된 in vivo 항산화 상태 강화 (29)와 아울러 동맥경화 억제에 매우 중요하게 작용할 것으로 판단된다.
그러나 순수 분리한 resveratrol 첨가군에서는 대조군과 거의 차이가 없어 체중증가 억제 및 간조직에 영향을 주는 성분은 EP 에 함유된 비 resvertml성분으로 사료된다. 그러나 간 손상의 지표인 혈장 GOT와 GPT의 수준은 모든 작약 추출물군 및 resveratrol군에서 control군에 비하여 차이가 없거나 오히려 낮아지는 졍향을 보였으며 건강한 흰쥐의 정상수준으로 보고된 GOT 39-111 U/L, GPT 20-61 UZL 내에 속하는 값으로서⑵)) 실험군 모두 간독성은 없었다고 판단된다.
resveratrol임을 보여 주고 있다. 그러나 작약의 메탄올 추출물의 0, 7%, 에테르 2차 추출물의 23%가 본 실험에서 사용한 monomer 인 trans-resveratrol 인 반면 dimer 형태는 메탄올 추출물의 L95%, 에테르 2차 추출물의 6.35%이며 tri-mer는 2종의 추출물의 247%와 80%를 구성하고 있어(7) resveratrol trimer형태가 추출물에 함유된 주형태임을 알 수있다, 따라서 본 결과의 MP 및 EP의 효과에는 trans-res-veratrol 외에 dimer 및 trimer 형태의 resveratrol의 작용이있었을 것으로 판단된다. Trans-resveratrol^- 이미 적포도주의 항동맥경화성분으로 많이 알려졌으나(8-10) dimer 및 trimer 형태의 resveratrol에 대하여는 식물에서 동정된 바는 있으나(21) 항곰팡이 작용(22) 외의 생리효과 조사로는 항염증작용(23)이 있을 뿐이다.
유의적으로 낮아졌다. 그러나 혈청 HDL-콜레스테롤 수준은 EP1 군을 제외한 MP1, MP2, EP2군에서 유의적으로 증가되었고, EPl군과 resveratrol군에서도 유의성이 없었으나 증가하는 졍향은 뚜렸하였다. 이러한 것은 작약성분군 대부분(MP1, MP2, EP2 및 resveratrol)에서 HDL/총콜레스테롤비율을 유의적으로 증가시키는 결과로 분명히 나타났다.
Trans-resveratrol^- 이미 적포도주의 항동맥경화성분으로 많이 알려졌으나(8-10) dimer 및 trimer 형태의 resveratrol에 대하여는 식물에서 동정된 바는 있으나(21) 항곰팡이 작용(22) 외의 생리효과 조사로는 항염증작용(23)이 있을 뿐이다. 따라서 본 실험에서 dimer 및 trimer 형태의 resveratrol이 함유된 작약 추출물들이 res veratrol monomer에 못지 않은 HDL 상승 효과를 보였다는것은 중요한 결과라고 하겠다. 혈청 H坦L의 항동맥경화 기능은 전에 비하여 최근 더욱 강조되고 있으며, 식물성 유래 isoflavone 및 phytoestrogen으로 분류되는 물질들의 HDL 상승효과가 보고되고 있다 (24).
반면 중성지방 함량은 추출물 섭취군에서는 감소되거나 감소의 졍향을 보이지만 resveratrol군에서는 control군에 비하여 변화가 없었다(Table 4). 따라서 작약추출물은 간조직 콜레스테롤 및 중성지방 대사에 상당한 영향을 끼치며 메탄올 추출에서 에테르 2차 추출로 정제될수록 그 영향이 커짐을 알 수 있었다. 이러한 영향이 어느 정도는 resveratrol에 의한 것이기는 하지만 혈청 지질 때와 마찬가지로 resveratrol monomer 외의 성분들도 작용하고 있음을 보여 주고 있다.
이 결과는 hepatoma를 가진 쥐에서 resveratrol^] 의한 분변으로의 콜레스테롤 배설 증가(14)와 유사하였다. 본 연구 결과에서도 분변 콜레스테롤 배설이 resveratrol섭취군에서도 증가하였으나 MP2, EPl, EP2군에 비하여 낮은 것으로 보아 추출물내에 resveratrol monomer 외의 성분이 작용한다고 할 수 있었으며 이는 혈청 및 간조직에서 일관성있게 보여진 현상이었다. 이러한 배설의 증가는 작약군들에서 식이성 콜레스테롤의 흡수가 저해되는 것이 1차적으로 중요 원인이 되겠으나 내인성 콜레스테롤의 배설의 증가도 배제할 수 없다.
초기 평균체중은 120 g 내외로서 군간에 차이가 없었고 증체량(body wt gain)과 간조직의 무게가 모든 작약 추출물군에서 낮은 졍향이었으며 특히 EP2군의 간무게는 control군에 비하여 유의하게 낮게 나타났다. 식이효율도 증체량 결과와 유사하여 EP2군의 낮은 증체량은 식이섭취량 감소가 아니라 EP 추출물내에 존재하는 성분이 작용하는 것으로 보이며 EP1 수준에서는 그 작용이 거의 없었던 것으로 보인다. 그러나 순수 분리한 resveratrol 첨가군에서는 대조군과 거의 차이가 없어 체중증가 억제 및 간조직에 영향을 주는 성분은 EP 에 함유된 비 resvertml성분으로 사료된다.
실험군들의 간조직 콜레스테롤은 혈청 콜레스테롤과 달리 작약추출물 및 resveratrol 군에서 모두 현저히 감소함을 보여 주고 있다. 반면 중성지방 함량은 추출물 섭취군에서는 감소되거나 감소의 졍향을 보이지만 resveratrol군에서는 control군에 비하여 변화가 없었다(Table 4).
작약성분들에 의한 혈청 지질 변화에서 가장 괄목할만한 HDL/총콜레스테롤 비율이 MP 혹은 EP 등 추출물 양을 증가시킴에 따라 증가하는 졍향을 보여 추출물에 함유된 성분이 작용한다는 것을 확인할 수 있었고, 그 유효성분 중에 하나가 resveratrol임을 보여 주고 있다. 그러나 작약의 메탄올 추출물의 0, 7%, 에테르 2차 추출물의 23%가 본 실험에서 사용한 monomer 인 trans-resveratrol 인 반면 dimer 형태는 메탄올 추출물의 L95%, 에테르 2차 추출물의 6.
활성은 Table 2에 나타난 바와 같다. 초기 평균체중은 120 g 내외로서 군간에 차이가 없었고 증체량(body wt gain)과 간조직의 무게가 모든 작약 추출물군에서 낮은 졍향이었으며 특히 EP2군의 간무게는 control군에 비하여 유의하게 낮게 나타났다. 식이효율도 증체량 결과와 유사하여 EP2군의 낮은 증체량은 식이섭취량 감소가 아니라 EP 추출물내에 존재하는 성분이 작용하는 것으로 보이며 EP1 수준에서는 그 작용이 거의 없었던 것으로 보인다.
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