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문제 정의
- 우 점화가 더욱 유리할 것이다[8]. 따라서 본 연구에서는 미생물 상토를 개발하기 위하여 가지과 작물의 근권에서 유용한 균주를 분리하고 다기능 유용 미생물을 선별하여 제제화하고 상토에 첨가한 후 고추 플러그묘의 초기 생육에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- 40공 트레이에 상기 제작한 미생물제제를 첨가한 상토와 첨가하지 않은 상토로 나누어 각각 최아시킨 고추를 파종하였다. 2002년 11월 13일 파종하여 2003년 1월 17일까지 67일간 재배하여 초장(plant height), 경경(stem di ameter), 뿌리의 길이, 생체중량 등 초기 생육도를 조사하였다. 시험구 배치는 난괴법 3반복으로 하여 제반 생육을 조사하였다
- 내부표준물질(Inter nal standard, ISTD)은 2H2 GA1을 사용하였다. HPLC (Table 1)로 GAi 활성분위를 분획하였고, GC/MS SIM (Table 2) 으로 GAi의 함량을 조사하였다.
- msu. edu/html/analyses.htmD에서 상동성을 검색하여 동정하였다.
- 고추 재배시험은 가온 비닐하우스 육묘장에서 미리 준비된 40공 트레이에 상기 제작한 미생물제제를 첨가한 상토와 첨가하지 않은 상토로 나누어 각각 최아시킨 고추를 파종하였다. 2002년 11월 13일 파종하여 2003년 1월 17일까지 67일간 재배하여 초장(plant height), 경경(stem di ameter), 뿌리의 길이, 생체중량 등 초기 생육도를 조사하였다.
- 길항미생물 중에서 고추의 초기 생육을 촉진하는 미생물로 선별하였다. 공시 작물인 고추(녹광, 세미니스코리아)는 55°C에서 25분간 침지하여 온탕소독하고, 28°C 내외에서 2일간 최아시킨 후 살균된 샬레 (petri dish, 9cm)에 여과지를 2겹 깔고 증류수 4mL와 길항미생물 배양액 ImL를 각각 넣고 여기에 최아 시킨 고추종자를 파종하여 5일간 배양한 후 생체중량을 측정하여 증류수만 들어 있는 대조구에 비해 생육이 촉진된 구간의 미 생 물을 생 육촉진 미 생 물로 선 발하였다.
- 실험에 사용하였다. 길항력은 근권미생물과 병원균의 대치배양(pair plate culture)에 의해 조사하였으며, PDA 배지에서 키운 병원균체 덩어리를 새로운 PDA 배지 중앙에 올려놓고 가장자리 4곳에 순수분리한 근권미생물을 한 백금이씩 접종하여 28°C에서 7~10일간 배양한 후 병 원균의 균사체의 생장억제 정도(inhibition zone)를 조사하여 생성된 clear zone의 길이로 결정하였다.
- amyloliquefaciens?} iturins[19]을 생산하여 bio-control기능을 나타내는 보고는 있으나 작물생육 촉진물질에 관해서는 알려진 바 없다. 따라서 B. amgloliquefaciens 가 식물생장촉진 호르몬인 gibberellin을 생산하거나 또는 고추 식물체 내 gibberellin 생합성에 관여하는 28-hyrdoxy- lase 및 3 -hyrdoxylase 등의 효소활성을 촉진시키는 효소 활성 촉진제(activator)가 존재하거나 또는 IAA 등의 작물생육 촉진 호르몬을 생산하여 고추의 생육을 촉진시킬 것으로 판단하여 먼저 B, amyloliquefaciens 배양액과 고추 식물 체내의 이bbereliin의 함량을 조사하였다.
- 미생물제제는 흡착제(담체)로는 훈탄을 lOOmesh이하로분쇄하고 121°C에서 15분간 살균하여 이용하였고, 미생물배양액(2.0x109 cfu/mL) 1L에 담체 3kg을 넣고 혼합하여 30°C에서 24시간 배양시켜 건조기(40°C)에서 48시간 건조하여 수분의 함량이 20% 미만인 미생물제제를 제조하였다. 상토는 상용적으로 많이 사용하고 있는 원료를 이용하여 일반적인 제조법에 따라 코코피트 44%, 피트모스 29%, 펄라이트 16%, 버미큘라이트 11%를 혼합하여 제조한 후상기 제조한 미생물제제를 4% 혼입하여 제조하였다.
- 0x109 cfu/mL) 1L에 담체 3kg을 넣고 혼합하여 30°C에서 24시간 배양시켜 건조기(40°C)에서 48시간 건조하여 수분의 함량이 20% 미만인 미생물제제를 제조하였다. 상토는 상용적으로 많이 사용하고 있는 원료를 이용하여 일반적인 제조법에 따라 코코피트 44%, 피트모스 29%, 펄라이트 16%, 버미큘라이트 11%를 혼합하여 제조한 후상기 제조한 미생물제제를 4% 혼입하여 제조하였다.
- 길항 . 생육촉진미생물을 제형화 하고 상토에 적용하였다. Table 3과 같이 근권미생물은가지과 작물의 뿌리와 재배토양 등 385점의 균원시료로부터 540여점을 분리하였다.
- 2002년 11월 13일 파종하여 2003년 1월 17일까지 67일간 재배하여 초장(plant height), 경경(stem di ameter), 뿌리의 길이, 생체중량 등 초기 생육도를 조사하였다. 시험구 배치는 난괴법 3반복으로 하여 제반 생육을 조사하였다
- Table 3과 같이 근권미생물은가지과 작물의 뿌리와 재배토양 등 385점의 균원시료로부터 540여점을 분리하였다. 이들 근권미생물 중에서 길항미생물은 가지과 작물에 공통적으로 발생되는 Altemaria solani,Botrytis dnerea, Fusarium oxysporium, Phytophthora capsid, Sclerotinia sderotiorum 등의 병원균과 대치배양하여 길 항력이 우수한 20여 주를 1차 선별하고 재현성 실험을 통하여 비교적 높은 길항력을 나타내는 분리주 MJ-1-MJ-5 까지 5주를 2차 선별하였다. Altemaria solani에는 MJ-2와 3균주가 높은 길항력을 나타내었으며, Botrytis cinerea 및 Fusarium 에는 MJ-1 과 4균주가, Phytophthora capsid 및 Sclerotinia scRrohbmm 에는 MJ-3과 5 균주가 높은 길항력을 나타내었다.
대상 데이터
- 균원시료로는 경상도 일원에서 일반적으로 재배되고 있는 가지, 토마토, 고추 등 가지과 작물의 뿌리를 수집하여 이용하였다. 근권미생물은 뿌리를 잘 세척하고 크기가 1mm 가 되게 절단한 균원시료 1g에 0.
- 길항균을 얻기 위해 사용한 병원균은 가지과 작물에서공통적으로 발생되는 겹무늬병균(Alternaria solani), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinered), 잘록병균(FZsarim oxysporium), 역 병균(Phgtophthora capsid), 균핵 병 균(Sderotinia sclerotiorum)등의 병원성 곰팡이들을 이용하였고, 이들은 농촌진흥청과 KCTC (유전자은행) 등에서 분양 받아 PDA(potato dex trose agar) 배지에서 28°C에서 7일 이상 배양하여 4°C에 보관하면서 실험에 사용하였다. 길항력은 근권미생물과 병원균의 대치배양(pair plate culture)에 의해 조사하였으며, PDA 배지에서 키운 병원균체 덩어리를 새로운 PDA 배지 중앙에 올려놓고 가장자리 4곳에 순수분리한 근권미생물을 한 백금이씩 접종하여 28°C에서 7~10일간 배양한 후 병 원균의 균사체의 생장억제 정도(inhibition zone)를 조사하여 생성된 clear zone의 길이로 결정하였다.
- 고추의 생육 촉진미생물은 상기 근권 . 길항미생물 중에서 고추의 초기 생육을 촉진하는 미생물로 선별하였다. 공시 작물인 고추(녹광, 세미니스코리아)는 55°C에서 25분간 침지하여 온탕소독하고, 28°C 내외에서 2일간 최아시킨 후 살균된 샬레 (petri dish, 9cm)에 여과지를 2겹 깔고 증류수 4mL와 길항미생물 배양액 ImL를 각각 넣고 여기에 최아 시킨 고추종자를 파종하여 5일간 배양한 후 생체중량을 측정하여 증류수만 들어 있는 대조구에 비해 생육이 촉진된 구간의 미 생 물을 생 육촉진 미 생 물로 선 발하였다.
- 생육촉진미생물을 선발하기 위해 상기 5주의 근권 . 길항미생물을 대상으로 7일 동안 재배한 고추의 생체중량을 조사한 결과, 증류수만 첨가한 대조구의 생체중량이 0.90(g/plant)이었으나 MJ-3 균주 배양액을 첨가한 시험구에서는 1.18(g/plant)로 30% 이상 초기 생육이 촉진되어 MJ-3 균주를 최종 유용미생물로 선발하여 실험에 이용하였다.
- 내부표준물질(Inter nal standard, ISTD)은 2H2 GA1을 사용하였다. HPLC (Table 1)로 GAi 활성분위를 분획하였고, GC/MS SIM (Table 2) 으로 GAi의 함량을 조사하였다.
이론/모형
- 미 생 물은 Bergey's manual of systematic bacteriology2] 방법[18]에 준하여 미생물의 형태학적, 배양학적, 생리 . 생화학적 특성을 조사하고 16S rDNA sequence 법 [14] 으로동정하였다.
- 길항 . 생육촉진미생물인 MJ-3 균주는 Bergey's Manual of Systematic Bacteriologys] 방법으로 배양학적 생리 . 생화학적 특성을 조사한 결과, gram 염색에서 양성으로 나타났고, 전자현미경 관찰하에서는 여러 개의 편모를 가지있고, 내생포자를 형성하였다(Fig^ 1).
- 생화학적 특성을 조사하고 16S rDNA sequence 법 [14] 으로동정하였다. 이때 PCR primer는 R14 (5'-ACg ggC ggT gTg TAC3)와 R15(5, -gCC AgC AgC CgC ggT A3)를 이용하였고 sequencing data는 ribosomal database(http://rdp.
- 지베렐린의 추출과 분석은 Foster와 Morgan(1995), Lee (1998) 등의 방법에 준하여 행하였다. 내부표준물질(Inter nal standard, ISTD)은 2H2 GA1을 사용하였다.
성능/효과
- 16S rDNA 염 기서열(590bp)을 결정하고 Jukes와 Cantor model에 의 하여 evolutionary distance를 계 산하여 Neigh bor-joining method로 계통수를 작성한 결과 Fig. 2와 같이 분리 주 MJ-3은 Bacillus amyloliquefaciens99.48%의 높은 유사도를 보였으며, B. atrophaeus와는 99.28%, B. vallismortis와는 99.15, B. MMis와는 98.98%의 유사도를 나타내어 B. subtilis complex에 속하는 것으로 동정 되 었다. 이상의 결과로부터 MJ-3 균주는 Bacillus amyloliquefaciens0] Q 그 유연균으로 동정되었기에 Bacillus amyloliquefaciens MJ-3으로 명명하였다.
- 이들 근권미생물 중에서 길항미생물은 가지과 작물에 공통적으로 발생되는 Altemaria solani,Botrytis dnerea, Fusarium oxysporium, Phytophthora capsid, Sclerotinia sderotiorum 등의 병원균과 대치배양하여 길 항력이 우수한 20여 주를 1차 선별하고 재현성 실험을 통하여 비교적 높은 길항력을 나타내는 분리주 MJ-1-MJ-5 까지 5주를 2차 선별하였다. Altemaria solani에는 MJ-2와 3균주가 높은 길항력을 나타내었으며, Botrytis cinerea 및 Fusarium 에는 MJ-1 과 4균주가, Phytophthora capsid 및 Sclerotinia scRrohbmm 에는 MJ-3과 5 균주가 높은 길항력을 나타내었다. 생육촉진미생물을 선발하기 위해 상기 5주의 근권 .
- 가지과 작물 중 토마토(Z%o- persicon esculentum) 잎에는 GAi, GA3/ GA% GA& GA19가 존재하며[6]/ 박과 작물인 오이(Cucumis satiuvs)에는 GAi, GA3/ GA4가 알려져 있고[7], 호박(Cucurbita maxiuma)의 embryo에서는 GAb GA4, GA17/ GA?8/ GA37/ GA3& GA4& GA85 등이 존재하는 것으로 보고되었다[11]. 그러나 가지과 작물인 고추(Capsium annuum) 의 GAi 에 관해서는 보고 된 바가 아직 없고 본 연구에서 GA1이 존재함을 확인하였고 미생물제제 첨가 상토에서 GA1 의 함량이 다소 많이 존재하였다.
- amyloliquefaciens 배양액에는 GAi이 존재하지 않았지만 gibberellin 생합성에 관여하는 26-hyrdoxylase 및 3β- hyrdoxylase 등의 효소활성을 촉진시키는 activator가 존재하여 GAi의 함량이 증가된 것으로 추측되나 정확한 원인은 더 연구해야 될 것으로 사료된다. 그러나 부분적이지만 식물 체내 GA 대사과정에서 활성 GAi, GA3z GA4 등의 함량이 증가함에 따라 작물의 생육이 촉진되는 것은 잘 알려져 있는 사실이므로 본 연구에서 B. amyloliquefaciens를 처리함으로써 GAi의 함량이 다소 많이 존재하였고, B. amgloliquefacietis가 생산하는 생리활성물질 또는 효소활성 activator가 GAi의 생산량을 증가시켜 작물 생육이 부분적이나마 촉진된 것같다. 그러나 GAi의 함량이 약간 더 많이 존재하는 정확한 이유에 대해서는 주가 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
- 미생물제제 첨가 상토와 무첨가 상토에서 각각 재배한 고추의 GAi의 함량 및 B. amyloliquefaciens 배양액에 존재하는 GAi을 조사하기 위해 내부표준물질(ISTD)인 2H2 GAi과 체내 호르몬 GAi의 GC-MS chromatogram을 조사한 결과, Fig. 3에서와 같이 2H2 GAi은 parent ion이 508, GAi은 506으로 나타났다. 이를 기준으로 대조구와 시험구의 GAi 함량을 조사한 결과, Table 6에서와 같이 GAi함량은 각각 0.
- 미생물제제를 첨가하지 않은 상토(대조구)와 미생물제제를 4% 첨가한 상토(시험구)를 이용하여 온실 내에서 67일간 고추 플러그 묘를 재배하여 초기 생육을 조사한 결과 Table 5에서와 같이 시험구 고추 식물의 초장은 21.69cm로 처리하지 않은 상토보다 약 6.3% 증가되었고, 경경은 미생물제제를 첨가한 상토와 처리하지 않은 상토간에 큰 차이가 없이 2.5cm로 나타났다. 뿌리의 길이는 처리구가 대조구보다 약 17.
- 5cm로 나타났다. 뿌리의 길이는 처리구가 대조구보다 약 17.2% 길었고, 생체중량은 16.8% 증가하였다. 그러나 특이하게도 뿌리의 생체중량은 대조구가 0.
- 생육촉진미생물인 MJ-3 균주는 Bergey's Manual of Systematic Bacteriologys] 방법으로 배양학적 생리 . 생화학적 특성을 조사한 결과, gram 염색에서 양성으로 나타났고, 전자현미경 관찰하에서는 여러 개의 편모를 가지있고, 내생포자를 형성하였다(Fig^ 1). 세포는 전형적인 간균이며, 크기는 0.
- 생화학적 특성을 조사한 결과, gram 염색에서 양성으로 나타났고, 전자현미경 관찰하에서는 여러 개의 편모를 가지있고, 내생포자를 형성하였다(Fig^ 1). 세포는 전형적인 간균이며, 크기는 0.5X3.8㎛ 정도이며, flagella가 측면에 부착되 어 있고, catalase를 생 성 하여 대표적 인 Bacillus 속으로 확인되었다. 또한 glucose를 이용하여 산을 생성하며 전분을 가수분해하고 혐기적 조건이나 3°C 저온에서는 생육이 불가능하였다.
- subtilis complex에 속하는 것으로 동정 되 었다. 이상의 결과로부터 MJ-3 균주는 Bacillus amyloliquefaciens0] Q 그 유연균으로 동정되었기에 Bacillus amyloliquefaciens MJ-3으로 명명하였다.
후속연구
- B. amyloliquefaciens 배양액에는 GAi이 존재하지 않았지만 gibberellin 생합성에 관여하는 26-hyrdoxylase 및 3β- hyrdoxylase 등의 효소활성을 촉진시키는 activator가 존재하여 GAi의 함량이 증가된 것으로 추측되나 정확한 원인은 더 연구해야 될 것으로 사료된다. 그러나 부분적이지만 식물 체내 GA 대사과정에서 활성 GAi, GA3z GA4 등의 함량이 증가함에 따라 작물의 생육이 촉진되는 것은 잘 알려져 있는 사실이므로 본 연구에서 B.
- amgloliquefacietis가 생산하는 생리활성물질 또는 효소활성 activator가 GAi의 생산량을 증가시켜 작물 생육이 부분적이나마 촉진된 것같다. 그러나 GAi의 함량이 약간 더 많이 존재하는 정확한 이유에 대해서는 주가 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
- 최근에 화학비료 및 농약의 남용과 축산폐기물의 무단방류 등에 의한 농업환경의 오염이 점차적으로 늘어남에 따라 유용미생물을 이용한 환경정화와 환경친화적 농업의 개발이 요구되고 있으며, 이러한 관점에서 유용 미생물을 원예적으로 이용하여 식물의 생장을 촉진시키며 각종 비료성분을 공급하고 또한 뿌리전염병 등의 병해에 대하여 생물학적 방제력을 높이는 연구가 진행되고 있다[16]. 따라서 상토에도 병원균에 대한 생육억제력이 우수한 길항균을 첨가함으로써 육묘기 또는 본포에서 곰팡이 병해에 대한 생물학적 방제기능(biocontrol)을 수행할 수 있는 능력을 보유할 수 있을 것이며, 이들 길항균 이외에도 식물생육촉진미 생물(plant promoting growth rhizo- bacteria, PGPR)[13], 질소고정균[9], 호르몬 생산균[2], 불용성 인산가용화균[10] 등 각종 유용미생물들을 첨가하여 상토의 기능성을 증가시킬 수 있을 것이다. 그러나 상토에 각종 유용미생물을 첨가한다고 해도 실제 작물의 근권에서 생육하기가 어렵거나 토착화되기가 용이하지 않을 것이다.
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