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문제 정의
- 또한, 어육단백질인 정 어리 [15, 2이와 고등에21] 근육단백 질 가수분해물의 ACE 저해작용도 보고되고 있다. 따라서 본 연구에서는 전남 특산물인 홍어 발효의 과학화의 일환으로서 부산물로 생산되어 폐기되고 있는 홍어의 내장 과 가식부 열수추출물의 항고혈압활성을 평 가하며, Sephadex column chromatography를 통해서 분자량별 fraction의 분리와 분리된 fraction별 항고혈압효과를 검색하므로써 홍어 부산물의 생리기능성 규명을 통한 재활용 가능성을 탐색함이 목적이다.
제안 방법
- 항 고혈압성 물질을 농축하기 위해 홍어 내장 및 가식부 열수 추출물을 대량 포집 하였다. 그리고 그에 따른 ACE 억제 효과를 검색하였다. 즉, 홍어 가식 부의 ACE 저해 작용은 2% 첨가 시 29%로, 다소 낮으나 상시 섭취될 수 있는 식품이란 측면에서 볼 때 그 유용성이 기대된다고 할 수 있으며 홍어 내장 열수 추출물의 ACE 저해 효과는 시료 2% 첨가의 경우 발효 0일째에 71.
- 앞의 결과에서 홍어 발효일된 내장 열수 추출물의 ACE 저해 효과가 가장 우수하여 이들 인자를 보다 구체적으로 살펴보기 위하여 Fig. 2에 나타낸 Sephadex G-25 column chromatography에 의해 획분을 분리하여 분획물들의 ACE 저해 효과 등 기능성을 살펴보았다. 이들 획분A(60~110), B(lll 〜160), C(161 〜210)의 ACE 저해 효과는 Fig.
- 한번 세척하였다. 이를 멸균한 거즈로 표면의 물기를 제거한 다음 10℃에서 습도를 60-90%로 설정하여 10 일 동안 발효 시키면서 발효기간에 따라 가식부와 내장을 세절하여 열수추출한 후 동결 건조기(Freeze dry system/ Freezone 4.5, Labconco Co, England)에서 동결 건조한 것을 시료로 사용하였다. 홍어 내장 및 가식부를 마쇄하여 환류 냉각기를 부착시킨 플라스크에 시료 lg당 30 mL의 증류수를 넣고 30분간 100℃로 3회 반복 추출한 액을 여과지 (Whatman No.
- 항고혈압 효과가 높았던 홍어 내장 열수 추출물의 ACE 억제 peptide의 아미노산 조성을 알기 위하여 홍어 내장 열수 추출물을 동결건조하고, buffer는 lithium buffer, reagent는 ninhydrine, analytic time은 3 hr/L sample, injection volume은 20 로 아미노산 자동분석기(Bio chrom 20, Pharmacia Biotech, England)로 질소화합물의종류와 양을 분석하였다.
- 항고혈압 효과는 본태성 고혈압의 원인물질인 ACE (Angiotensin Converting Enzyme, peptidyldipeptide hydrolase,EC 3415.1)의 저해활성으로 측정하였으며, Cushman과 Cheung의 방법[기을 변형하여 측정하였다. ACE 0.
- 3%의 HHL기질용액을 만들었다. 홍어 각 부위별 열수추출물 시료는0.5%, 1%, 2%로 제조하여 시료 50 J1L에 0.3% HHL 기질 용액 200 gL을 첨가하여 37℃ 에서 10분간 preincubation 시 켰다. 반응액 에 ACE용액 50 UL첨가한 후 37C 에서 15분 반응시킨다.
- 5, Labconco Co, England)에서 동결 건조한 것을 시료로 사용하였다. 홍어 내장 및 가식부를 마쇄하여 환류 냉각기를 부착시킨 플라스크에 시료 lg당 30 mL의 증류수를 넣고 30분간 100℃로 3회 반복 추출한 액을 여과지 (Whatman No.2)로 여과하고, 여과된 액을 다시 동결 건조하여 홍어 가식부 및 내장의 열수추출물로 하였다.
- 홍어를 발효하여 발효기간에 따른 항고혈압 효과를 조사하고 그에 따른 항고혈압성 물질을 분리하기 위해 GPC system을 사용하여 항고혈압 물질을 조 분리하였다. 항 고혈압성 물질을 농축하기 위해 홍어 내장 및 가식부 열수 추출물을 대량 포집 하였다.
- 홍어의 항고혈압 효과를 나타내는 물질의 대략적인 성분을 알기 위하여 원소분석기(EA1110, CE Instruments, Italy)를 사용하여 분석하였다. 원소분석기는 pure copper 를 중전한 반응관에 GC colume과 TCD(thermal conduc tive detector)# 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서는 전라남도 나주시 (주)영산포 식품으로부터 지 원 받은 홍어 (Raja kenojei)를 냉동 보관한 상태로 실험실로 운반하여 완전해동한 후 홍어표면을 수돗물로 두 번, 증류수로 한번 세척하였다. 이를 멸균한 거즈로 표면의 물기를 제거한 다음 10℃에서 습도를 60-90%로 설정하여 10 일 동안 발효 시키면서 발효기간에 따라 가식부와 내장을 세절하여 열수추출한 후 동결 건조기(Freeze dry system/ Freezone 4.
- 항 고혈압성 물질을 농축하기 위해 홍어 내장 및 가식부 열수 추출물을 대량 포집 하였다. 그리고 그에 따른 ACE 억제 효과를 검색하였다.
이론/모형
- 항고혈압 효과를 나타내는 물질의 일반성분을 분석하기 위하여 수분의 정량은 일정량의 홍어내장과 가식부의 열수 추출물을 채취하여 고온 건조 후 그 감량의 항량 값을 수분으로 하였으몌2], 환원당 정량은 DNS법[8]에 의하여 환원당을 정량하였다. 즉, 시료를 0.
- 01 g/mL로 조제하고, 시료 1에 DNS 시약 3 mL을 넣고 끓는 물에서 5분간 끓였고, 흐르는 물에서 식힌 후 550 nm에서 비 색정 량하였다. 환원당 함량은 미리구하여둔 standard curve 로 시료의 농도를 환산하였으며, 순단백질 정 량은 Biuret법에 의거하여순단백질을 정량하였다.
성능/효과
- 또한, 질소화합물의 분석결과 ACE를 억제하는 기능성 peptide의 성분인 Tyr, Phe, Vai, His 등이 가식부 보다 많아서 ACE를 억제하는 peptide를 함유하리라 예상되었다. ACE억제 물질을 조 분리하기 위하여 Sephadex G-25 column chro- matography에 의해 분자량별로 분획한 결과, 분획물 들의 ACE 저해 효과는 분획물 B(11L16O)의 농도 0.2%에서 67.8 %로 가장 높은 ACE 저해 효과를 나타내었다. 이상의 결과로 미루어 보아 홍어 내장 열수 추출물의 ACE 저해 인자는 가열에 대하여 안정한 비교적 저분자의 peptide와 같은 물질이라고 추정할 수 있었다.
- 9%로 높은 ACE 저해 효과를 나타내었다. 그리고 분획물 B에서는 농도가 0.05, 0.1, 0.2% 에서 각각 65.1, 64.1, 67.8%로 나타났으며, 분획물 중 가장 높은 ACE 저해 효과를 나타내었다. 이상의 결과로 미루어보아 홍어 내장 열수 추출물의 ACE 저해인자는 가열에 대하여 안정한 비교적 저분자의 peptide와 같은 물질이라고 추정할 수 있었다.
- 멸치 젓갈 숙성 중 시료 액의 ACE 저해 효과는 아미노 질소 함량이 최고 치에 달하는 숙성 60일에 최대 값을 나타내다가 그 후 다소 감소하는 경향을 나타내었다[11]. 그와 달리 홍어 내장 열수 추출물의 ACE 저해 효과는 시료 2% 첨가의 경우 발효 0일째에 71.0%로 가장 높게 나타났으며, 발효가 진행되면서 ACE 저해 효과는 감소하는 것으로 나타났다.
- 한편, 지금까지 밝혀진 대부분의 ACE 저해 peptide는 분자량이 2000이하인 것으로 보고되었다 [3]. 따라서 본 연구에서도 홍어내장 열수 추출물의 항고혈압 물질은 저분자의 peptide 라고 사료되며, 이러한 ACE 저해 작용은 peptide 함량보다는 그 중의 peptide의 종류 즉, 아미노산의 배열순서 및 그 기질이나 구조 등에 따라서로 다른 것으로 추정된다.
- 0%로 나타났다. 따라서 홍어 가식부 열수 추출물의 ACE 저해 효과는 시료 2% 첨가의 경우 발효 0일째에 29.0%로 가장 높게 나타났다. 홍어 가식부의 ACE 저해 작용은 다소 낮으나 상시 섭취될 수 있는 식품이란 측면에서 볼 때 그 유용성이 기대된다고 할 수 있다.
- 7%로 가장 높게 나타났으며, 원소분석 결과 C, H, 。N의 성분비가 당류라기 보다는 peptide계 인 것으로 나타났다. 또한, 질소화합물의 분석결과 ACE를 억제하는 기능성 peptide의 성분인 Tyr, Phe, Vai, His 등이 가식부 보다 많아서 ACE를 억제하는 peptide를 함유하리라 예상되었다. ACE억제 물질을 조 분리하기 위하여 Sephadex G-25 column chro- matography에 의해 분자량별로 분획한 결과, 분획물 들의 ACE 저해 효과는 분획물 B(11L16O)의 농도 0.
- 홍어 가식부의 ACE 저해 작용은 다소 낮으나 상시 섭취될 수 있는 식품이란 측면에서 볼 때 그 유용성이 기대된다고 할 수 있다. 또한, 홍어 내장 열수 추출물의 ACE 저 해 효과는 시료 2% 첨가의 경우 발효 0일째에 71%로 가장 높게 나타났고, 발효 4, 8, 10 일째에 각각 65.0%, 37.0%, 42.0%의 저해효과를 나타내었다. 시료 1% 첨가의 경우 발효 0일째에 30.
- 그와 달리 홍어 내장 열수 추출물의 ACE 저해 효과는 시료 2% 첨가의 경우 발효 0일째에 71.0%로 가장 높게 나타났으며, 발효가 진행되면서 ACE 저해 효과는 감소하는 것으로 나타났다.
- 3과 같다. 분획물 A에서는 1% 정도로 낮았고, 분획물 C를 0.05% 첨가한 군에서 56.9%로 높은 ACE 저해 효과를 나타내었다. 그리고 분획물 B에서는 농도가 0.
- 8%로 나타났으며, 분획물 중 가장 높은 ACE 저해 효과를 나타내었다. 이상의 결과로 미루어보아 홍어 내장 열수 추출물의 ACE 저해인자는 가열에 대하여 안정한 비교적 저분자의 peptide와 같은 물질이라고 추정할 수 있었다. 한편, 지금까지 밝혀진 대부분의 ACE 저해 peptide는 분자량이 2000이하인 것으로 보고되었다 [3].
- 8%로 나타났으며, 분획물 중 가장 높은 ACE 저해 효과를 나타내었다. 이상의 결과로 미루어보아 홍어 내장 열수 추출물의 ACE 저해인자는 가열에 대하여 안정한 비교적 저분자의 peptide와 같은 물질이라고 추정할 수 있었다. 한편, 지금까지 밝혀진 대부분의 ACE 저해 peptide는 분자량이 2000이하인 것으로 보고되었다 [3].
- 그리고 그에 따른 ACE 억제 효과를 검색하였다. 즉, 홍어 가식 부의 ACE 저해 작용은 2% 첨가 시 29%로, 다소 낮으나 상시 섭취될 수 있는 식품이란 측면에서 볼 때 그 유용성이 기대된다고 할 수 있으며 홍어 내장 열수 추출물의 ACE 저해 효과는 시료 2% 첨가의 경우 발효 0일째에 71.0%로 가장 높게 나타났다. 발효가 진행되면서 ACE 저해 효과는 감소하는 것으로 나타났다.
- 일반성분은 Table 1과 같다. 즉, 홍어내장 열수 추출물에는 순단백질의 함량이 가장 높아서 ACE를 억제할 수 있는 물질들이 많이 있으리라 사료되며 Table 2는 원소분석 결과로서 C, H, 0, N의 성분비가 당류라기 보다는 peptide계인 것으로 예상되었다. 정어리 어간장[21]의 연구에서 ACE 저해 작용을 가지는 peptide가 가열에 대하여 안정한 것으로 나타났다고 하였는데 본 연구에서도 열수 추출물이지만 ACE 저해 율이 높게 나타났으며 ACE를 억제하는 peptide를 함유하리라 예상되었다.
- 홍어 가식부, 내장 열수 추출물의 ACE 저해활성 측정 Fig. 1에 나타낸 홍어 가식부 열수 추출물의 ACE 저해 효과는 시료 2% 첨가의 경우 발효 0, 4, 8, 10일째에 각각 29.0%, 17.0%, 20.0%, 16.0%로 나타났고, 시료 1% 첨가의 경우 발효 0, 4, 8, 10일째에 각각 10.0%, 9.0%, 13.0%, 12.0%로 나타났다. 따라서 홍어 가식부 열수 추출물의 ACE 저해 효과는 시료 2% 첨가의 경우 발효 0일째에 29.
후속연구
- 이들 peptide들은 ACE에 대해 angiotensin-I과 경쟁적으로 결합하여 ACE의 활성을 감소시키는 것으로 추정되고 있다. 또한, N-말단에 염기성 아미노산인 histidine의 함량이 특징적으로 높은 것이 ACE 저해활성과 관계가 있었다는 보고[1 기와 같이 홍어 내장 열수 추출물의 유리 아미노산 함량 중 histidine의 함량이 가식부보다 높아서 (Table 3) histidine 함량도 ACE 억제효과에 영향을 주었으리라 예상되지만 좀 더 깊이 있는 연구가 필요하리라 사료된다. 또한, 홍어 내장 열수 추출물에는 aromatic 아미노산인 Tyr, Phe이 가식부보다 많았으며 branched aliphatic 아미노산인 Vai도 가식부보다 2배 이상 많아서, 홍어내장 중에 이러한 기능성 peptide가 존재하리라 예상되고 좀 더 깊이 있는 연구를 위해 구성아미노산의 분석이 필요하리라 사료된다.
- 또한, N-말단에 염기성 아미노산인 histidine의 함량이 특징적으로 높은 것이 ACE 저해활성과 관계가 있었다는 보고[1 기와 같이 홍어 내장 열수 추출물의 유리 아미노산 함량 중 histidine의 함량이 가식부보다 높아서 (Table 3) histidine 함량도 ACE 억제효과에 영향을 주었으리라 예상되지만 좀 더 깊이 있는 연구가 필요하리라 사료된다. 또한, 홍어 내장 열수 추출물에는 aromatic 아미노산인 Tyr, Phe이 가식부보다 많았으며 branched aliphatic 아미노산인 Vai도 가식부보다 2배 이상 많아서, 홍어내장 중에 이러한 기능성 peptide가 존재하리라 예상되고 좀 더 깊이 있는 연구를 위해 구성아미노산의 분석이 필요하리라 사료된다.
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