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문제 정의
- Yeum 등(27)은 peptide의 종류가 ACE 저 해 작용에 큰 영향을 미 친다고 보고하였다. 본 실험 에서도 다른 갈조류와는 다르게 유독 수용성 물질 에서 ACE 저해 활성을 보였던 70AE 감태의 활성을 나타내는 물질에 대한 특이성을 알아보았다.
- 본 연구에서는 제주 연안에 자생하는 여러가지 녹조류 및 갈조류 추출물로부터의 ACE 저해활성을 검색하여 제주 자생 해조류의 항고혈 압 효과에 대한 가능성을 살펴 보고 이에 대한 정보를 구축하고자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- ACE 저 해활성 측정 방법은 Cushman과 Cheung⑹의 방법을 약간 응용하여 기질인 hippuryl-L-histidyl-L-leucine (Hip-His-Leu)에 ACE가 작용하여 생성된 hippuric acid를 측정 하는 방법을 사용하였다. 기 질용액은 300 mM NaCKpH 2.
- 각 추출 조건은 단백질 분리 효소 제조사인 Novozyme에서 표기한 각 효소의 최적 온도 및 pH로 조절하여 사용하였다. 가수분해 반응이 끝난 후 효소반응을 정 지 시 키 기 위해 10분간 끓인 후 모든 추출물을 pH 7.0으로 조절한 후 ACE 저해활성을 측정하였다.
- 효소적 가수분해 반응물의 최적 반응시간을 알아보기 위해 6, 12, 18, 24시 간 동안 효소반응을 수행하였다. 각 추출 조건은 단백질 분리 효소 제조사인 Novozyme에서 표기한 각 효소의 최적 온도 및 pH로 조절하여 사용하였다. 가수분해 반응이 끝난 후 효소반응을 정 지 시 키 기 위해 10분간 끓인 후 모든 추출물을 pH 7.
- 메탄올 추출물은 여과 후 액상층은 용매를 모두 휘발시킨 후 증류수에 녹여 용액을 만들었고, 여과 후 남은 잔사는 증류수에 현탁한 후 증류수를 이용하여 위와 동일한 조건에서 추출하여 수용성 추출물을 얻었다(Fig. 1). 추출물의 농도는 rotary vacuum evaporator에서 농축 온도를 40±3℃정 도로 하여 적당한 농도로 맞추고, 여기서 얻은 시료를 200 jig/mL로 동일하게 조정한 다음 0~4℃에 보관하였다.
- 가수분해를 하였다. 여기서 추출 분리된 peptide를 가지고 ACE 저해활성을 측정하였으며 추출방법은 다음과 같다.
- 제주 연안에 서식 하는 해양 녹조류와 갈조류의 항고혈압 활성을 알아보기 위해 해조류로부터 메탄올과 물을 이용하여 상온(20℃)과 70℃에서 각각 4가지 종류의 추출물을 제조하여 스크리닝하였다. 그 결과, 녹조류에서는 비교적 낮은 ACE 저 해 활성을 보였으나, 갈조류에서 는 70ME 잇 바디 괭생이모자반, 말미역, 바위주름, 넓패, 톳, 다시마 및 70AE 감태 에서 ACE 저 해 활성이 높게 나타났다.
- 해조류는 다른 동식물에 비해 단백질 함유량이 낮지만, 이질성의 아미노산 단백질 함량이 많기 때문에 해조류의 수용성 추출물을 특유한 반응으로 단백질 결합을 분해하는 효소인 Protamex, Kojizyme, Neutrase, Flavourzyme, Alcalase 등 다섯 종류의 단백질 분해효소를 이용하여 잠재적인 ACE 저 해 활성을 가지는 peptide를 추출하기 위해 효소적 가수분해를 수행하였다. 효소반응 시간에 따른 70AE 감태의 효소적 가수분해물에 대한 ACE 저 해활성은 모든 가수분해물에서 반응시간이 12시 간일 때 가장 높은 ACE 저 해활성을 보여주었고, 12시간이 지난 후에는 ACE 저해활성이 오히려 급속하게 감소하는 경향을 보였다(Fig.
- 분해효소(20 mg or 20 11L)를 첨 가하였다. 효소적 가수분해 반응물의 최적 반응시간을 알아보기 위해 6, 12, 18, 24시 간 동안 효소반응을 수행하였다. 각 추출 조건은 단백질 분리 효소 제조사인 Novozyme에서 표기한 각 효소의 최적 온도 및 pH로 조절하여 사용하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 해조류는 2004년 2월 ~4월 사이에 제주 연안에서 채집하여 제주대학교 해양생산과학부에서 동정 받아 수세 후 동결 건조하여 사용하였다.
- 안지오텐신 전환 효소(ACE: angiotensin I -converting enzyme)와 기질로 사용한 HHL(hyppuryl-histidyl-leucine)은 시그■마에서 구입하였고(St. Louis, MO), 단백질 분해효소(Protamex, Kojizyme, Neutrase, Flavourzyme, Alcalase)는 Nozyme 회사(Novozymes Nordisk, Bagsvaerd, Den-mark)에서 구입 하여 사용하였다. 그 외 모든 시약은 분석용 특급 시약을 사용하였다.
- 해조류유래 물질로부터 고혈압의 원인 물질인 angiotensin- I 전환 효소(ACE)의 저해활성을 측정하기 위해 총 116개의 추출물을 검색하였으며 그 결과는 Table 1에 나타내었다. 대 부분의 녹조류는 매우 낮은 ACE 저 해활성을 보인 반면, 납작파래 (EEercmor湖a compressa)^] 20AE와 70 AE에서 각각 52.
이론/모형
- 단백질 분해효소(Protamex, Kojizyme, Neutrase, Flavo~ urzyme, Alcalase)를 이용하여 Heo 등(25)의 방법에 따라 효소적 가수분해를 하였다. 여기서 추출 분리된 peptide를 가지고 ACE 저해활성을 측정하였으며 추출방법은 다음과 같다.
성능/효과
- 2에 나타내었다. Fig. 2에서는 추출물의 농도가 증가함에 따라 ACE 저해 활성이 증가함을 확인할 수 있었고, 잇바디괭생이모자반, 말미역, 바위주름, 넓패, 톳 다시마의 1喝값은 각각 20.03, 157.67, 122.66, 137.74, 28.55, 105.99 Ug/mL로, 가장 높은 ACE 저해 활성을 보인 것은 잇바디 괭생이모자반이었다. 갈조류에서는 ACE 저해활성을 나타내는 것이 주로 ME라는 점에서 갈조류에 주로 함유된 fucoxanthin, phlorotannin이나 poly-phenols에 의한 영향일 것이라 사료된다.
- 4는 다섯 종류의 단백질 분해효소의 작용으로 얻어진 70AE 감태 가수분해물의 ACE 저해활성을 나타낸 그림이다. Kojizyme 가수분해물에서 가장 강한 ACE 저해활성을 보였으며, IGso값이 2.33 Ug/mL였다. Flavourzyme, Neutrase, Alcalase, Protease에 대한 효소적 가수분해물의 ACE 저 해활성 또한 높게 나타났으며 , 이에 대한 心。값은 각각 3.
- Yasantha와 Jeon(28)에 의해 감태 가수분해물에 대한 ACE 저해활성은 감태에 함유되어 있는 단백질 peptide에 의한 것이라고 설명하였으나, 본 연구의 결과 상온 추출물에 대한 ACE 저 해활성은 AE와 ME에서 유사한 결과를 보여주었다. 이러한 결과를 통하여 볼 때 감태가 가지는 ACE 저해활성은 단백질 peptide에 의한 영향도 있지만, poly-phenol계 활성물질도 관여한 것이라고 사료된다.
- 갈조류의 20ME 추출물에서 는 외 톨개 모자반(Myagmpsis myagroides)에서 비교적 높은 ACE 저 해활성 (63.62%)을 보였고, 바위 주름(尸让诚 厂ugosw”) 과 감태 (Ec烛 caua)에서는 각각 51.81%와 47.12%로 약간의 ACE 저해 활성을 보였다. 한편, 갈조류의 70ME 추출물에서는 바위주름(Petrospongium rugosum), ^(Laminaria ochotensis)와 잇바디괭생이모자반(Sargasssn Ziomeri)에서는 각각 75.
- 스크리닝하였다. 그 결과, 녹조류에서는 비교적 낮은 ACE 저 해 활성을 보였으나, 갈조류에서 는 70ME 잇 바디 괭생이모자반, 말미역, 바위주름, 넓패, 톳, 다시마 및 70AE 감태 에서 ACE 저 해 활성이 높게 나타났다. 또한 70AE 감태의 가수분해물은 2.
- 나타내었다. 대 부분의 녹조류는 매우 낮은 ACE 저 해활성을 보인 반면, 납작파래 (EEercmor湖a compressa)^] 20AE와 70 AE에서 각각 52.98%와 49.80%로 긍정적 인 ACE 저해활성을 보여주었다. 한편, 70ME 참홑파래(Monos/rcma nitidum)와 잎파래 (E"e广amg血! 如za)에서 는 각각 47.
- 그 결과, 녹조류에서는 비교적 낮은 ACE 저 해 활성을 보였으나, 갈조류에서 는 70ME 잇 바디 괭생이모자반, 말미역, 바위주름, 넓패, 톳, 다시마 및 70AE 감태 에서 ACE 저 해 활성이 높게 나타났다. 또한 70AE 감태의 가수분해물은 2.33 ~3.56 Jig/mL의 ICso값을 보여 매우 높은 ACE 저 해활성을 확인할 수 있었다. 이는 해조류의 ACE 저해활성이 수용성 추출물뿐만 아니라 메탄올 추출물에서도 나타나는 것은 해조류 유래 fucoxanthin, phlorotannin 및 polyphenol계 화합물 등에 의한 영 향도 있을 것으로 사료된다.
- 67 ng/mL의 범위를 나타냈으며, 이는 가장 낮은 1如값을 가지는 해조류의 ACE 저 해 활성이 크릴이 나 가자미 어 뼈 단백질 peptide보다도 오히려 낮게 나타났다. 또한, 감태의 효소 가수분해 물의 IGo값은 2.33 ~ 3.56 Ug/mL로 앞서 연구된 해양생물 유래 ACE 저해활성물질들보다 아주 뛰어난 AEC 저해활성을 보여주었다. 이러한 결과는 분리정제한 해조류의 차후 실험에 대한 긍정적인 기대효과를 가져다 주었다.
- 그러나 해조류 유래의 ACE 저해 활성 물질에 대한 연구는 여전히 미흡한 것으로 알려졌다. 본 연구결과에 따르면, 해조류는 식품이나 의 약학적 인 측면에서 잠재적 인 천연 ACE 저 해물질을 가지고 있는 것으로 사료된다. 그러나 해조류에 있어서의 ACE 저 해물질에 대한 연구는 아직까지 많이 이루어지지 않고 있으며, 해조류 peptide 분리물에 의한 저해활성 또한 연구가 아주 미약하다.
- 또한 Jung 등(31)과 Je 등(32)에 의 한이 두 연구에서 모두 자연유발 고혈 압쥐 (SHR; spontaneous hypertensive rat)의 혈압이 감소함을 확인할 수 있었다. 본 연구결과에서는, 메탄올 추출물에 대한 ICa;값은 20.03~ 157.67 ng/mL의 범위를 나타냈으며, 이는 가장 낮은 1如값을 가지는 해조류의 ACE 저 해 활성이 크릴이 나 가자미 어 뼈 단백질 peptide보다도 오히려 낮게 나타났다. 또한, 감태의 효소 가수분해 물의 IGo값은 2.
- Yasantha와 Jeon(28)에 의해 감태 가수분해물에 대한 ACE 저해활성은 감태에 함유되어 있는 단백질 peptide에 의한 것이라고 설명하였으나, 본 연구의 결과 상온 추출물에 대한 ACE 저 해활성은 AE와 ME에서 유사한 결과를 보여주었다. 이러한 결과를 통하여 볼 때 감태가 가지는 ACE 저해활성은 단백질 peptide에 의한 영향도 있지만, poly-phenol계 활성물질도 관여한 것이라고 사료된다.
- 3). 특히, Flavour-zyme 가수분해물은 약 90%의 거의 완벽한 ACE 저 해활성을 나타내었으며, Alcalase 효소적 가수분해물에서도 72% 의 강한 ACE 저해활성을 보였다(Fig. 3). Fig.
- 12%로 약간의 ACE 저해 활성을 보였다. 한편, 갈조류의 70ME 추출물에서는 바위주름(Petrospongium rugosum), ^(Laminaria ochotensis)와 잇바디괭생이모자반(Sargasssn Ziomeri)에서는 각각 75.22%, 73.55%와 70.70%로 비교적 강한 ACE 저해 활성을 나타내 었다. 그리고 가장 강한 ACE 저 해 활성 은 70ME의 톳(Hizikia 九应仞me)에서 나타났다(86.
- 수행하였다. 효소반응 시간에 따른 70AE 감태의 효소적 가수분해물에 대한 ACE 저 해활성은 모든 가수분해물에서 반응시간이 12시 간일 때 가장 높은 ACE 저 해활성을 보여주었고, 12시간이 지난 후에는 ACE 저해활성이 오히려 급속하게 감소하는 경향을 보였다(Fig. 3). 특히, Flavour-zyme 가수분해물은 약 90%의 거의 완벽한 ACE 저 해활성을 나타내었으며, Alcalase 효소적 가수분해물에서도 72% 의 강한 ACE 저해활성을 보였다(Fig.
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