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문제 정의
- 본 연구는 CRP1 부위와 CRP2 부위에 대한 CRP 단백질의 결합력을 관찰하였으며 또한 CRP2 부위에 CRP 단백질 이 결합할 때 TCAC의 역할과 중요성을 알기 위해 GTGA 와 TCAC 사이의 간격을 변화시킬 때, 즉 13개 염기 간격인 DNA2를 6개 염기 간격인 DNA3 그리고 6개 간격 및 원래 존재하는 TCAC를 CTCA로 변화시킨 DNA4를 이용하여 CRP 단백질의 결합력을 관찰하였다. 이 연구에 DNA 단백질 혹은 단백질-단백질 사이의 상호작용 연구에 이용되는 형광물질을 이용하였다.
제안 방법
- 1에서 보듯이 사용된 oligomer는 CRP1 부위와 CRP2 부위의 염기서열 또는 염기서열을 변화시킨 oligomer들의 5’ 끝에 형광물질인 fluorescein을 부착하였다. 그리고 DNA 결합측정은 transcription buffer(100mM KCL 40mM Tris-HCl (pH 8.0), lOmM MgC& IM DTT, 5% 이ycer이)에서 lOOnM DNA, 200 "M cAMP 농도에서 최종 부피가 500#가 되게 하여 37°C 에서 fluoTometeT(HoTiba사 의 FluoroMax-3 모델)로 측정하였다. 그리고 fluorescein이 부착된 oligomer의 농도가 증가함에 따라 형광의 세기가 직선적으로 증가함이 확인되었다.
- 그리고 fluorescein이 부착된 oligomer의 농도가 증가함에 따라 형광의 세기가 직선적으로 증가함이 확인되었다. CRP 단백질의 결합실험은 CRP의 농도가 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6,1,1.4,1.8, 2.2, 그리고 2.6“M이 되도 톡 첨가하여 1분간 반응시킨 후 490nm의 excitation 파장과 520nm의 emission 파장에서 quenching 값을 3회 반복하여 측정하고 평균값을 사용하였다.
- Gel shift assay 결과 8 에 의하면 low-salt buffer에서 CRP 단백질이 CRP2 부위보다 CRP1 부위에 우세하게 결합하지만 결합 상수의 비율에서 어떻게 측정했느냐에 따라 상당한 차이를 보였다. 본 연구의 결과와 결합 상수의 비율을 정확하게 비교할 수는 없지만 차이를 보이는 것은 본 연구에서 사용한 완충 용액이 100mM KC1을 포함하고 있으며, 또한 결합력을 측정할 때 gel이 아닌 용액 상태에서 했으며 그리고 동일한 환경에서 각각의 CRP 농도에 대하여 3번 측정한 값들의 평균값을 사용하였다
대상 데이터
- CRP 단백질은 crp 유전자가 expression vector#인 pRE2 에 클론된 pRE2crp와 온도에 민감한 repressor 단백질을 포함하는 pRK248을 이용하였다 4 . 그리고 숙주세포로 CA8445를 이용하였으며 37°C에서 배양한 후 42C에서 heat induction 하여 대량으로 생산하였다.
- 인 pRE2 에 클론된 pRE2crp와 온도에 민감한 repressor 단백질을 포함하는 pRK248을 이용하였다 4 . 그리고 숙주세포로 CA8445를 이용하였으며 37°C에서 배양한 후 42C에서 heat induction 하여 대량으로 생산하였다. 이어 P-11, Hydroxyapatite, CM sephadex, Affi-gel blue 등의 수지를 이용하여 분리한 뒤 12.
- 본 연구는 CRP1 부위와 CRP2 부위에 대한 CRP 단백질의 결합력을 관찰하였으며 또한 CRP2 부위에 CRP 단백질 이 결합할 때 TCAC의 역할과 중요성을 알기 위해 GTGA 와 TCAC 사이의 간격을 변화시킬 때, 즉 13개 염기 간격인 DNA2를 6개 염기 간격인 DNA3 그리고 6개 간격 및 원래 존재하는 TCAC를 CTCA로 변화시킨 DNA4를 이용하여 CRP 단백질의 결합력을 관찰하였다. 이 연구에 DNA 단백질 혹은 단백질-단백질 사이의 상호작용 연구에 이용되는 형광물질을 이용하였다.
성능/효과
- 6배, DNA4보다 9배 결합력이 우세하다. Fig. 1에서 보듯이 GTGA와 TCAC 사이의 염기 간격을 CRP1 부위와 동일한 6개 염기들로 치환된 DNA3와 DNA4도 13개의 염기 간격을 가진 DNA2에 비해 절반 정도의 결합력을 보였다. 이 결과는 CRP2 부위에서 CRP 단백질의 결합이 consensus sequence 사이의 염기 간격에 의한 영향이 크지 않음을 보여준다.
- 또한 Ebright et al 3 에 의하면 이런 돌연변이 CRP는 DNA에 결합하지 못하기 때문에 락토스 전사를 활성화하지 못한다고 보고했다. 그러나 본 연구의 결과에 의하면 T127G CRP가 DNA에 전혀 결합할 수 없는 것이 아니라 약한 결합이 이루어지는 것을 알 수 있다. 앞에서 언급한 야생형의 경우와 마찬가지로 GTGA와 TCAC 사이의 염기 간격이 변화되어도 결합력에는 큰 영향을 주지 않았다•
- 또한, CRP1 부위가 CRP2 부위보다 결합력이 훨씬 우세한 것으로 나타났다. 그리고 CRP1 부위와 동일하게 6개의 염기 간격을 맞춘 DNA3의 결합력은 DNA2에 비해 절반 정도의 결합력을 나타내었다. 또한 CRP2 부위의 염기서열에서 TCAC를 제거한 DNA4 의 결합력 역시 DNA3과 비슷한 결과를 보여주었다.
- 0), lOmM MgC& IM DTT, 5% 이ycer이)에서 lOOnM DNA, 200 "M cAMP 농도에서 최종 부피가 500#가 되게 하여 37°C 에서 fluoTometeT(HoTiba사 의 FluoroMax-3 모델)로 측정하였다. 그리고 fluorescein이 부착된 oligomer의 농도가 증가함에 따라 형광의 세기가 직선적으로 증가함이 확인되었다. CRP 단백질의 결합실험은 CRP의 농도가 0, 0.
- 이 결과에서 cAMP 결합과 이에 수반되는 CRP 구조 변화에 127번 아미노산인 threonine 역할을 보여주는 결과이다. 또한, CRP1 부위가 CRP2 부위보다 결합력이 훨씬 우세한 것으로 나타났다. 그리고 CRP1 부위와 동일하게 6개의 염기 간격을 맞춘 DNA3의 결합력은 DNA2에 비해 절반 정도의 결합력을 나타내었다.
- 2에서 보듯이 cAMP가 있을 때 야생형 CRP에 의한 4가지 DNA의 결합 특성을 보여준다. 야생형 CRP의 DNA의 결합은 DNAL DNA2z DNA3, DNA4의 순서로 결합력 이 증가되는 것으로 나타났으며 이것은 CRP1 부위를 가진 DNA1 이 CRP2 부위를 가진 DNA2보다 3배, DNA3보다 6.6배, DNA4보다 9배 결합력이 우세하다. Fig.
- 3에서 T127G CRP에 의한 DNA의 결합에 관한 결과를 보여준다. 여기서 야생형 CRP와 동일한 경향을 보였으며 각각의 결합력은 DNA1 이 DNA2보다 1.6배, DNA3 보다 2.1배, DNA4보다 2.2배 결합이 증가하였다. 특히 T127G CRP만 존재하는 기준 샘플(control)이 DNA3 그리고 DNA4와 거의 동일한 결합력을 갖는다.
- 요약하면 야생 형 CRP와 T127G CRP의 결과를 비교하여 보면 DNA3과 DNA4에서는 확실하게 나타나지는 않지만 DNA1과 DNA2에서 야생형 CRP가 T127G CRP보다 수배 높은 결합력을 나타내었다. 이 결과에서 cAMP 결합과 이에 수반되는 CRP 구조 변화에 127번 아미노산인 threonine 역할을 보여주는 결과이다.
- 특히 T127G CRP만 존재하는 기준 샘플(control)이 DNA3 그리고 DNA4와 거의 동일한 결합력을 갖는다. 이 결과는 기본적으로 cAMP 결합 부위의 아미노산 치환이 cAMP의 결합에 의한 CRP의 활성인 형태로의 구조적인 변화가 야생형 CRIM 비해 낮다는 것을 보여준다. Lee et al#이에 의하면 T127G CRP는 cAMP 하에서 야생형 CRP:cAMP 복합체와 유사한 구조를 갖지만 lacP를 활성화하지 못했다.
- 이 결과들을 Origin 6.0 프로그램을 이용한 non-linear regression 분석 5, 기에서 DNA1에 대한 결합력에서 야생형 CRP가 T127G CRP 보다 약 3배가 크며, 또한 DNA2에 대한 경우는 3.5배 야생형 CRP의 결합력이 큼을 보여준다. 그러나 DNA3와 DNA4의 경우는 Fig.
- 이 결과들을 Origin 6.0 프로그램을 이용한 non-linear regression 분석 5, 기에서 DNA1에 대한 결합력에서 야생형 CRP가 T127G CRP 보다 약 3배가 크며, 또한 DNA2에 대한 경우는 3.5배 야생형 CRP의 결합력이 큼을 보여준다. 그러나 DNA3와 DNA4의 경우는 Fig.
- 또한 CRP2 부위의 염기서열에서 TCAC를 제거한 DNA4 의 결합력 역시 DNA3과 비슷한 결과를 보여주었다. 이 결과를 통해서 알 수 있는 것은 CRP 단백질의 결합력은 GTGA와 주변 염기들에 의한 복합적인 상호작용이 결합에 영향을 주는 것으로 여겨진다.
- 요약하면 야생 형 CRP와 T127G CRP의 결과를 비교하여 보면 DNA3과 DNA4에서는 확실하게 나타나지는 않지만 DNA1과 DNA2에서 야생형 CRP가 T127G CRP보다 수배 높은 결합력을 나타내었다. 이 결과에서 cAMP 결합과 이에 수반되는 CRP 구조 변화에 127번 아미노산인 threonine 역할을 보여주는 결과이다. 또한, CRP1 부위가 CRP2 부위보다 결합력이 훨씬 우세한 것으로 나타났다.
- 그리고 숙주세포로 CA8445를 이용하였으며 37°C에서 배양한 후 42C에서 heat induction 하여 대량으로 생산하였다. 이어 P-11, Hydroxyapatite, CM sephadex, Affi-gel blue 등의 수지를 이용하여 분리한 뒤 12.5% SD9PAGE로 확인한 결과 95% 이상 순수하였다. 그리고 분리된 CRP의 확인을 위하여 cAMP의 존재 유무에 따라 proteolytic di#estion을 통하여 CRP를 확인하였다#,
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