초록 ▼

유전자 발현에 관한 일반적인 기작을 endo-glucanase, human interferon, streptokinase, chemotaxis에 관여하는 4가지 유전자를 모델로 삼아 연구하였다. 이들의 유전자가 가진 고유의 promoter를 제거하고, 강력한 발현력을 지닌 tacpromoter (Ptac)과 P(sub)L prmoter ((sub)pP(sub)L)로 대치한 다음, 그것이 발현에 미치는 영향을 조사함으로써, 유전자의 발현에 필요한 제반조건을 조사하기로 하였다.
Endo-glucanase 유전자를

유전자 발현에 관한 일반적인 기작을 endo-glucanase, human interferon, streptokinase, chemotaxis에 관여하는 4가지 유전자를 모델로 삼아 연구하였다. 이들의 유전자가 가진 고유의 promoter를 제거하고, 강력한 발현력을 지닌 tacpromoter (Ptac)과 P(sub)L prmoter ((sub)pP(sub)L)로 대치한 다음, 그것이 발현에 미치는 영향을 조사함으로써, 유전자의 발현에 필요한 제반조건을 조사하기로 하였다.
Endo-glucanase 유전자를 Sau3A로 처리함으로서, ATG 전사개시 코돈의 상류 4 bp와 TAG 전사종료 코돈의 상류 35 bp에서 절단한 1,486 bp의 구조 유전자 (ENG)인 Sau3A-Sau3A의 DNA 단편을 만들었다. 다음에 이 ENg 구조 유전자를 pKK223-3 플라스미드의 Ptac 아래에 연결시켜 새로운 유전자 Ptac-ENG를 만들었다. 이 Ptac-ENG로 Escherichis coli JM103와 Bacillus subtilis를 형질전환시켜 LB 배지에 배양하면서 이 유전자의 발현 현상을 조사하였다. 또 이 Prtac-ENG를 B.subtilis에서 발현시키기 위해 Ptac의 -10 부위와 -35 qndnl tkdlfmf 16, 17, 18, 19 bp로 변경시켜 그 영향도 조사하였다. 이와 비슷한 방법으로 human interferon 유전자 (INF)의 promoter를 대치한 Ptac-INF와 pPL-INF 유전자도 만들었다. pPL-INF의 제작을 위해서는 pPL-INF의 제작을 위해서는 pPL2833 플라스미드가 이용되었다. Streptokinase 유전자 (SKN)의 고유의 유전자도 작성하였다. 화학주성 유전자 (TRG)의 promoter도 Ptac과 pPL로 대치하였다. Tn10::Trp-lacZ를 이용하여 TRG를 operon으로 융합시키는 실험도 하였다.
E. coli JM103를 Ptac-Eng로 형질전환 시킨 세포를 IPTG로 유도배양했더니 총 세포단백질량의 25%에 해당하는 endo-dlucanase를 생산하였다. 그러나 이 단백질의 대부분이 효소기능을 잃은 inclusion body로 나타났다. 이 inclusion body 형성의 문제는 숙주를 E. coli 에서 B. subitilis로 바꿈으로써 해결되었다. 원래 E. coli를 위해 개발한 Ptac 이 B. subtilis 에서도 발현도 이미 증명되었다. 그러나 그 발현능력은 E. coli에서 보다 약했다. 그 약한 이유는 Ptac의 -10 과 -35 부위 사이의 거리에 관계 없었다. Ptac-INF의 발현은 promoter 30 bp에서 8 bp로 줄이므로써 총 단백질량의 1%에 해당되는 human interferon을 생산했으며, inclusion body의 개입은 없었다. Ptac-SKN과 pPL-SKN으로서의 streptokinase의 생산에 있어서는, 이 효소의 leader peptide가 membrane protein과 작용하여 세포를 lysis 시킨다는 사실이 발견되었다. SKN유전자에서 leader sequence를 제거함으로써 lysis 문제가 해결되고, 총 단백질량의 12%에 해당하는 streptokinase를 얻을 수 있었다. IPTG 유도로써 생산한 Ptac-TRG 산물은 swarm size를 linear 하게 감소시킨다는 사실이 관찰되어, trg-21 돌연변이체에 신호전달능의 상실을 감지할 수 있게 되었다.
이상의 결과를 종합하여 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다. 1) Promoter DNA 상의 SD와 ATG 전사개시 코돈 사이의 거리가 유전자의 발현에 영향을 가지며 8 bp가 가장 좋았다. 2) 원래 E. coli를 위해 제작된 tac promoter가 B. subtilis에서도 이용이 가능하다. 3) Promoter의 -10과 -35 qndnl tkdldml rjflrk 16과 18 bp의 범위내에서는 유전자의 발현에 영향을 주지 않는다. 4) Streptokinase 유전자의 leader sequence는 세포의 lysis에 관여하며, 이것을 제거함으로써 세포의 lysis를 막을 수 있다. 5) 주화성 유전자의 promoter 부분을 개조하거나 이 유전자를 lacZ에 붙여줌으로써 주화성 신호를 조절할 수 있게 되었다.

Abstract ▼

The general mechanisms involved in the expression of genes were studied using four model genes governing the production of endo-glucanase, human interferon, streptokinase, and bacterial chemosensory transducer. The native promoters of the model genes were replaced by strong promoters, such as ta

The general mechanisms involved in the expression of genes were studied using four model genes governing the production of endo-glucanase, human interferon, streptokinase, and bacterial chemosensory transducer. The native promoters of the model genes were replaced by strong promoters, such as tac promoter (Ptac) and P(sub)L promoter ((sub)pP(sub)L), and their responses observed to find factors required for the expression of the genes.
A Sau3A-Sau3A segment having 1,486 bp, which represent the structural part (ENG) of the endo-glucanase gene, was constructed by digesting with Sau3A at the sites of 4 bp upstream of ATG initial codon and 35 bp upstream of TAG termination codon. The ENG structure gene was then connected to the down stream of Ptac on plasmid pKK223-3 and constructed a new gene, Ptac-ENG. With Prtac-ENg Escherichia coli JM103 and Bacillus subtilis were transformed. The expression of Ptac-ENG in these organisms was then observed. For the expression in B. subtilis, promoters having different distances between -10 and -35 region of Ptac were also constructed. By the similar method the native promoter of human interferon gene (INF) was replaced and Ptac-INF gene was constructed. For the construction (sub)pP(sub)L - INF, (sub)pPL2833 was used. New genes of Ptac-SKN and (sub)pP(sub)L - SKN in which the native promoter of streptokinase gene (SKN) was replaced were constructed. The native promoter of chemosensory receptor gene (TRG) was also replaced with Ptac and (sub)pP(sub)L. The fusion of TRG into operon using Tn10::Trp-lacZ was also attempted.
The E. coli JM103 transformed with Ptac-ENG expressed well and produced endo-glucanase which occupied 23% of the total proteins in the cell when the culture was induced with IPTG. However, the majority of the endo-glucanase protein was found to be an inclusion body which lost its enzyme activity. The problem of inclusion body formation was solved by changing the E. coli host cell to B. subtilis. The tac promoter which was constructed originally for E. coli was found to be expressed in B. subtilis. The expression of Ptac in B. Subtilis, however, was not as strong as in E. coli. The reduced expression in B. subtilis was not related to the distance between the two regions of -10 and -35 in the Ptac DNA. The expression of Ptac-INF was largely depended on the distance between SD and initiation codon ATG in the promoter of the human interferon gene. When the distance of 30 bp was reduced to 8 bp, the gene produced inclusion body free human interferon to the level of 1% of the total protein. On the production of streptokinase with Ptac-SKN and (sub)pP(sub)L -SKN genes, the leader peptide of streptokinase was found to interact with membrane protein resulting in cell lysis. By removing the leader sequence from Ptac-SKN and (sub)pP(sub)L-SKN, the lysis problem was solved and a production of 12% streptokinase was possible. The product of IPTG induced Ptac-TRG induced Ptac-TRG gene reduced the sqarm size linearly suggesting the loss of chemotactic activity in the trg-21 mutant.
From the above results the following conclusions may be derived. 1) The spacing between SD and initiation codon ATG in promoter DNA exerts strong influence on the expression of a gene with 8 bp as optimal spacing. 2) The tac promoter which was originally developed for E. coli can be used in B. subtilis also. 3) The distance between -10 and -35 regions in tac promoter in the range of 16 and 19 bp has no effect on the expression of the gene. 4) The leader sequence of streptokinase gene is responsible on the sequence from the gene can protect cells from the lysis. 5) Artificial regulation of chemotaxis signals is possible by modifying promoters as well as by fusing the reporter gene with lacZ.

목차 Contents

• 1. 서 론...9
• 2. 연구방법...9
• 3. 결 과...9
• 4. 고 찰...9
• 5. 결 론...9
• 목 차...10
• 제 1 장. 서 론...12
• 제 2 장. 연구방법...15
• 제 1 절 Tac promoter을 이용한 endo-beta-1,4-glucanase 유전자의 발현 (제1세부과제 )...15
• 제 2 절. $\underline{E. \;coli}$ phage P$_L$ promoter의 발현기작과 그것을 이용한 galactokinase와 사람 베타 인터페론의 생산(제2세부과제)...15
• 제 3 절. P$_L$ 및 spo2 promoter를 이용한 스트렙토키나제 유전자의 발현 (제3세부과제 )...16
• 제 4 절. 생체정보분석을 위한 전산시스템 구성 및 P$_L$ 과 P$_{tac}$을 이용한 화학주성유전자의 발현기작 연구(제4세부과제)...17
• 1. 생체정보시스템...17
• 2. 주화성 유전자의 발현...17
• 제 3 장. 결 과...18
• 제 1 절 Tac promoter을 이용한 endo-beta-1,4-glucanase 유전자의 발현 (제1세부과제)...18
• 제 2 절. $\underline{E. \;coli}$ phage P$_L$ promoter의 발현기작과 그것을 이용한 galactokinase와 사람 베타 인터페론의 생산(제2세부과제)...18
• 제 3 절. P$_L$ 및 spo2 promoter를 이용한 스트렙토키나제 유전자의 발현 (제3세부과제)...19
• 제 4 절. 생체정보분석을 위한 전산시스템 구성 및 P$_L$ 과 P$_{tac}$을 이용한 화학주성유전자의 발현기작 연구 (제4세부과제)...20
• 1. 생체정보시스템...20
• 2. 주화성 유전자의 발현...20
• 제 4 장. 고 찰...21
• 제 1 절 Tac promoter을 이용한 endo-beta-1,4-glucanase 유전자의 발현 (제1세부과제)...21
• 제 2 절. $\underline{E. \;coli}$ phage P$_L$ promoter의 발현기작과 그것을 이용한 galactokinase와 사람 베타 인터페론의 생산 (제2세부과제)...22
• 제 3 절. P$_L$ 및 spo2 promoter를 이용한 스트렙토키나제 유전자의 발현 (제3세부과제)...23
• 제 4 절. 생체정보분석을 위한 전산시스템 구성 및 P$_L$ 과 P$_{tac}$을 이용한 화학주성유전자의 발현기작 연구 (제4세부과제)...24
• 1. 생체정보시스템...24
• 2. 주화성 유전자의 발현...25
• 제 5 장. 결 론...26
• 제 1 절. Tac promoter을 이용한 endo-beta-1,4-glucanase 유전자의 발현 (제1세부과제)...26
• 제 2 절. $\underline{E. \;coli}$ phage P$_L$ promoter의 발현기작과 그것을 이용한 galactokinase와 사람 베타 인터페론의 생산 (제2세부과제)...26
• 제 3 절. P$_L$ 및 spo2 promoter를 이용한 스트렙토키나제 유전자의 발현 (제3세부과제)...27
• 제 4 절. 생체정보분석을 위한 전산시스템 구성 및 P$_L$ 과 P$_{tac}$을 이용한 화학주성유전자의 발현기작 연구 (제4세부과제)...28
• 제 1 세 부 목 차...29
• 1. 서 론...30
• 2. 연구방법...30
• 3. 결 과...30
• 4. 고 찰...30
• 5. 결 론...30
• 6. 참고문헌...30
• 목 차...31
• 제 1 장. 서 론...32
• 제 2 장. 연구방법...34
• 제 1 절. Endo-beta-1,4-glucanase 유전자의 고유의 promoter를 Tac promoter로 대치...34
• 제 2 절. E. coli에서의 발현...34
• 제 3 절. B. subtilis에서 발현...35
• 제 4 절. Ptac의 -35와 -10 부위 사이의 거리 변경...35
• 제 3 장. 결 과...36
• 제 1 절. Endo-beta-1,4-glucanase 유전자의 구조유전자 (ENG) 단편의 작성...36
• 제 2 절. Ptac-ENG 유전자의 제작...41
• 제 3 절. Ptac-ENG의 E. coli에서의 발현...41
• 제 4 절. Ptac-ENG 유전자의 B. subtilis 속에서의 발현...45
• 제 5 절. Ptac-ENG의 Ptac 개조...53
• 제 6 절. Ptac 개조 후의 효소생산...56
• 제 4 장. 고 찰...61
• 제 5 장. 결 론...64
• 제 6 장. 참고문헌...65
• 제 2 세 부 목 차...68
• 1. 서 론...68
• 2. 연구방법...68
• 3. 결 과...68
• 4. 고 찰...68
• 5. 결 론...68
• 6. 참고문헌...68
• 목 차...69
• 제 1 장. 서 론...70
• 제 2 장. 연구방법...72
• 제 1 절. 플라즈미드...72
• 제 2 절. 화학약품과 효소...72
• 제 3 절. 재조합 DNA 기술...72
• 제 4 절. 염기서열 읽기...72
• 제 5 절. 인터페론 유전자의 발현...72
• 제 3 장. 결 과...74
• 제 1 절. 사람 인터페론 베타 cDNA에서 신호배열 제거...74
• 제 2 절. Tac Promoter와 람다 pL promoter 다음에 인터페론 유전자의 연결...76
• 제 3 절. 대장균에서의 인터페론 유전자의 발현...78
• 제 4 절. SD 서열을 인터페론 유전자에 연결...79
• 제 5 절. pINF-531을 tac 과 람다 pL Promoter 에 연결...81
• 제 6 절. pKK223-3-INF-SD 와 pLc2833-lNF-SD 의 발현...81
• 제 4 장 고 찰...112
• 제 5 장 결 론...114
• 제 6 장 참고문헌...116
• 제 3 세부목차...119
• 1. 서 론...119
• 2. 연구방법...119
• 3. 결 과...119
• 4. 고 찰...119
• 5. 결 론...119
• 6. 참고문헌...119
• 목 차...120
• 제 1 장. 서 론...122
• 제 1 절. 연구배경...122
• 1. Streptokinase...122
• 2. Streptokinase 의 발현과 분비...125
• 제 2 절. 본 연구의 목적 및 기대효과...128
• 제 2 장. 연구방법...130
• 제 1 절. 대장균에서 streptokinase 의 발현...130
• 1. P$_L$ promoter 에 의한 streptokinase 대량 발현 vector 의 제조...130
• 2. P$_L$ 에 의한 streptokinase 의 발현 조절...132
• 제 2 절. Streptokinase 의 site specific mutagenesis 와 발현...132
• 1. pSK 2.5 의 대량 분리와 PstI, HindIII double digesition...133
• 2. Oligonucleotides 의 합성...133
• 3. SKL 유전자와 M13 mp10$^{amb}$ 의 연결 및 mutant 선별...133
• 4. Mutant SKL fragment 의 염기서열 분석...137
• 5. Mutant streptokinase 의 순수 분리...139
• 6. SK 의 특성 분석...139
• 제 3 장. 결 과...140
• 제 1 절. 대장균에서 스트렙토키나제의 발현...140
• 1. 대장균에서 streptokinase coding gene $\underline{(skc)}$ 의 cloning...140
• 2. $\underline{(skc)}$ 의 순수분리 및 pOTC-10 에??조 및 PL promoter 에 의한 스트렙토키나제의 발현...144
• 4. P$_{tac}$-$\underline{skc}$ 의 제조...151
• 5. 대장균에서 P$_{tac}$ 에 의한 스트렙토키나제의 발현...153
• 6. 세포질 내에서 스트렙토키나제의 용해성에 미치는 배양온도의 영향...156
• 7. 발현된 스트렙토키나제의 분리 정제...159
• 제 2 절. 스트렙토키나제의 부위 특이 돌연변이...159
• 1. 스테렙토키나제 Gly-24 의 돌연변이...161
• 2. Mutant 스트렙토키나제의 culture 상의 활성 비교...164
• 3. 돌연변이 스트렙토키나제의 발현 및 분리 정제...171
• 4. 분리된 돌연변이 스트렙토키나제의 특성 조사...176
• 제 4 장. 고 찰...182
• 제 5 장. 결 론...188
• 제 6 장. 참고문헌...189
• 제 4 세 부 목 차...194
• 1. 서 론...194
• 2. 연구방법...194
• 3. 결과 및 고찰...194
• 4. 결 론...194
• 5. 참고문헌...194
• 목 차...195
• 제 1 장. 서 론...197
• 제 1 절. 연구배경...197
• 1. 생체정보시스템...197
• 가. 생체고분자 서열의 분석...197
• 나. 서열분석을 위한 해외의 database...198
• 2. 주화성 유전자의 발현...199
• 가. 감각수용체 유전자의 세포내 발현...199
• 나. 편향된 주화성 신호에 의해 발현이 조절되는 lacZ 융합...204
• 다. 고온에서 세균의 비운동성을 보상하는 lacZ 융합...206
• 제 2 절. 연구목표...208
• 1. 생체정보시스템...208
• 2. 주화성 유전자의 발현...208
• 제 2 장. 연구방법...209
• 제 1 절. 생체정보시스템...209
• 1. 시스템의 구성...209
• 2. VAlign 의 개념적 접근...209
• 3. VAlign 의 알고리즘...209
• 제 2 절. 주화성 유전자의 발현...210
• 1. 제한효소자리 도입에 의한 프로모터 융합...212
• 2. 융합 유전자로 부터 Trg 단백질의 발현...212
• 3. Tn1O-lacZ 를 이용한 오페론 융합...212
• 4. 편향된 주화성 신호에 의해 발현이 조절되는 유전자의 동정...214
• 제 3 장. 결과 및 고찰...216
• 제 1 절. 생체정보시스템...216
• 1. Copper 단백질의 다중 정렬...216
• 2. Two component 조절계의 단백질...216
• 제 2 절. 주화성 유전자의 발현...221
• 1. Trg 유전자의 조절성 프로모터 융합...222
• 2. Trg 유전자의 발현...222
• 가. P$_{tac}$-trg 유전자의 발현에 따른 주화성 변화...222
• 나. P$_L$프로모터를 이용한 trg 유전자의 발현...226
• 3. 주화성 신호에 의해 조절되는 lacz 융합...229
• 4. 고온에서 세균의 비운동성을 보상하는 lacZ 융합...229
• 가. 염색체상의 fusion 위치...229
• 나. Fusion 에 의한 돌연변이주의 표현형질...233
• 1) 운동성의 변화...233
• 2) 성장 양상의 변화...233
• 3) 융합에 의해 발현되는 lacZ 유전자의 beta-galactosidase의 활성...235
• 제 4 장 결 론...238
• 제 5 장 참고문헌...239