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문제 정의
- 툭히자색고구마의 경우는 Kwon 등 (2002)에 의해 정단분열조직배양이 보고되었을 뿐 극히 미비한 상태이다. 따라서 국내 자색고구마의 기내배양 방법을 위한 기초연구로서 잎 조직으로부터 효과적인 캘러스의 형성 및 식물체의 재분화 시스템을 유도하고자 하였다.
제안 방법
- 광조사가 배양에 미치는 영향을 위해 광, 암조건에서 배양하여 비교하였다. 암, 광조건 모두 1 〜10 μM 2, 4-D 처리구 혹은 와의 조합 처리군에서 배발생 캘러스의 형성률이 높게 나타났다.
- 따라서 최적 조건을 확립하기 위해 1μM 2, 4-D를 중심으로 0.5, 1, l, 1.5μM의 농도와 광조사 조건으로 암, 약광 (3000 lux), 강광 (6000 lux)에서 배발생 캘러스 형성률을 조사하였다. 배양 4주 후에 배발생 캘러스의 형성률을 조사한 결과 강광 0.
- 배양 4주 후 캘러스 형성, 발근률과 배발생률을 조사하였다. 배발생 캘러스는0.5, 1, 1.5 /M 2, 4-D를 첨가한 배기에 상광 (6000 lux), 약광 (3000lux), 암의 3가지 조건에서 유도하였으며, 배양 4주 후에 배발생 캘러스의 형성률을 관찰하였다.
- 5μM 2, 4-1)가 첨가된 배지에서 배양 3〜4 주 후에 생성된 배발생 캘러스로부터 유도하였다.배발생 캘러스를 1, 3, 5 μM abscisic acid (ABA)를 첨가한 MS 배지에서 4, 12, 24일 배양한 후, 3, 6, 9gWAK 첨가된 새로운 배지 에 계대배양 하였다. 배발생 캘러스로부터 소식믈체가 출현하여 2 cm 정도 성장하면, 식물체를 분리하여 생장조절제를 첨가하지 않은 MS 배지에 옮겨 발근을 유도하였다.
- 5, 5, 50 μM 6-benzylammopunne (BA)를 조합 처리한 후, 자색고구마 잎 절편 (5mx5mn)을 petri dish (60 mm x 10 mm)에 3개씩 치상하여 4반복 실시하였다. 배양 4주 후 캘러스 형성, 발근률과 배발생률을 조사하였다. 배발생 캘러스는0.
- 8로 조정한 고체 배지를 사용하였으며, 배 양조건은 26/20°C, 16/8 hr (day/mght), 6000 lux의 광조건으로 하였다. 생장조절제는 0, 1, 10, 100 μM 2, 4-D 와 0, 0.5, 5, 50 μM 6-benzylammopunne (BA)를 조합 처리한 후, 자색고구마 잎 절편 (5mx5mn)을 petri dish (60 mm x 10 mm)에 3개씩 치상하여 4반복 실시하였다. 배양 4주 후 캘러스 형성, 발근률과 배발생률을 조사하였다.
- 잎 조직으로부터 캘러스의 유도는 무균조건에서 생장하고 있는 자색고구마의 3〜5마디의 잎을 채취하여 주맥을 제거하고 5mmx5mm크기로 잘라 캘러스 유도배지에 치상하였다. 캘러스 유도배지는 MS 기본배지에 3% sucrose, 0.
- 계통 IT310의 괴근을 실험 에 이용하였다. 잎 조직은 공급받은 괴근을 화분에서 생장시킨 후, 식물체의 정단으로부터 3〜4번째 잎이 약 4 cm로 생장하면 채 취하여 70% ethanol 에 1 분, 2% Sodium hypochlorite 용액 에 5분간 표면살균하고몉균수로 3회 세 척 하여 1/2 MS (Murashige and Skoog 1962)배지에서 무균 마디배양을 실행하였다. 마디배양에서 식물체가 10cm 정도로 생장하면 잎을 채취하여 배양에 이용하였다.
- 잎 조직을 0.5 μM 2, 4-D 첨가 배지에서 4주 생장하여 형성된 배발생 캘러스로부터 식물체 재분화를 유도하기 위해 형성된 배발생 캘러스를 먼저 1, 3, 5 μM ABA가 첨가된 배지에 옮겨 4, 12, 24일 동안 배양한 후, 3, 6, 9 μM GA3가 첨가된 배지에 계대배양해 재분화 가능성을 조사하였다. 그 결과 ABA 의 농도가 높을수록 뿌리발생이 빨리 시작되며 캘러스의 갈변화가 빨리 진행되었다.
- 치상하였다. 캘러스 유도배지는 MS 기본배지에 3% sucrose, 0.3% phytagel, 0.1% myoinositol을 첨가하고 pH 5.8로 조정한 고체 배지를 사용하였으며, 배 양조건은 26/20°C, 16/8 hr (day/mght), 6000 lux의 광조건으로 하였다. 생장조절제는 0, 1, 10, 100 μM 2, 4-D 와 0, 0.
대상 데이터
- 형성된 shoot 가 5 cm 정도로 성장하면 생장조절제를 첨가하지 않은 MS배지에서 발근을 유도하였고 (Figure 3C), 배양 10주 후에는 완전한 소식믈체를 얻을 수 있었다 (Figure 3D). 기내 소식믈체 (초장 약7〜8 cm)를 포트에 이식하여 정상적으로 생육하였다. 자색고구마의 육종과 세포배양을 통한 안토시아닌 생합성 등을 위해서 적합한 배양 기술의 확립이 요구되는 시점에서 새로이 개발된 자색고구마의 재분화 방법은 형질전환 등에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 전망된다.
- 재료식 믈은 호남농업 시험장 목포시험장에서 공급받은 자색고구마의 계통 IT310의 괴근을 실험 에 이용하였다. 잎 조직은 공급받은 괴근을 화분에서 생장시킨 후, 식물체의 정단으로부터 3〜4번째 잎이 약 4 cm로 생장하면 채 취하여 70% ethanol 에 1 분, 2% Sodium hypochlorite 용액 에 5분간 표면살균하고몉균수로 3회 세 척 하여 1/2 MS (Murashige and Skoog 1962)배지에서 무균 마디배양을 실행하였다.
성능/효과
- 배발생 캘러스의 형성은 1 μM 2, 4-D 단독처리 시 배발생 캘러스 형성률이 적합한 것으로 나타났다. 2.4- D의 농도가 증가함에 따라 캘러스의 형태는 다르게 나타났다. 100 μM에서 1주 후부터, 10 μM에서는 3주 후부터 캘러스가 무르게 변화하며 갈변화한 후 괴사했다.
- 또한, :BA 단독 처리구에서도이같은 형태의 캘러스가 형성되었다.BA 단독처리 혹은 2, 4-D 와 조합하여 BA가 첨가된 배지에서의 캘러스 형성은 BA 농도가 높아질수록 더욱 밀집형으로 형성되었다. 배 양 3주 후부터 1 μM 2, 4-D 처리구에서 부분적으로 점액성의 배발생 캘러스가 형성되기 시작했다.
- 최적 조건으로 ABA를 4일 처리한 후, GA, 첨가배지에 옮겨 14일 배양한 경우 캘러스로부터 자색 밀집 부분이 나타나고 (Figure 3B) 3주 배 양 후에 shoot를 형성하였다. GA, 의 처리기간이 길어질수록 자색 밀집 부분의 형성이 높게 나타났으며 에 배양할 경우 25%의 shoot가 형성되었다.
- NAA와 BA를 조합한 실험의 결과는, 전반적으로 2, 4-D 조합 조건과 유사한 양상을 보였으나, 배발생 캘러스가 전혀 형성되지 않고 부정근 발생이 활발히 유도되어 배발생 캘러스와 식물체 재분화의 유도에 적절치 않은 것으로 나타났다. 이는 고구마의 조직배양 실험에서 나타냈던 다양한 옥신 가운데 2, 4-D가 배발생 캘러스를 유도한 것 (Zheng etal.
- 이 결과와는 대조적으로 12D , 4- 와 조합 처 리구에서 5〜10%의 낮은 빈도의배발생 캘러스 형성률을 나타냈으며, 나머지 부위는 대부 분비 배발생 캘러스로 유도되었다. 결과에서 보는바와 같이 배발생 캘러스의 형성률은 저농도의 BA 첨가군에 비해 저농도 2.4- D 단독처리가 효과적이며, 왕성히 생육하는 비배발생 캘러스는 1 μM 2, 4-D와 0.5-5 μM BA 흔용처리 조건에서 효과적으로 나타났다. 따라서 2, 4-D 단독 처리군에 비교해 BA를 저농도로 첨가시키는 것이 callus 생장과 증식에 더 효과적인 것으로 나타났다.
- 5 μM 2, 4-D 첨가 배지에서 4주 생장하여 형성된 배발생 캘러스로부터 식물체 재분화를 유도하기 위해 형성된 배발생 캘러스를 먼저 1, 3, 5 μM ABA가 첨가된 배지에 옮겨 4, 12, 24일 동안 배양한 후, 3, 6, 9 μM GA3가 첨가된 배지에 계대배양해 재분화 가능성을 조사하였다. 그 결과 ABA 의 농도가 높을수록 뿌리발생이 빨리 시작되며 캘러스의 갈변화가 빨리 진행되었다. 또한 ABA의 처리기간이 길어짐에 따라 뿌리 발생의 빈도는 감소하였다.
- 또한 2, 4-D와 저농도의 kinetin을 흔용 처리해 재분화한 Mm 등 (1994)의실험과 달리 자색고구마의 배발생 캘러스는 뿌리발생 이후 갈변과 함께 괴사하였다. 그러나 본 실험에서 자색고구마의 경우 Otam 등 (1998)의 실험결과와 유사한 ABA 처리 후, 이어서 GA, 의 처리가 식물체 재분화에 효과적인 것으로 나타났다. 즉, 자색고구마의 shoot 형성에는 배발생 캘러스의 생성 후, 단일조건에서 ABA의 처리가 중요한 단계로 추측되며 농도는 5 μM이 가장 적합하였다.
- 동일 농도의 2, 4-D 첨가에서는 BA 농도가 상승시킴에 따라 더 밀집형 캘러스를 형성하였으며, 캘러스의 증식은 0.5〜5 BA와 2, 4-D 조합 처리가 효과적 인 것으로 나타났다. 그러나 50 μM BAP의 첨가는 캘러스을 매우 밀집형으로 유도하며, 고농도의 2, 4-D, 즉 100 μM의 첨가는 캘러스의 형성이 나타나지 않고 괴사했다.
- 5-5 μM BA 흔용처리 조건에서 효과적으로 나타났다. 따라서 2, 4-D 단독 처리군에 비교해 BA를 저농도로 첨가시키는 것이 callus 생장과 증식에 더 효과적인 것으로 나타났다. 고구마의 조직배 양시 대부분 낮은 농도의옥신 첨 가배 지 (Lm et al.
- 그 결과 ABA 의 농도가 높을수록 뿌리발생이 빨리 시작되며 캘러스의 갈변화가 빨리 진행되었다. 또한 ABA의 처리기간이 길어짐에 따라 뿌리 발생의 빈도는 감소하였다. 0.
- 5 μM BA를 첨가한 경우 비배발생 캘러스를 먼저 형성한 후, 배발생 캘러스가 낮은 빈도로 나타났다. 배발생 캘러스의 형성은 1 μM 2, 4-D 단독처리 시 배발생 캘러스 형성률이 적합한 것으로 나타났다. 2.
- 배 양 3주 후부터 1 μM 2, 4-D 처리구에서 부분적으로 점액성의 배발생 캘러스가 형성되기 시작했다. 배양 4주 후에 배발생 캘러스의 형성률은 1 2, 4-D 첨가 배지에서 높은 빈도로 나타났다. 여러 형태의 즉, 노란색과 흰색을 띠는 점액질의 매끈한 배발생 캘러스가 약 80% 형성되었다.
- 5μM의 농도와 광조사 조건으로 암, 약광 (3000 lux), 강광 (6000 lux)에서 배발생 캘러스 형성률을 조사하였다. 배양 4주 후에 배발생 캘러스의 형성률을 조사한 결과 강광 0.5 μM 2, 4-D 첨가 배지에서 가장 높은 빈도로 배발생 캘러스가 유도되었으며, 형성률은 98%의 빈도를 나타냈다 (Table2). 그러나 1 |UM과 1.
- 5 μM 2, 4-D 첨가 배지에서는 60〜80%와 50 〜60%로 전반적으로 낮은 빈도의 배발생 캘러스 유도율을 나타냈다. 본 연구 결과는 2, 4-D 첨가배지에서 6주간 배 양으로 90% 정도의 유도율을 보인 화이트 스타 혹은 율미 (Liuet al. 1989; Mui et al. 1994)에 비교하여 단기간에 고빈도의 배발생 캘러스가 형성되었다. 전체적인 광조사의 영향은 낮은 농도 즉 0.
- 비교하였다. 암, 광조건 모두 1 〜10 μM 2, 4-D 처리구 혹은 와의 조합 처리군에서 배발생 캘러스의 형성률이 높게 나타났다. 광조건의 경우 캘러스의 형성과 배발생 캘러스의 형성이 암조건에 비교하여 일반적으로 2주 빠르게 출현하였다.
- 여러 형태의 즉, 노란색과 흰색을 띠는 점액질의 매끈한 배발생 캘러스가 약 80% 형성되었다. 이 결과와는 대조적으로 12D , 4- 와 조합 처 리구에서 5〜10%의 낮은 빈도의배발생 캘러스 형성률을 나타냈으며, 나머지 부위는 대부 분비 배발생 캘러스로 유도되었다. 결과에서 보는바와 같이 배발생 캘러스의 형성률은 저농도의 BA 첨가군에 비해 저농도 2.
- 1994)에 비교하여 단기간에 고빈도의 배발생 캘러스가 형성되었다. 전체적인 광조사의 영향은 낮은 농도 즉 0.5 μM의 2, 4-D 첨가 조건에서 강광이 효과적이었으나, 1 μM 혹은 1.5 μM 농도로 상승함에 따라 광조사의 영향이 적어지는 것으로 나타났다. 15 /M 2, 4-D 강광 조건에서는 배발생 캘러스 형성률이 낮은 반면, 비배발생 캘러스가 함께 형성되는 툭징을 보였다.
후속연구
- 1995). 따라서, 보다 효과적이고 일반화될 수 있는 조직배양방법의 개발과 이를 이용한 형질전환 등의 기초적 연구가 요구된다. 툭히자색고구마의 경우는 Kwon 등 (2002)에 의해 정단분열조직배양이 보고되었을 뿐 극히 미비한 상태이다.
- 기내 소식믈체 (초장 약7〜8 cm)를 포트에 이식하여 정상적으로 생육하였다. 자색고구마의 육종과 세포배양을 통한 안토시아닌 생합성 등을 위해서 적합한 배양 기술의 확립이 요구되는 시점에서 새로이 개발된 자색고구마의 재분화 방법은 형질전환 등에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 전망된다.
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