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문제 정의
- 본 실험은 시클라멘 우량종묘의 대량생산을 위하여 기내 발아한 괴경, 엽병, 자엽 등을 배양하여 shoot 발생에 요구되는 생장조절제의 효과 및 shoot로부터 뿌리발생을 조사하였다.
제안 방법
- 2 ~ 1 mg/L를 조합하여 사용하였으며, 20℃의 생장상에서 암배양하여 배양 60일 후에 캘러스 및 shoot분화율을 조사하였고 shoot분화 후에는 2,000 Lux의 형광등 하에서 명배양하였다. Shoot에서 뿌리를 발생시키기 위하여 NAA와 IBA를 조합한 MS배지에 배양 후 뿌리발생률을 조사하였다.
- 치상하였다. 배지는 MS기본배지 (Murashige and Skoog 1962)에 auxin류로 FA (4-fluorophenoxyacetic acid), 2,4-D, NAA, cytokinin류로 BA, kinetin, TDZ (Thidiazuron)를 각각 0.5 및 1.0 mg/L첨가하였고, NAA와 BA혼용처리는 0.2 ~ 1 mg/L를 조합하여 사용하였으며, 20℃의 생장상에서 암배양하여 배양 60일 후에 캘러스 및 shoot분화율을 조사하였고 shoot분화 후에는 2,000 Lux의 형광등 하에서 명배양하였다. Shoot에서 뿌리를 발생시키기 위하여 NAA와 IBA를 조합한 MS배지에 배양 후 뿌리발생률을 조사하였다.
- 절편부위별로 배양한 결과 대부분 shoot 분화는 이루어졌지만 뿌리발생 없이 분화된 shoot로부터 주로 다아체로 증식되는 경향이었는데, 이들 절편에서 분화된 shoot로부터 완전한 식물체를 얻기 위하여 분화된 shoot를 분할하여 NAA와 IBA의 단용처리에서 계대배양하였다 (Figure 5).
대상 데이터
- 시크라멘 F1 품종 "Bonfire Red"를 무균발아시킨 약 40일 후 유식물체의 괴경, 자엽, 엽병의 절편을 배양재료로 이용하였으며, 괴경은 2 mm의 두께로 1개의 괴경에서 3개의 절편을 취하였고, 자엽은 5×5 mm, 엽병은 5 mm의 크기로 잘라서 치상하였다. 배지는 MS기본배지 (Murashige and Skoog 1962)에 auxin류로 FA (4-fluorophenoxyacetic acid), 2,4-D, NAA, cytokinin류로 BA, kinetin, TDZ (Thidiazuron)를 각각 0.
성능/효과
- 3종의 절편체에서 캘러스와 shoot가 같이 분화되었는데 (Figure 3) 괴경절편의 경우 캘러스 발생률보다는 shoot 분화율이 높은 경향으로 배양 30일경부터 대부분 절편체에서 반응을 보였다. NAA와 BA가 0.
- NAA처리구 역시 뿌리발생에 효과적이었는데 IBA보다 약간 저조한 편으로 IBA가 계대배양 15일경부터 뿌리 발생이 이루어진 것에 비해 배양 20일경부터 뿌리가 발생되기 시작하였고 발육속도도 비교적 느린 편이었는데 배양 30일 후의 조사에서 뿌리길이가 IBA처리구보다 짧았다.
- 4-D 처리구는 배양 30일 후에 절편의 절단면에서 뿌리발생이 먼저 유도되었고 배양 6주일 후부터는 shoot가 분화되기 시작하였는데 치상 절편의 모두에서 다아체로 분화되어 양호한 결과를 보였다. NAA처리구에서는 배양 90일 후까지 캘러스 발생은 관찰되지 않았으며 배양 20일경부터 절편체의 절단면에서 직접 shoot가 발생된 후 배양 90일 후에는 일부의 치상절편에서 1개의 절편당 10개 이상의 다아체 분화가 관찰되었고 분화된 shoot는 절편체에서 생장하기 시작하여 괴경절편에서 shoot 분화는 2, 4-D와 NAA가 적당하였다.
- BA와 kinetin처리구에서는 모든 절편체에서 캘러스 발생 없이 절편체의 절단면에서 직접 shoot가 분화되었다. 그러나 TDZ의 경우 100%의 캘러스 발생률을 보였고 0.5 mg/L 처리 구의 경우 73.3%, 1.0 mg/L 처리구의 경우 100%의 shoot 발생률을 보여 1.0 mg/L TDZ처리구에서 가장 양호한 결과를 보였다.
- 모든 절편체에서 BA와 kinetin처리구는 캘러스 발생 없이 shoot분화를 보였고, TDZ처리구에서는 캘러스 발생과 함께 shoot가 분화되어 3종의 배양절편체가 비슷한 경향을 보였다(Figure 2).
- 0 mg/L TDZ처리구에서 괴경의 경우 100% shoot 분화율을 보였고, 자엽절편 역시 배양 40일 경부터 다수의 shoot가 발생되어 양호하였으나 다른 BA나 kinetine 그다지 효과적이지 못하였다. 반면에 NAA 와 BA혼용처리는 0.5 mg/L NAA와 0.5 mg/L BA 혼용첨가 배지에서 괴경, 자엽, 엽병절편 모두 shoot 분화가 양호하였다. 그러나 시클라멘의 조직배양에는 많은 어려움이 뒤따르는데 무균발아한 재료를 이용하지 않을 경우에는 배양재료의 높은 오염률과 낮은 재분화율, 생장점 없이 single leaflet만 분화되는 것 등이 문제점이라고 하였다 (FersingetaL 1982; Geier 1977).
- 본 실험에서도 IBA와 NAA가 단용처리된 배지에서 절편 체로부터 shoot를 분할하여 계대배양한 결과 계대배양 15일경부터 0.5 mg/L IBA처리구에서 뿌리가 발생되기 시작하여, 배양 30일 후에는 pot이식이 가능할 정도로 뿌리가 발생 되어 완전한 재분화식물체를 획득할 수가 있었다.
- 본 실험에서도 절편부위별로 배양한 결과 괴경절편이 가장 양호하였는데 auxin류 단용처리의 경우 괴경절편은 NAA 처리에서 가장 양호하여, 1개의 절편체에서 10개 이상의 다아체가 분화되었고 자엽이나 엽병절편은 캘러스만 유도되었으며 대부분 치상당시의 상태로 절편부위별 반응에 많은 차이를 보였고 생장조절제에 따라서도 상당한 차이가 인정되었다. 즉 cytokinin류 단용처리에서도 1.
- 엽병 절편 모두 shoot 분화가 양호하였으며, auxin류와 cytokinin 류 단용처리보다 NAA와 BA혼용처리가 모든 절편에서 양호한 결과를 보였다. 뿌리발생을 유도하기 위해 NAA와 IBA 단용처리에 shoot를 배양한 결과 배양 15일경부터 0.5 mg/L IBA처리구에서 뿌리가 발생되기 시작하여 배양 30일 후에는 pot이식이 가능할 정도로 뿌리가 발생되어 가장 양호한 결과를 보였다.
- 5 mg/L BA 혼용첨가된 배지에서 괴경, 자엽. 엽병 절편 모두 shoot 분화가 양호하였으며, auxin류와 cytokinin 류 단용처리보다 NAA와 BA혼용처리가 모든 절편에서 양호한 결과를 보였다. 뿌리발생을 유도하기 위해 NAA와 IBA 단용처리에 shoot를 배양한 결과 배양 15일경부터 0.
- 엽병절편은 0.2, 0.5 mg/L NAA와 BA가 혼용첨가된 경우 캘러스 발생률이 높은 편이었으며 특히 0.5 mg/L NAA와 0.5 mg/L BA 혼용처리구에서 shoot 분화율이 86.7%를 보여 가장 양호하였고, l.0mg/LNAA와 BA의 혼용 처리 구에서는 캘러스 발생 및 shoot 분화가 다른 처리구에 비해 약간 낮았다. 그러나 엽병조직 역시 auxin류와 cytokinin류에서 보인 반응에 비하면 NAA와 BA의 혼용처리가 효과적이었다.
- 엽병절편은 FA와 2,4-D처리구에서 캘러스 발생률은 거의 80%이상으로 높았으나 배양 90일까지 단 1개의 shoot 분화도 관찰되지 않았고, NAA처리구는 캘러스도 발생되지 않고 치상 당시의 상태로서 shoot분화율이 낮은 것은 자엽과 비슷한 결과를 보였다.
- 이와 같이 발근된 shoot의 생장상태는 발근되지 않은 shoot에 비해 신초의 발생 및 생장이 빨랐고 shoot를 발근배지에 계대배양한 약 30~40일 후에는 폿트에 이식이 가능할 정도로 생장되었다. 완전히 뿌리발생이 이루어진 후 재분화된 식물체들은 20℃의 순화실에서 약 10일간 순화과정을 거친 후 폿트에 정식하였다.
- 자엽절편도 TDZ처리구에서 100% 캘러스 발생률을 보였는데 캘러스가 약간 유도된 상태에서 shoot 분화가 동시에 이루어졌고 shoot 발생률은 괴경절편보다는 약간 낮았다. 그러나 TDZ처리구에서 발생하는 shoot는 1개체의 자엽 절편 체에서 절단면뿐만 아니라 엽육조직에서 배양 40일경부터 다수의 shoot가 발생되어 비교적 양호하였다.
- 자엽절편의 경우 0.5, 1.0 mg/L FA, 2,4-D, NAA 처리구의 경우 몇 개의 절편체에서 약간의 캘러스가 유도되었으나 크게 증식되지는 않았고 0.5 mg/L FA처리구에서 유도된 캘러스로부터 약간의 shoot발생이 관찰되었으나 1개의 절편에서 1 ~2개 분화되는 정도였고, 2,4-D와 NAA처리구 역시 배양 90일까지 약간의 캘러스만 유도되었고 대부분의 절편은 shoot 발생에 효과적이지 못하였다.
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