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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 가금티프스균인 Salmonella gal- limiim의 생육을 강력히 억제하는 길 항균 주를 토종닭의 장으로부터 분리, 선발하여 이 균주들의 배양 특성, 동정, 길항균의 길항물질을 추정함으로써 가금티브스 방제용 생균제 개발의 기초 자료로 삼고자 하였다.
- 가금티프스는 가금류에 Salmonella gallinariim이 원인균이 되어 발병하는 양계산업에 막대한 지장을 주는 질병이다. 가금티프스를 억제하기 위한 생균제 개발을 위한 목적으로써 가금티프스 원언균언 Salmonella gallinariim의 생육을 저해시킬 수 있는 길 항균 주를 토종닭의 내장으로부터 분리하여 생육 특성과 길항물질 생산성을 조사하고, 이 균 주를 분류학적으로 동정하였다. 분리된 길 항균 주는 Bacillus amyldiqiciens와 98% 상동성을 나타내어 최종적으로 Bacillus amyloliquefaciens Y3로 명명하였다.
제안 방법
- 경북 구미 지역에서 자연 방사하여 사육하는 토종닭의 소장과' 대장을 분리 원으로 하였다. 소장과 대장에서 각각의 적출물 시료 1g을 멸균된 생리식염수 10ml에 넣어 균질하게 혼탁 시켜, 1까지 희석하였으며, 이들을 LB 배^지(tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%, agar1.5%)에 도말하여 37℃에서 1일간 배양하여 생성되는 colony 를 순수 분리하였다. 그 후 가금티프스 원인균인 Salmonella gallinariim을 LB 액체 배지에 전 배양한 배양액 0.
- 5%)에 도말하여 37℃에서 1일간 배양하여 생성되는 colony 를 순수 분리하였다. 그 후 가금티프스 원인균인 Salmonella gallinariim을 LB 액체 배지에 전 배양한 배양액 0.1 ml를 혈 청 평 판배 지 (Tryptic soy broth 0.3%, Agar 1.5%, 혈청 5%)에 유리 봉으로 도말하고 혈청배지상에 분리 균을 획 선 접종하여 2일간 37℃에서 배양한 후 가금티프스 원인균인 Salmonella의 생육을 억제하는 clear zone을 형 성 하는 길항균을 선발하였다.
- Davis minimal medium[K2HPO4 0.7%, KH2PO4 0.2%, Glucose 0.5%, (NHeSCH 0.1%, MgSO4 - 7H2O 0.01%, glucose 0.1%]에 이ucose를 제외시키고 10종의 탄소 원을 1.0%씩 첨가하여 37C에서 2일간 균을 배양한 후, 그 원심분리 하여, 상등액을 균체 량 측정법(cell mass test)에 따라 길항 력을 조사하였다. 또한 결정된 최적의 탄소 원에 대하여 0.
- 0%씩 첨가하여 37C에서 2일간 균을 배양한 후, 그 원심분리 하여, 상등액을 균체 량 측정법(cell mass test)에 따라 길항 력을 조사하였다. 또한 결정된 최적의 탄소 원에 대하여 0.1 ~1.0%까지 농도별로 길 항력을 확인하였다.
- 질소원 경우 Davis minimal medium에 질소원인 ammonium sulfate를 제외시키고 앞의 결과에서 선택된 탄소 원을 최적 농도로 넣어 준 후 10종의 무기 및 유기 질소원을 0.5%씩 첨가하고 길항물질 생산에 미치는 영향을 조사 후 0.1 ~0.5% 농도에서 길 항력을 조사하였다.
- 선 발길 항균의 담즙산에 대한 안정성을 알아보기 위하여 LB 평판배지에 전 배양시킨 선발 균주를 0.5%까지 단계별로 담즙산이 첨가된 LB broth에 접종한 후 2일간 37℃에서 배양하였다. LB broth에 가금티프스 원인균 Salmonella gal- limwum을 50ul씩 접종한 후 여과한 배 양액 1ml씩을 첨가하여 1일간 37℃에서 배양 후 길 항력을 조사하였다.
- 5%까지 단계별로 담즙산이 첨가된 LB broth에 접종한 후 2일간 37℃에서 배양하였다. LB broth에 가금티프스 원인균 Salmonella gal- limwum을 50ul씩 접종한 후 여과한 배 양액 1ml씩을 첨가하여 1일간 37℃에서 배양 후 길 항력을 조사하였다.
- 선발 길항균의 pH에 대한 생육 도와 안정성을 알아보기 위하여 LB 평판배지에 전 배양시킨 선발 균주를 pH 3.0~10.0으로 조정된 LB broth에 접종하고 2일간 37℃에서 배양된 상등액을 이용하여 길 항력을 조사하였다. 길항물질 생산에 대한 온도의 영향을 조사하기 위해 20℃, 25℃, 30 ℃, 37℃, 45℃, 50℃에서 선발 균주를 2일간 배양 후 길항 력을 조사하였다.
- 0으로 조정된 LB broth에 접종하고 2일간 37℃에서 배양된 상등액을 이용하여 길 항력을 조사하였다. 길항물질 생산에 대한 온도의 영향을 조사하기 위해 20℃, 25℃, 30 ℃, 37℃, 45℃, 50℃에서 선발 균주를 2일간 배양 후 길항 력을 조사하였다.
- 배양 상등액의 길항물질의 특성을 알아보기 위하여 LB 액체배지 1 L에 선발 균주를 배양한 후 8000 rpm, 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액으로부터 고분자, 저분자를 분리하기 위하여 Amicon centriprep T10K를 이용, 3* 000에서 45분간 원심분리하였고, 내열성을 알아보기 위하여 8(TC에서 20분간 중탕으로 가열하였다.
- 배양 상등액의 길항물질의 특성을 알아보기 위하여 LB 액체배지 1 L에 선발 균주를 배양한 후 8000 rpm, 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액으로부터 고분자, 저분자를 분리하기 위하여 Amicon centriprep T10K를 이용, 3* 000에서 45분간 원심분리하였고, 내열성을 알아보기 위하여 8(TC에서 20분간 중탕으로 가열하였다.
- 선별 균주가 생산하는 길항물질을 n-butanol로 추출하여 조정제 후 50℃에서 감압 농축하고 증류수, methanol에 각각 용해하여 길항물질의 활성을 여지 디스크 법(filter paper disk test)으로 조사하였다.
- 경북 구미 지역에서 자연 방사하여 사육하는 토종닭의 소장과 대장을 길항균의 분리 원으로 하여 LB 배지에 순수 분리한 결과 육안으로 관찰하여 형태적으로 상이한 23종을 분리하였다. 이들을 대상으로 가금 티 프스 원인균 Salmonella gnllinarum에 대한 길항균의 선발을 발육저지측정법을 이용해서 생육을 억제하여 clear zone을 형 성하는 억제 균주를 분리, 선발하였다(Fig.
- 경북 구미 지역에서 자연 방사하여 사육하는 토종닭의 소장과 대장을 길항균의 분리 원으로 하여 LB 배지에 순수 분리한 결과 육안으로 관찰하여 형태적으로 상이한 23종을 분리하였다. 이들을 대상으로 가금 티 프스 원인균 Salmonella gnllinarum에 대한 길항균의 선발을 발육저지측정법을 이용해서 생육을 억제하여 clear zone을 형 성하는 억제 균주를 분리, 선발하였다(Fig. 1).
이론/모형
- 선발 균주 strain Y3의 분류학적 동정을 위해 Bergey's manual of systematic bacteriology[4]의 세균 분류 동정 지침서의 시험 항목을 기준으로 하여 각 항목을 실험하였고, 최종적으로 Biolog사의 동정 시스템 (MicroLogW 4.0)을 사용하여 검정 실험 하였다. 각 실험에 사용한 배지 조성과 실험 방법은 Bergey's manual of systematic bacteriology[4]■§-참조하였다.
- 0)을 사용하여 검정 실험 하였다. 각 실험에 사용한 배지 조성과 실험 방법은 Bergey's manual of systematic bacteriology[4]■§-참조하였다.
성능/효과
- 와 Biology[4]. 의 동정 시스템(MicroLo/M4.0)을 이용하여 최종 동정하여 본 결과 Bacillus amylolicjuefaciensY와 98%의 상동성이 확인되었으므로 본 연구에 사용된 strain Y3를 최종적으로 Bacillus amylolicjuefaciensY 3 균주로 명명하였다(Table 1).
- 배지에 사용되는 영양원에 따른 길항물질 생산의 영향을 조사하여 본 결과 Table 2에서 볼 수 있는 바와 같이 탄 소원은 균 생장이나 길항물질 생산성에 있어서 가장 우수한 maltose가 최적이었다. 또한 maltose 농도별로 길항물 질 생산성을 조사한 결과로는 0.
- 배지에 사용되는 영양원에 따른 길항물질 생산의 영향을 조사하여 본 결과 Table 2에서 볼 수 있는 바와 같이 탄 소원은 균 생장이나 길항물질 생산성에 있어서 가장 우수한 maltose가 최적이었다. 또한 maltose 농도별로 길항물 질 생산성을 조사한 결과로는 0.3% 첨가 시에 그 생산성이 가장 우수하였다(Fig. 2).
- 질소원에 대한 길항물질 생산성을 조사하여 본 결과 Table 3에서 볼 수 있는 것 같이 길항물질 생산성에 있어서 다양한 질소원들 중 NH(1가 가장 높은 길항물질 생산성을 보였으며 NH4CI을 0.2% 첨가한 배지에서 길항물질 생산성이 가장 우수하였다(Fig. 3).
- 0.5%까지 단계별로 담즙산이 첨가된 LB broth에 접종한 후 2일간 37C에서 배양한 후 길항균 주의 성장도를 spec- trophotometer(Hitach U-2000)을 이용하여 600nm에서 균 탁도를 측정한 결과 Fig. 4에서 보는 바와 같이 담즙의 농도가 올라갈수록 균 성장 및 길 항력이 감소하는 것을 알 수가 있었다. 그러나 0.
- 배양 pH에 따른 길항세균의 균 성장도와 길항물질 생산성은 pH 3에서 pH 10까지 조사한 결과 Table 9에서 볼 수 있는 것과 같이 균 증식 및 생산성은 pH 7에서 가장 좋았다. 또한 pH 5~pH 9까지 양호한 균의 증식 및 생산성을 보였다(Table 5).
- 회수한 상등액을 Amicon centriprep T10K를 이용하여 M.W, 10, 000을 기준으로 고분자, 저분자를 분리한 후 80℃에서 20분간 중탕으로 열처리하여 길 항력을 측정하여 본 결과 Table 6에서 보는 바와 같이 내열성이 있는 저분 자성 길항물질임을 확인할 수가 있었다. 또한 선별 균주가 생산하는 길항물질을 iibutanol로 추출하여 조정제 후 50℃에서 감압 농축하고 증류수, methanol에 각각 용해하여 길항 물질의 활성을 여지 디스크 법으로 조사하여 저분자의 용매 추출성 길항물질임을 확인하였다(Fig.
- W, 10, 000을 기준으로 고분자, 저분자를 분리한 후 80℃에서 20분간 중탕으로 열처리하여 길 항력을 측정하여 본 결과 Table 6에서 보는 바와 같이 내열성이 있는 저분 자성 길항물질임을 확인할 수가 있었다. 또한 선별 균주가 생산하는 길항물질을 iibutanol로 추출하여 조정제 후 50℃에서 감압 농축하고 증류수, methanol에 각각 용해하여 길항 물질의 활성을 여지 디스크 법으로 조사하여 저분자의 용매 추출성 길항물질임을 확인하였다(Fig. 5).
- 가금티프스를 억제하기 위한 생균제 개발을 위한 목적으로써 가금티프스 원언균언 Salmonella gallinariim의 생육을 저해시킬 수 있는 길 항균 주를 토종닭의 내장으로부터 분리하여 생육 특성과 길항물질 생산성을 조사하고, 이 균 주를 분류학적으로 동정하였다. 분리된 길 항균 주는 Bacillus amyldiqiciens와 98% 상동성을 나타내어 최종적으로 Bacillus amyloliquefaciens Y3로 명명하였다. 0.
- 분리된 길 항균 주는 Bacillus amyldiqiciens와 98% 상동성을 나타내어 최종적으로 Bacillus amyloliquefaciens Y3로 명명하였다. 0.3% maltose, 0.2% NH’Cl, 37℃, pH 7에서 균 생육 및 길항물질의 생산 능이 가장 우수하였으나 장내 담즙에 대한 내성은 크게 나쁘지 않을 것으로 확인되어졌다. 생산된 길항물질을 추정하여 본 결과 분자량이 10, 000보다 작은 저분자 물질이었으며 80 ℃에서 20분간 열처리한 후에도 80%의 활성을 유지하는 내열성 물질임을 확인할 수 있었다.
- 2% NH’Cl, 37℃, pH 7에서 균 생육 및 길항물질의 생산 능이 가장 우수하였으나 장내 담즙에 대한 내성은 크게 나쁘지 않을 것으로 확인되어졌다. 생산된 길항물질을 추정하여 본 결과 분자량이 10, 000보다 작은 저분자 물질이었으며 80 ℃에서 20분간 열처리한 후에도 80%의 활성을 유지하는 내열성 물질임을 확인할 수 있었다. 향후 선발되어진 Bacillus amyloliquefaciens Y3가 생산해내는 길항물질에 대한 연구와 개량을 통하고 장내 정착성 실험을 거쳐 우수 균주로 확인되면 양계산업에 사용될 우수한 생균제로 개발이 가능할 것이라 생각된다.
- 배양온도는 균 성장과 길 항력 모두 37℃가 가장 좋은 것으로 나타났다(Table 4). 또한 20~45℃까지 넓게 균 성장 및 길항물질 생산성이 양호하였다.
후속연구
- 생산된 길항물질을 추정하여 본 결과 분자량이 10, 000보다 작은 저분자 물질이었으며 80 ℃에서 20분간 열처리한 후에도 80%의 활성을 유지하는 내열성 물질임을 확인할 수 있었다. 향후 선발되어진 Bacillus amyloliquefaciens Y3가 생산해내는 길항물질에 대한 연구와 개량을 통하고 장내 정착성 실험을 거쳐 우수 균주로 확인되면 양계산업에 사용될 우수한 생균제로 개발이 가능할 것이라 생각된다.
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