[논문]Salmonella Enteritidis와 Salmonella Gallinarum의 세균막 스트레스를 인식하는 spy-gfp 오페론 융합

강보경; 방일수

doi:10.22424/jmsb.2018.36.4.208

Salmonella Enteritidis와 Salmonella Gallinarum의 세균막 스트레스를 인식하는 spy-gfp 오페론 융합
The spy-gfp Operon Fusion in Salmonella Enteritidis and Salmonella Gallinarum Senses the Envelope Stress 원문보기

Journal of milk science and biotechnology = 한국유가공학회지, v.36 no.4, 2018년, pp.208 - 219

강보경 (조선대학교 치과대학 구강미생물학 교실) , 방일수 (조선대학교 치과대학 구강미생물학 교실)

초록
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낙농업 및 유가공 제품의 생산과 유통에서 살모넬라 감염에 의한 살모넬라증의 발생은 빈번하며, 이 세균의 항미생물 제제에 대한 내성 증가 현상 또한 지속되고 있어 새로운 항미생물 제제의 수요는 감소하지 않는다. 세균막의 훼손은 세균 생존을 쉽게 위협할 수 있기 때문에 개발되는 항미생물 제제들은 주로 세균의 막을 표적으로 삼지만, 개발되는 제제들이 실제로 세균막의 훼손을 초래하는지 구별하는 것은 많은 노력과 비용을 수반한다. 본 연구에서는 E. coli 세포막 스트레스에 의해 발현이 유도되고, 세균막 외부공간에서만 위치하며, 그 구조상 많은 단백질의 구조 안정화에 기여할 것으로 예상되는 chaperone 단백질 Spy(spheroplast protein Y)의 유전자에 상응하는 살모넬라 spy 유전자에 gfp(green fluorescence protein) 오페론 융합체를 제조하여, 이 융합체가 Salmonella enterica의 두 혈청형 Enteritidis와 Gallinarum의 세포막 스트레스를 인지하여 GFP 발현량이 크게 증가하는 것을 확인하였다. 또한 세균막 스트레스 신호를 특이적으로 인지하는 이인자 신호전달 체계(two component signal transduction system)인 Bae와 Cpx들이 두 살모넬라 혈청형의 spy 유전자 전사 유도에 필수적임을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 사용한 spy-gfp 오페론 융합체는 S. Enteritidis와 S. Gallinarum의 세포막 훼손을 특이적이고 신속하게 인식하는 biosensor로서 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Emergence of drug resistant strains of Salmonella enterica threatens milk processing and related dairy industries, thereby increasing the need for development of new anti-bacterials. Developments of antibacterial drugs are largely aimed to target the bacterial envelope, but screening their efficacy on bacterial envelope is laborious. This study presents a potential biosensor for envelope-specific stress in which a gfp reporter gene fused to spy gene encoding a periplasmic chaperone protein Spy (spheroplast protein y) that can sense envelope stress signals transduced by two major two-component signal transduction systems BaeSR and CpxAR in Salmonella enterica serovars Enteritidis and S. Gallinarum. Using spy-gfp operon fusions in S. Enterititis and S. Gallinarum, we found that spy transcription in both serovars was greatly induced when Salmonella cells were forming the spheroplast and were treated with ethanol or a membrane-disrupting antibiotic polymyxin B. These envelope stress-specific inductions of spy transcription were abrogated in mutant Salmonella lacking either BaeR or CpxR. Results illustrate that induction of Spy expression can be efficiently triggered by two-component signal transduction systems sensing envelope stress conditions, and thereby suggest that monitoring the spy transcription by spy-gfp operon fusions would be helpful to determine if developing antimicrobials can damage envelopes of S. Enteritidis and S. Gallinarum.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 낙농업 및 유가공 제품생산과 유통에서 주요한 살모넬라 감염원으로 작용하는 혈청형들 중 S. Enteritidis 과 S. Gallinarum의 Spy 발현과정중 spy 유전자 전사의 유도에 있어, 막 스트레스의 필요성 및 유전자 전사 유도에 참여하는 조절 단백질의 필요성을 처음으로 확인하였다. spy 유전자 전사의 유도를 확인하기 위해 제조한 spy-gfp 융합체들 중 promoter 부위만을 포함한 것은 promoter뿐 아니 라, spy 구조유전자 전체를 포함한 것에 비해서 대수기와 정지기에서 모두 발현량이 크게 나타나는 것으로 나타났다(Fig 1).
, 2017). 본 연구에서는 살모넬라의 spy 유전자 프로모터 부위와 전체 유전자에 gfp(green fluorescence protein) 리포터 유전자가 각각 융합된 플라스미드를 이용하여, S. Enteritidis와 S. Gallinarum내 spy 유전자 전사의 세균 막 스트레스 인식 가능성과, BaeR과 CpxR의 조절 관계가 이 두 혈청형에서도 보존되는지 확인하고자 하였다.
하지만 개발되는 항미생물 제제가 세균 막 및 막 외부 주변 공간에 효과적으로 작용하는지를 검색하는 것은 여전히 많은 노력과 비용을 수반한다(Wolf and Mascher, 2016). 본 연구에서는 인간과 동물 모두에게 중요한 인수공통 감염성 혈청형인 Enteritidis와 가금류의 주요 병원성 혈청형인 Gallinarum의 세균 막 훼손을 인지할 수 있는 바이오센서(biosensor)로서 spy유전자 전사의 활용가능성을 조사하였으며, 두 혈청형 모두에서 효용성을 확인하였다.
이적 신호를 인식할 수 있는 바이오센서의 목적으로써 spy-gfp 융합 플라스미드를 활용하고자 하였다. 때문에 spy 유전자 전체를 포함하는 gfp 융합체의 막 스트레스 반응 능력의 발견은 의미가 크다고 볼수 있다.

가설 설정

2. Polymyxin B는 S. Enteritidis와 S. Gallinarum 내의 spy 전사를 유도한다.

제안 방법

4이 될 때까지 배양한 후, 세포를 4% 에탄올(ethanol)과 각 균주에서 가장 높은 spy-gfp 유도를 보여주는 농도로 polymyxin B를 처리 후 1시간 추가로 더 배양하였다. 4% 에탄올이나 polymyxin B를 처리하기 전 배양액과 처리한 후의 배양액을 원심분리하여 PBS(phosphate buffer saline, pH 7.0)로 2번 세척 후 Black 96-well plate(SPL, Korea)에서 각 세균액(OD 600nm =1.0)의 형광 강도를 DTX 880 microplate reader(485 nm excitation과 535 nm emission; Beckmna Coulter, USA)로 측정하였다.
E. coli 와 S. Typhimurium의 spy 유전자 전사 유도는 이인자 신호전달 체계인 CpxRA와 BaeSR에 의해서 조절이 되는 것으로 알려졌다(Bury-Mone et al., 2009; Jeong et al., 2017), S. Enteritidis와 S. Gallinarum에서도 이들 체계가 관련되는지 확인하였다. 두 혈청형 모두 cpxR 과 baeR 이 결손된 돌연변이 균주에 polymyxin B를 처리했을 때 대조군(WT)에 비해서 spy-gfp 발현이 거의 되지 않는 것을 확인 하였다(Fig.
LB 영양배지에서 하룻밤 배양한 spy-gfp 오페론 융합 플라스미드를 보유하는 S. Enteritidis와 S. Gallinarum 균주를 PBS(phosphate buffer saline, pH 7.0)에 O.D 600nm =1.0 이 되도록 희석시켰다. 이들 균주 현탁액을 8 μg/mL, 6 μg/mL, 4 μg/mL, 2 μg/mL 농도의 polymyxin B가 포함되거나 포함 되지 않은 LB 영양배지에 O.
S. Enteritidis와 S. Gallinarum균주들이 spheroplast를 형성할 때 Spy의 발현이 유도되는지 확인하기위해 spy-gfp 오페론 융합 플라스미드를 보유하는 S. Enteritidis와 S. Gallinarum을 이용하여 spheroplast 형성시 GFP의 발현을 확인하였다. Spheroplast 형성 과정중, sucrose와 lysozyme 처리까지 하였을 때는 spheroplast가 뚜렷하게 형성되지 않았고, sucrose, lysozyme, EDTA를 모두 처리한 경우 spheroplast가 형성되었으며, 이때에 GFP 발현이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
Sac I 과 BamH I 제한효소 처리를 한 pFPV25 벡터와 함께 정제키트(GeneAll)로 정제 후 T4 DNA ligase(NEB)를 이용하여 결합시켜 E. coli DH5α에 형질전환시켰다.
Spherolast가 형성되는 각 과정은 일부 세균을 덜어내 1% agarose 로 코팅한 후 Axioscope A1(Carl zeiss, Germany) 현미경으로 관찰하고 현미경에 연결된 CCD 카메라로 촬영하였다.
Typhimurium 14028s 염색체이고, 전체 살모넬라 게놈에서 spy 프로모터 부분에 해당하는 유전자를 증폭시키기 위해 제한효소 자리 염기를 붙인 spy linker SacI Forward-2 프라이머와 spy linker BamHI Reverse-2 프라이머를 사용하였다 (Table 1). i-pfu DNA 중합효소(iNtRON Biotechnology Inc, Korea)를 이용해 PCR 증폭을 시켰다. 이 PCR 산물은 spy 유전자 개시코돈의 앞쪽 326 bp와 뒤쪽 34 bp를 포함한다.
Gallinarum에서도 마찬가지인 것으로 나타났으며, 이것은 이 살모넬라 형청형들 사이에 유사한 spy 유전자 전사 체계를 가지고 있음을 보여준다. spy-gfp fusion 2가 포함된 균주는 대수기와 정지기에서 모두 큰 발현량을 나타내기 때문에, 이후 세포막 스트레스에 대한 spy 유전자 전사의 유도를 관찰하기가 어려웠으며, spy-gfp fusion 1을 사용하여 이 후 연구에 사용하였다.
spy-gfp 오페론 융합 플라스미드를 만들기 위해 먼저 PCR 증폭을 통해 원하는 유전자 산물을 얻었다. PCR 증폭에 사용된 주형은 S.
spy-gfp 융합 플라스미드를 보유하는 S. Enteritidis와 S. Gallinarum을 LB 영양배지에서 밤새 배양한 다음, 새로운 LB 영양배지에서 1:1,000으로 희석해 접종하여 37℃, 220 rpm의 진탕 배양기에서 대수 기인 O.D 600nm =0.4이 될 때까지 배양한 후, 세포를 4% 에탄올(ethanol)과 각 균주에서 가장 높은 spy-gfp 유도를 보여주는 농도로 polymyxin B를 처리 후 1시간 추가로 더 배양하였다. 4% 에탄올이나 polymyxin B를 처리하기 전 배양액과 처리한 후의 배양액을 원심분리하여 PBS(phosphate buffer saline, pH 7.
RpoE 는 세포질막에 위치하는 RseA 단백질에 붙잡혀 있는 상태로 존재하다가, 세포질막 외부의 변성된 단백질들의 증가에 의해 DegS와 RseP 두 세포질막 단백분해효소에 의해 RseA 가 분해됨으로써 세포질내로 이동하여 표적 유전자들의 전사를 활성화시킨다. 본 연구에서는 cpxR 과 baeR 결손 돌연변이는 성공적으로 제조하였으나, rpoE 돌연변이를 제조하지 못하였다. 하지만, S.
사용한 모든 균주는 모두 진탕 배양기(HST, Korea)에서 37℃, 220 rpm 조건으로 배양하여 사용하였으며, 항생제는 ampicillin(200 μg/mL, AP), chloramphenicol(20 μg/mL, CM)을 배지에 넣어 사용하였다.
살모넬라내에서 spy 유전자 전사를 조사하기 위한 spy-gfp 오페론 융합 플라스미드를 제작하였다. 기존에 제작된 spy-gfp fusion 1은 spy 유전자의 promoter 부위와 구조유전자 전체를 포함한 반면(Jeong et al.
세균막을 훼손하는 항생제인 polymyxin B에 대한 S. Enteritidis와 S. Gallinarum spy 유전자의 전사 유도를 측정하기 위해 spy-gfp 오페론 융합 플라스미드를 가진 S. Enteritidis와 S. Gallinarum 균주들의 polymyxin B에 대한 감수성을 먼저 측정하였다. LB 영양배지에서 polymyxin B 를 농도 별로 처리하여 성장 곡선을 관찰하였고, 그 결과 균주별로 성장이 지연되는 농도가 달랐다.
이들 균주 현탁액을 8 μg/mL, 6 μg/mL, 4 μg/mL, 2 μg/mL 농도의 polymyxin B가 포함되거나 포함 되지 않은 LB 영양배지에 O.D 600nm =0.02가 되도록 동일한 양으로 Microplate에 접종하였다.
02가 되도록 동일한 양으로 Microplate에 접종하였다. 접종된 Microplate는 Bioscreen C Microplate Reader(Oy Growth Curves Ab Ltd., Helsinki, Finland)에서 37℃의 온도에서 24시간 동안 교반하여 배양하였고, 30분 간격으로 O.D 600nm 값을 측정하였다.
이 PCR 산물은 spy 유전자 개시코돈의 앞쪽 326 bp와 뒤쪽 34 bp를 포함한다. 증폭된 PCR 산물은 PCR 정제키트(GeneAll Biotechnology Co. Ltd, Korea)를 사용하여 정제하였고, 프라이머 부분에 붙인 Sac I과 BamH I(NEB Inc, USA) 부위를 제한 효소를 이용하여 잘라냈다. Sac I 과 BamH I 제한효소 처리를 한 pFPV25 벡터와 함께 정제키트(GeneAll)로 정제 후 T4 DNA ligase(NEB)를 이용하여 결합시켜 E.
coli DH5α에 형질전환시켰다. 형질전환된 콜로니들의 플라스미드를 분리하고, 삽입유전자의 염기서열을 확인한 후 살모넬라 균주들에 형질전환하였다.

대상 데이터

spy-gfp 오페론 융합 플라스미드를 만들기 위해 먼저 PCR 증폭을 통해 원하는 유전자 산물을 얻었다. PCR 증폭에 사용된 주형은 S. Typhimurium 14028s 염색체이고, 전체 살모넬라 게놈에서 spy 프로모터 부분에 해당하는 유전자를 증폭시키기 위해 제한효소 자리 염기를 붙인 spy linker SacI Forward-2 프라이머와 spy linker BamHI Reverse-2 프라이머를 사용하였다 (Table 1). i-pfu DNA 중합효소(iNtRON Biotechnology Inc, Korea)를 이용해 PCR 증폭을 시켰다.
Gallinarum)을 사용하였고, 이 실험에 사용된 돌연변이 균주는 Table 1에 정리하였다. 균주 배양을 위한 배지로는 Luria-Bertani(LB) 영양배지를 사용하였다. 사용한 모든 균주는 모두 진탕 배양기(HST, Korea)에서 37℃, 220 rpm 조건으로 배양하여 사용하였으며, 항생제는 ampicillin(200 μg/mL, AP), chloramphenicol(20 μg/mL, CM)을 배지에 넣어 사용하였다.
사용한 모든 균주는 모두 진탕 배양기(HST, Korea)에서 37℃, 220 rpm 조건으로 배양하여 사용하였으며, 항생제는 ampicillin(200 μg/mL, AP), chloramphenicol(20 μg/mL, CM)을 배지에 넣어 사용하였다. 본 연구에 사용한 화학제들은 따로 표기하는 경우를 제외하곤 모두 Sigma-Aldrich사(Sigma-aldrich, Korea)로부터 구입하여 사용하였다.
본 연구에서는 인수공통 감염을 일으키는 Salmonella enterica serovar Enteritidis(S. Enteritidis)와 Salmonella enterica serovar Gallinarum(S. Gallinarum)을 사용하였고, 이 실험에 사용된 돌연변이 균주는 Table 1에 정리하였다. 균주 배양을 위한 배지로는 Luria-Bertani(LB) 영양배지를 사용하였다.

성능/효과

3. S. Enteritidis와 S. Gallinarum 의 spheroplast 형성시 spy 전사가 크게 유도된다.
4. S. Enteritidis와 S. Gallinarum 의 세균 막 스트레스에 의한 spy 전사 유도는 CpxR과 BaeR에 의존적이다.
Gallinarum 균주들의 polymyxin B에 대한 감수성을 먼저 측정하였다. LB 영양배지에서 polymyxin B 를 농도 별로 처리하여 성장 곡선을 관찰하였고, 그 결과 균주별로 성장이 지연되는 농도가 달랐다. S.
S. Enteritidis 는 2 μg/mL 에서(Fig. 2A), S. Gallinarum에서는 6 μg/mL의 농도로 처리하였을 때(Fig. 2B), 균주의 성장률이 크게 감소하는 것을 확인하였고, 더 높은 농도에서는 모든 세균의 성장이 관찰되지 않았다.
S. Enteritidis의 경우 1 μg/mL 및 2 μg/mL 농도의 polymyxin B에 의해 각각 3.9배, 13.8배, S. Gallinarum의 경우 3 μg/mL 및 6 μg/mL 농도의 polymyxin B에 의해 1.6배, 2배 증가하는 것을 확인 하였다.
Gallinarum을 이용하여 spheroplast 형성시 GFP의 발현을 확인하였다. Spheroplast 형성 과정중, sucrose와 lysozyme 처리까지 하였을 때는 spheroplast가 뚜렷하게 형성되지 않았고, sucrose, lysozyme, EDTA를 모두 처리한 경우 spheroplast가 형성되었으며, 이때에 GFP 발현이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4A와 Fig. 5A). 하지만, sucrose와 lysozyme 및 EDTA를 각각 처리했을 때는 GFP의 발현을 볼 수 없었다(data not shown).
Gallinarum의 Spy 발현과정중 spy 유전자 전사의 유도에 있어, 막 스트레스의 필요성 및 유전자 전사 유도에 참여하는 조절 단백질의 필요성을 처음으로 확인하였다. spy 유전자 전사의 유도를 확인하기 위해 제조한 spy-gfp 융합체들 중 promoter 부위만을 포함한 것은 promoter뿐 아니 라, spy 구조유전자 전체를 포함한 것에 비해서 대수기와 정지기에서 모두 발현량이 크게 나타나는 것으로 나타났다(Fig 1). 이 결과는 spy 유전자 전사 유도과정에 있어서 E.
Typhimurium 14028s 에 spy-gfp fusion 1, 2를 각각 형질전환시켜 이들의 대수기와 정지기에서 spy-gfp 전사의 발현량을 통한 차이를 확인 할 수 있었다. spy-gfp 1에 비해 spy-gfp 2는 균주의 대수기와 정지기 모두 발현량이 큰 것으로 확인되었다(Fig. 1). 이 결과는 S.
세균 성장이 지연 되는 농도를 spy 유전자 전사량 측정에 사용하였다. spy-gfp 오페론 융합 플라스미드를 가진 S. Enteritidis/ p spy-gfp 와 S. Gallinarum/ p spy-gfp 에서 형광도를 측정한 결과, 각 LB 영양배지에서 대수기(OD 600nm =0.4)까지 배양한 균주에서는 발현하지 않는 것을 확인하였고, 아무것도 처리하지 않은 균주에 비해 polymyxin B 를 처리한 균주들에서 spy-gfp의 발현이 크게 증가하는 것을 하였다(Fig. 3). S.
Gallinarum에서도 이들 체계가 관련되는지 확인하였다. 두 혈청형 모두 cpxR 과 baeR 이 결손된 돌연변이 균주에 polymyxin B를 처리했을 때 대조군(WT)에 비해서 spy-gfp 발현이 거의 되지 않는 것을 확인 하였다(Fig. 6). 이 실험에서는 세균 막에 스트레스를 주는 두 번째 요인으로 4% 에탄올을 처리하여 S.
5). 따라서 이 결과들은 S. Enteritidis와 S. Gallinarum의 막 스트레스 정도를 분석하는데 있어서, 본 연구에서 사용한 spy-gfp 오페론 융합 플라스미드가 유용하게 사용될 수 있음을 시사한다.
coli 세포막 스트레스에 의해 발현이 유도되고, 세균막 외부공간에서만 위치하며, 그 구조상 많은 단백질의 구조 안정화에 기여할 것으로 예상되는 chaperone 단백질 Spy(spheroplast protein Y)의 유전자에 상응하는 살모넬라 spy 유전자에 gfp(green fluorescence protein) 오페론 융합체를 제조하여, 이 융합체가 Salmonella enterica의 두 혈청형 Enteritidis와 Gallinarum의 세포막 스트레스를 인지하여 GFP 발현량이 크게 증가하는 것을 확인하였다. 또한 세균막 스트레스 신호를 특이적으로 인지하는 이인자 신호전달 체계(two component signal transduction system)인 Bae와 Cpx들이 두 살모넬라 혈청형의 spy 유전자 전사 유도에 필수적임을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 사용한 spy-gfp 오페론 융합체는 S.
, 2017), 본 연구에서 제작된 spy-gfp fusion 2는 재료 및 방법에서 서술한 것처럼 spy 유전자의 promoter 부위만을 포함하였다. 먼저 S. Typhimurium 14028s 에 spy-gfp fusion 1, 2를 각각 형질전환시켜 이들의 대수기와 정지기에서 spy-gfp 전사의 발현량을 통한 차이를 확인 할 수 있었다. spy-gfp 1에 비해 spy-gfp 2는 균주의 대수기와 정지기 모두 발현량이 큰 것으로 확인되었다(Fig.
병원성 세균의 막 스트레스 적응반응을 크게 조절하는 Cpx와 Bae 체계 모두 S. Enteritidis와 S. Gallinarum의 spy 전사 유도에 필요하다는 발견은 두 혈청형의 막 스트레스 적응반응 또한 두 체계에 크게 의존함을 보여준다. 또한, 이 결과는 Spy의 발현과 역할이 두 체계가 모두 활성화될 정도의 세균막 훼손이 필요함을 시사하며, 이때 spy-gfp 오페론 융합 플라스미드는 그 정도를 파악하는데 크게 유용할 것으로 사료된다.
세균막의 훼손은 세균 생존을 쉽게 위협할 수 있기 때문에 개발되는 항미생물 제제들은 주로 세균의 막을 표적으로 삼지만, 개발되는 제제들이 실제로 세균막의 훼손을 초래하는지 구별하는 것은 많은 노력과 비용을 수반한다. 본 연구에서는 E. coli 세포막 스트레스에 의해 발현이 유도되고, 세균막 외부공간에서만 위치하며, 그 구조상 많은 단백질의 구조 안정화에 기여할 것으로 예상되는 chaperone 단백질 Spy(spheroplast protein Y)의 유전자에 상응하는 살모넬라 spy 유전자에 gfp(green fluorescence protein) 오페론 융합체를 제조하여, 이 융합체가 Salmonella enterica의 두 혈청형 Enteritidis와 Gallinarum의 세포막 스트레스를 인지하여 GFP 발현량이 크게 증가하는 것을 확인하였다. 또한 세균막 스트레스 신호를 특이적으로 인지하는 이인자 신호전달 체계(two component signal transduction system)인 Bae와 Cpx들이 두 살모넬라 혈청형의 spy 유전자 전사 유도에 필수적임을 확인하였다.
하지만, sucrose와 lysozyme 및 EDTA를 각각 처리했을 때는 GFP의 발현을 볼 수 없었다(data not shown). 이 결과는 sucrose에 의한 삼투압에 대한 노출, lysozyme에 의한 펩티도글리칸의 용해, 그리고 EDTA에 의한 세포막의 약화를 통한 순차적 spheroplast형성이 완성될 때만 S. Enteritidis와 S. Gallinarum에서 spy 전사가 유도될 수 있음을 보여준다.
5B). 이 결과들은 polymyxin B와 에탄올 등의 세균 막 훼손 요인과 spheroplast 형성과정 동안 생기는 막 스트레스들에 인해 S. Enteritidis와 S. Gallinarum 의 spy 유전자 발현이 크게 증가하고, 이 유도과정에 CpxR과 BaeR의 역할이 필수적임을 보여준다.
6). 이 실험에서는 세균 막에 스트레스를 주는 두 번째 요인으로 4% 에탄올을 처리하여 S. Enteritidis와 S. Gallinarum에서 spy 전사가 증가하는 것을 확인하였고, 이 전사 유도는 cpxR 과 baeR이 결손된 돌연변이 균주들에서 일어나지 않았다. 또한, cpxR 과 baeR 이 결손된 돌연변이 균주들의 spheroplast 형성과정에서도 spy 유전자 전사 유도는 관찰되지 않았다(Fig.

후속연구

또한 세균막 스트레스 신호를 특이적으로 인지하는 이인자 신호전달 체계(two component signal transduction system)인 Bae와 Cpx들이 두 살모넬라 혈청형의 spy 유전자 전사 유도에 필수적임을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 사용한 spy-gfp 오페론 융합체는 S. Enteritidis와 S. Gallinarum의 세포막 훼손을 특이 적이고 신속하게 인식하는 biosensor로서 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
Gallinarum의 spy 전사 유도에 필요하다는 발견은 두 혈청형의 막 스트레스 적응반응 또한 두 체계에 크게 의존함을 보여준다. 또한, 이 결과는 Spy의 발현과 역할이 두 체계가 모두 활성화될 정도의 세균막 훼손이 필요함을 시사하며, 이때 spy-gfp 오페론 융합 플라스미드는 그 정도를 파악하는데 크게 유용할 것으로 사료된다.
spy 유전자 전사의 유도를 확인하기 위해 제조한 spy-gfp 융합체들 중 promoter 부위만을 포함한 것은 promoter뿐 아니 라, spy 구조유전자 전체를 포함한 것에 비해서 대수기와 정지기에서 모두 발현량이 크게 나타나는 것으로 나타났다(Fig 1). 이 결과는 spy 유전자 전사 유도과정에 있어서 E. coli 에서 알려진 Cpx와 Bae시스템 이외에 다른 조절 인자의 존재가능성을 시사하지만, 후속연구를 통해 밝혀야 할 것으로 생각된다. 본 연구 에서는 GFP 발현량을 모니터함으로써 보다 손쉽게 S.
, 2006). 하지만 단백질 구조 연구를 통해 확인한 Spy는 광범위한 기질 단백질들의 구조 안정화에 기여할 가능성이 클 것으로 예상된다. 실제로, E.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	살모넬라균의 특징은 무엇인가?	장내세균과의 일종인 살모넬라균은 통성혐기성 그람 음성 간균으로 사람이나 동물 숙주에 침투하여 단순한 장염부터 생명을 위협하는 장티푸스(Typhoid)성 질환까지 다양한 살모넬라증(salmonellosis)을 일으킨다(Grassl and Finlay, 2008). 낙농 제품과 유제품 및 유가공 제품의 생산과 유통에 있어서 살모넬라균 감염에 의한 피해는 매우 빈번하며, 오염된 제품에 의한 대대적인 식중독 발병의 경우 또한 세계적으로 빈번하다(Ryan et al.
	항미생물 제제의 개발에 어려움은 무엇인가?	많은 항미생물 제제들은 세균의 막과 막 외부 주변 공간의 훼손을 목표로 하는데, 그것은 세균 막의 직접적인 훼손뿐 아니라, 세균 생존에 필수적인 세균의 외부환경 신호 전달체계를 훼손함으로써 효과적으로 세균의 증식을 제어할 수 있기 때문이다. 하지만 개발되는 항미생물 제제가 세균 막 및 막 외부 주변 공간에 효과적으로 작용하는지를 검색하는 것은 여전히 많은 노력과 비용을 수반한다(Wolf and Mascher, 2016). 본 연구에서는 인간과 동물 모두에게 중요한 인수공통 감염성 혈청형인 Enteritidis와 가금류의 주요 병원성 혈청형인 Gallinarum의 세균 막 훼손을 인지할 수 있는 바이오센서(biosensor)로서 spy유전자 전사의 활용가능성을 조사하였으며, 두 혈청형 모두에서 효용성을 확인하였다.
	유가공 제품의 생산에 살모넬라균 제어가 필요한 이유는 무엇인가?	, 2010). 특히, 유가공 제품의 생산에 쓰이는 시설과 기구들에서 발생하는 생균막(biofilm)이 큰 위험인자인데, 생균막내에도 많은 살모넬라균의 존재가 확인되고, 이들에 의해 발생하는 감염사례 또한 살모넬라균 제어의 필요성을 보여준다(Chmielewski and Frank, 2003;Oliver et al., 2005).

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상세보기
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상세보기
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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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