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문제 정의
- 그러나 식물체 재분화 능력과 관계된 유전자의 탐색에 대한 연구도 중요하지만 배양방법이나 배지 조건 개선에 의한 식물체의 분화능력 향상 또한 더욱 깊이 있게 연구되어야 할 분야라고 생각된다. 본 실험에서는 벼 약배양에서 캘러스 유도율과 식물체 재분화능력을 높이기 위하여 일반형 벼뿐만 아니라 인디카나 통일형 벼에서도 재분화력이 높은 배지조건 및 저온전처리 방법 개발을 목적으로 하였다.
가설 설정
- 저온처리는 채취한 이삭을 광구배양병에 넣어 검은색 비닐로 감싼 다음 수분을 공급하면서 12℃ 저온챔버 (Conviron Co)에서 15일간 처리하였다. 진공포장 후 저온처리는 PE 필름을 이용하여 가정용 간이진공포장기 (한국에이젼트 ABM8080)로 하였으며 기타 처리방법은 광구배양병을 이용한 것과 동일하게 하였다.
제안 방법
- 2 mg/L의 ZAA, 40 g/L의 maltose, 5%의 gelrite가 첨가된 N6-Y1 배지에서 수행하였다. 25℃ 명조건 (2,500 Lux, 14시간 조명)의 배양실에서 30일간 배양한 후 배지에 이식한 캘러스 중 shoot와 root를 형성한 완전한 식물체를 분화한 캘러스의 수로 식물체 재분화율을 구하였다.
- 일반적인 저온 전처리 방법은 광구배양병에 담아 수분을 공급하면서 외기에 노출된 상태로 저온처리하는 것이다. 본 실험에서는 시료의 전처리시 CA (Controlled Atmosphere) 저장의 원리를 응용하여 PE 필름에 진공포장한 후 저온처리 하였다. 진공포장후 저온처리는 관행방법에 비하여 캘러스 유도율이 24%~114% 증가되 었다 (Table 4).
- 캘러스 유도율은 25℃ 암실에서 30일간 배양한 후 치상한 약수에 캘러스를 유기한 약의 수를 백분율로 구하였다. 식물체 재분화는 2mg/L 의 KI, 0.2 mg/L의 ZAA, 40 g/L의 maltose, 5%의 gelrite가 첨가된 N6-Y1 배지에서 수행하였다. 25℃ 명조건 (2,500 Lux, 14시간 조명)의 배양실에서 30일간 배양한 후 배지에 이식한 캘러스 중 shoot와 root를 형성한 완전한 식물체를 분화한 캘러스의 수로 식물체 재분화율을 구하였다.
- 약배양은 수잉기에 1핵성 소포자기의 화분을 갖는 이삭을 채취하여 12℃에서 15일간 암상태에서 저온처리 후 사용하였으며 화분소포자의 발육단계는 엽이간장 (2~5 cm)과 영내의 약의 선단위치(½~⅓)를 측정하여 판단하였다. 저온처리는 채취한 이삭을 광구배양병에 넣어 검은색 비닐로 감싼 다음 수분을 공급하면서 12℃ 저온챔버 (Conviron Co)에서 15일간 처리하였다.
- 6)를 이용하였으며 121℃에서 15분간 고압멸균 후 지름 6 cm 샤레 (Falcon 1007)에 분주하여 사용하였다. 캘러스 유도율은 25℃ 암실에서 30일간 배양한 후 치상한 약수에 캘러스를 유기한 약의 수를 백분율로 구하였다. 식물체 재분화는 2mg/L 의 KI, 0.
대상 데이터
- 벼 약배양에서 재분화 효율향상을 위하여 캘러스 유도 및 식물체 재분화에 효과적인 저온 전처리방법 개발과 배지내에 첨가되는 탄소원을 선발하였다. 먼저 일반적으로 배지내에 첨가되는 탄소원인 sucrose를 두분자의 glucose로 구성된 maltose로 변경하여 본 바, 캘러스 유도율이 자포니카에서는 1.
- 본 실험에 사용한 벼는 총 11품종으로 영남농업시험장 벼(Oryza sativa L.) 육종포장에서 표준재배법으로 재배된 교배친 포장의 벼를 이용하였다. 인디카형으로는 Tetep, IR36, IR50을 통일형으로는 밀양 23호, 가야, 삼강을 사용하였다.
- ) 육종포장에서 표준재배법으로 재배된 교배친 포장의 벼를 이용하였다. 인디카형으로는 Tetep, IR36, IR50을 통일형으로는 밀양 23호, 가야, 삼강을 사용하였다. 분화효율이 낮은 것으로 알려진 일반형 벼로는 고시히까리, 히또메보레를, 분화효율이 높은 품종으로는 화영, 동진을, 그리고 tropical japonica 품종으로 Bulu를 사용하였다.
- 다음 약의 화사부분을 가위로 절단한 후 배지에 치상하였다. 캘러스 유도는 2mg/L의 NAA, 0.5mg/L의 Kinetin (KI), 5%의 gelrite(Phytagel, Sigma P8169)등이 첨가된 N6-Y1 배지 (pH 5.6)를 이용하였으며 121℃에서 15분간 고압멸균 후 지름 6 cm 샤레 (Falcon 1007)에 분주하여 사용하였다. 캘러스 유도율은 25℃ 암실에서 30일간 배양한 후 치상한 약수에 캘러스를 유기한 약의 수를 백분율로 구하였다.
성능/효과
- 벼 약배양에서 효과적인 탄소원을 찾고자 "밀양 23호"를 이용하여 탄소원의 종류별 캘러스 유도율을 조사한 바 (Table 1), 관행의 sucrose 단용이나 sucrose와 glucose 혼용처리의 3.5%에 비하여 maltose를 사용하였을 때 캘러스 유도율이 16.1%로 현저히 높아졌다. Jain et al.
- Maltose 처리에서 공시된 생태형별 모든 품종의 캘러스 유도율이 증가되었는데, 그 증가비율은 특히 통일형이나 인디카 벼에서 높았다. 탄소원의 종류가 식물체 재분화에 미치는 영향을 조사하기 위하여 인디카형 품종인 "Tetep"을 이용하여 sucrose 또는 maltose가 첨가된 배지에서 유기된 캘러스를 각각 sucrose 또는 maltose가 첨가된 재분화 배지로 이식하여 식물체 분화율을 조사한 바 (Figure 1), 캘러스 유도시 sucrose를 사용하였을 때는 재분화시 사용한 탄소원의 종류와는 상관없이 식물체를 분화하지 못하였고, maltose를 사용한 배지에서는 sucrose 첨가 배지 유래의 캘러스에서 6.7%, 그리고 maltose 첨가 배지 유래의 캘러스에서 13.7%의 식물체 재분화율을 보여 식물체 재분화에서도 maltose가 효과적이었다. 벼 원형질체 배양에서도 maltose를 사용하였을 경우 shoot 재분화율이 sucrose 처리에 비해 높았다고하여 식물체 재분화에 maltose가 효과적이라고 하였다 (Jain et al.
- 5%나 되었다. Maltose 처리에서 공시된 생태형별 모든 품종의 캘러스 유도율이 증가되었는데, 그 증가비율은 특히 통일형이나 인디카 벼에서 높았다. 탄소원의 종류가 식물체 재분화에 미치는 영향을 조사하기 위하여 인디카형 품종인 "Tetep"을 이용하여 sucrose 또는 maltose가 첨가된 배지에서 유기된 캘러스를 각각 sucrose 또는 maltose가 첨가된 재분화 배지로 이식하여 식물체 분화율을 조사한 바 (Figure 1), 캘러스 유도시 sucrose를 사용하였을 때는 재분화시 사용한 탄소원의 종류와는 상관없이 식물체를 분화하지 못하였고, maltose를 사용한 배지에서는 sucrose 첨가 배지 유래의 캘러스에서 6.
- 배지내에 첨가되는 maltose의 적정농도는 캘러스 유도율 측면에서 40~60 g/L을 사용했을 때가 sucrose와 glucose를 혼용하였을 때보다 약 5배 정도 높았다 (Table 2). Maltose를 사용하여 품종군별 캘러스 유도정도를 조사하여 본 바 (Table 3), 자포니카 벼에서는 1.4~1.8배, 통일형은 3.2~11.6배, 그리고 인디카형인 IR50에서는 2.7배로 sucrose와 glucose를 혼용하였을 때보다 높아졌다. 전형적인 인디카 품종인 "Tetep"의 경우 sucrose 단용이나 sucrose와 glucose를 혼용하였을 때는 거의 캘러스가 유기되지 않은 반면 maltose를 사용하였을 경우는 캘러스 유도율이 12.
- 약의 저온처리 기간연장은 캘러스의 유기효율 증진과 더불어 약배양이 가능한 기간연장 및 약치상 작업의 분산이라는 측면에서 활용가치가 높다고 하겠다. 개선된 배지와 저온전처리 방법을 병행하여 생태형별 캘러스 유도와 식물체 재분화를 본 바 (Table 5, Figure 2), 캘러스 유도율은 일반형이 28%에서 56%, 통일 및 인디카형이 12%에서 32%로 증가하였으며, 식물체 분화율은 일반형 14%에서 35%, 인디카 및 통일형은 6%에서 17%로 캘러스 유도와 식물체재분화 모두 약 2배 이상 높아졌다. 이상의 결과로 볼 때 벼 약배양시 배지내에, 첨가되는 carbohydrate source는 sucrose 단용이나 sucrose와 glucose의 혼용보다는 maltose가 효과적이었고 저온전처리시 진공포장 처리는 30일 후에도 약의 활력이 유지되어 약의 수명연장에 상당한 효과가 있었다.
- 진공포장후 저온처리는 관행방법에 비하여 캘러스 유도율이 24%~114% 증가되 었다 (Table 4). 또한 관행의 방법으로 약을 30일간 저온처리하였을 경우 캘러스 유도율이 11.8%로 오히려 15일간 저온처리하였을 때의 15.3%보다 감소한 반면 진공포장 후 저온처리를 하였을 때는 30일 후에도 캘러스 유도율이 19.0%에서 25.3%로 오히려 증가되었다. 이러한 결과는 진공포장을 하였을 경우 30일 후에도 약이 연한 녹색을 유지한데 비해 관행의 방법으로 저온전처리하였을 경우 외관적으로 보아도 검게 변하여 약의 활력 소실에 의한 것으로 추정된다.
- 벼의 세포는 fructose보다는 glucose를 우선적으로 소비하는 전형적인 diauxic growth pattern을 보이는 것으로 알려져 있어서 두분자의 glucose로 구성된 maltose 처리에서 캘러스유기율이 높았던 것으로 생각되나 자세한 기작에 대해서는 더 많은 연구가 수행되어야 할 것으로 생각된다. 배지내에 첨가되는 maltose의 적정농도는 캘러스 유도율 측면에서 40~60 g/L을 사용했을 때가 sucrose와 glucose를 혼용하였을 때보다 약 5배 정도 높았다 (Table 2). Maltose를 사용하여 품종군별 캘러스 유도정도를 조사하여 본 바 (Table 3), 자포니카 벼에서는 1.
- 채취된 시료를 간이 진공포장한 후 저온처리 하였을 경우 관행의 광구배양병을 이용한 경우에 비해 캘러스 유도율을 2배 이상 크게 증가시켰고 저온처리기간을 30일까지 연장하여도 캘러스 유도율이 저하되지 않아 약치상 작업시기를 분산시키는 효과가 있었다. 위의 두처리를 병행하여 벼의 생태형별 품종들의 캘러스 유도율과 식물체 재분화율을 조사한 바, 캘러스 유도율은 일반형이 28%에서 56%, 통일 및 인디카형이 12%에서 32%로 증가하였으며, 식물체 재분화율은 일반형 14%에서 35%, 인디카 및 통일형은 6%에서 17%로 캘러스 유도와 식물체재분화 모두 약 2배 이상 높아졌다.
- 개선된 배지와 저온전처리 방법을 병행하여 생태형별 캘러스 유도와 식물체 재분화를 본 바 (Table 5, Figure 2), 캘러스 유도율은 일반형이 28%에서 56%, 통일 및 인디카형이 12%에서 32%로 증가하였으며, 식물체 분화율은 일반형 14%에서 35%, 인디카 및 통일형은 6%에서 17%로 캘러스 유도와 식물체재분화 모두 약 2배 이상 높아졌다. 이상의 결과로 볼 때 벼 약배양시 배지내에, 첨가되는 carbohydrate source는 sucrose 단용이나 sucrose와 glucose의 혼용보다는 maltose가 효과적이었고 저온전처리시 진공포장 처리는 30일 후에도 약의 활력이 유지되어 약의 수명연장에 상당한 효과가 있었다. 약배양법은 계통육종법에 비하여 품종의 육성 기간단축뿐만 아니라 소요되는 경비도 적다는 장점도 있어(Sanint et al.
- 5%로 크게 증가하였다. 채취된 시료를 간이 진공포장한 후 저온처리 하였을 경우 관행의 광구배양병을 이용한 경우에 비해 캘러스 유도율을 2배 이상 크게 증가시켰고 저온처리기간을 30일까지 연장하여도 캘러스 유도율이 저하되지 않아 약치상 작업시기를 분산시키는 효과가 있었다. 위의 두처리를 병행하여 벼의 생태형별 품종들의 캘러스 유도율과 식물체 재분화율을 조사한 바, 캘러스 유도율은 일반형이 28%에서 56%, 통일 및 인디카형이 12%에서 32%로 증가하였으며, 식물체 재분화율은 일반형 14%에서 35%, 인디카 및 통일형은 6%에서 17%로 캘러스 유도와 식물체재분화 모두 약 2배 이상 높아졌다.
후속연구
- 2000). 그러나 식물체 재분화 능력과 관계된 유전자의 탐색에 대한 연구도 중요하지만 배양방법이나 배지 조건 개선에 의한 식물체의 분화능력 향상 또한 더욱 깊이 있게 연구되어야 할 분야라고 생각된다. 본 실험에서는 벼 약배양에서 캘러스 유도율과 식물체 재분화능력을 높이기 위하여 일반형 벼뿐만 아니라 인디카나 통일형 벼에서도 재분화력이 높은 배지조건 및 저온전처리 방법 개발을 목적으로 하였다.
- 분해된다. 벼의 세포는 fructose보다는 glucose를 우선적으로 소비하는 전형적인 diauxic growth pattern을 보이는 것으로 알려져 있어서 두분자의 glucose로 구성된 maltose 처리에서 캘러스유기율이 높았던 것으로 생각되나 자세한 기작에 대해서는 더 많은 연구가 수행되어야 할 것으로 생각된다. 배지내에 첨가되는 maltose의 적정농도는 캘러스 유도율 측면에서 40~60 g/L을 사용했을 때가 sucrose와 glucose를 혼용하였을 때보다 약 5배 정도 높았다 (Table 2).
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