Plants are known as important source in the search for new drugs. The twelve compounds from Viscum album (Loranthaceae), lupeol (1), betulonic acid (2), betulinic acid (3), terminic acid (4), ursolic acid (5), $\beta$-sitosterol (6), $\alpha$-spinasterol (7), oleanolic acid (8)...
Plants are known as important source in the search for new drugs. The twelve compounds from Viscum album (Loranthaceae), lupeol (1), betulonic acid (2), betulinic acid (3), terminic acid (4), ursolic acid (5), $\beta$-sitosterol (6), $\alpha$-spinasterol (7), oleanolic acid (8), 5-hydroxy-1-(4′-hydoxyphenyl)-7-(4"-hydroxyphenyl)-hepta-1-en-3-on (9), 2′-hydroxy-4′,6′-dimethoxychalcone-4-O-glucoside (10), 2′-hydroxy-4′,6′-dimethoxychalcone-4-O-[apiosyl(l$\longrightarrow$2)]glucoside (11) and syringin (12) were evaluated for their immunomodulatory properties. Compounds 6 and 11 induced the macrophage tumoricidal activity and the lymphocyte blastogenesis. In addition, these compounds stimulated the macrophages to induce the production of TNF-$\alpha$ and NO. These findings suggest that compounds 6 and 11 are modulating various elements of the host immune response.
Plants are known as important source in the search for new drugs. The twelve compounds from Viscum album (Loranthaceae), lupeol (1), betulonic acid (2), betulinic acid (3), terminic acid (4), ursolic acid (5), $\beta$-sitosterol (6), $\alpha$-spinasterol (7), oleanolic acid (8), 5-hydroxy-1-(4′-hydoxyphenyl)-7-(4"-hydroxyphenyl)-hepta-1-en-3-on (9), 2′-hydroxy-4′,6′-dimethoxychalcone-4-O-glucoside (10), 2′-hydroxy-4′,6′-dimethoxychalcone-4-O-[apiosyl(l$\longrightarrow$2)]glucoside (11) and syringin (12) were evaluated for their immunomodulatory properties. Compounds 6 and 11 induced the macrophage tumoricidal activity and the lymphocyte blastogenesis. In addition, these compounds stimulated the macrophages to induce the production of TNF-$\alpha$ and NO. These findings suggest that compounds 6 and 11 are modulating various elements of the host immune response.
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문제 정의
지금 까지 알려진 상기생의 성분중 lectin, polysaccharide가 면역증강효과를 가지고 있다는 것은 일반적인 사실이다. 이러한 생각을 바탕으로 상기생으로부터 분리 동정한 다양한 성분을 가지고 항원특이성 면역반응에 관여하는 lymphocyte와 자연면역반응에 관여하는 macrophage에 미치는 영향을 알아보았다.
제안 방법
전체 배양부피를 200μL로 하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 48시간 배양 후에 25μL1의 MTT (2mg/mL)를 가하였다. 4시간 더 배양한 후 형성된 formazan을 150μl의 DMSO를 가하여 용해하고 10 분간 진탕한 후 540nm에서 흡광도를 측정 하였다(Cmnicgael 등, 1987).
염증반응에도 관여한다(Thomas 등 1984). 6과 11 화합물이 macrophage를 활성화하여 TNF-a를 분비하게 하는지 알아보기 위하여 이 두 화합물을 처리한 masophage의 상층액으로 부터 TNF-a 분비량을 측정해보았다. 실험결과 대조군에 비하여 macrophage의 TNF-a 생성량이 증가하였다(Table 1).
Lymphocyte의 in vitro mitogen-stimulated proliferation assay는 면역소절제에 의해서 특이적으로 감작된 lymphocyte의 활성과 증식 능력평가와 관련이 있기 때문에 상기생으로부터 분리한 화합물을 처리한 lymphocyte가 mitogen에 의하여 어떻게 변화되어 반응하는지 알아보기 위하여 다양한 농도(1-100 ㎍/mL)의 화합물과 함께 B cell mitogen LPS와 T cell mitogen ConA를 처리하였다. 대부분의 화합물은 100㎍/mL보다 높은 농도에서 세포 독성을 나타내었다(Choi 등, 2001).
cells/well이 되도록 가하고 18시간동안 배양하였다(Kim 등, 2002). MTT (2㎍/raL) 25μl를 가하고 4시간 더 배양한 후 생성된 formazan을 DMSO로 녹인 후 Molecular Device microplate reader (Menlo, CA)로 540nm에서 측정하여 암세포 사멸능을 다음과 같이 계산하였다.
Macrophage의 활성화 정도를 측정하기 위하여 macrophage가 분비하는 nitric oxide의 생성량을 측정하였 다(Ding 등, 1988). Macrophage를 96 well plate에 1×105/well이 되도록 분주하고 상기생 성분을 농도별로 20시간 처리하였다.
Peritoneal macrophage는 thioglycollate (Difco Lab. Detroit, MI)를 이용하여 외부자극에 대한 항암작용을 쉽게 알아볼 수 있도록 inflammatory macrophage 상태로 만들어 실험하였다. 생쥐에 4.
천연물 유래 항암 및 면역횔성물질 연구에서 상기생이 민간에서 항암 및 면역증강제로 많이 사용됨을 알게 되었으며 1차적으로 상기생의 일반성분을 연구보고 한바 있다(Choi 등, 2001). 그러나 이들 성분이 면역세포에 미치는 영향은 보고 된바 없어 면역활성을 평가하기 위해 B cell과 T cell의 세포중식력의 변화를 통하여 항원특이성 면역반응을 담당하는 세포들을 검토하였고, macrophage의 세포독성능력을 측정하여 자연면역반응을 담당하는 세포에 미치는 영향을 알아보았다.
이러한 항암작용은 macrophage가 활성화 단계를 거쳐 여러가지 기능이 변화되면서 암세포를 죽일 수 있는 fully activated macrophage 상태로 전환되어서 나타난다(Adams와 Hamilton, 1984). 따라서 대식세포를 직접 활성화시켜 항암효과를 발휘하는지를 알아보기 위하여 분리동정한 화합물들을 처리한 macrophage와 암세포를 함께 비양한 후 macrophage 암세포독 성능을 측정하였다. 6과 11을 제외한 화합물은 항암효과에 영향을 미치치 않았으며(data not shown) 임파구의 증식력실험과 유사하게 화합물 6과 11 처리군에서만 유의성있는 항암효과를 나타내었다(Fig.
면역횔섬을 나타내는 6과 11 화합물이 macrophage의 활성화에 미치는 영향을 좀 더 자세히 규명하기 위하여, macrophage가 분비하는 세포독성물질 nitric oxide(NO)를 측정하였다. 그 결과 NO 생성량이 증가하였다(Table 1).
/well이 되도록 하였다. 상기생 성분을 농도별로 처리하고, l0㎍/mL lipopolysaccharide (LPS)와 ㎍/mL concanavalin A (ConA)를 각각의 상기생 성분 농도에 첨가하여 B cell과 T cell의 세포증식력을 측정하였다. 전체 배양부피를 200μL로 하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 48시간 배양 후에 25μL1의 MTT (2mg/mL)를 가하였다.
(Japan)으로부터 분양 받아 실험하였다. 상기생에서 분리한 화합물 (1-12)을 0.5% DMSO와 RPMI 1640(Gibco, Grand Island, NY) 용액에 완전히 녹여 0.22 ㎛ niter에 여과하여 100, 10, 1 ㎍/mL농도로 만들었다. 사용된 시약들은 특별한 언급이 없으면 모두 Sigma사 (St Louis, MO)에서 구입하였다.
0)를 첨가하여 15분동안 상온에 방치하였다. 주사기를 이용하여 바닥으로부터 masophage를 떼어내어 원심분리한 후 세척하여 macrophage를 원하는 농도로 희석하였다.
대상 데이터
Lab. (Japan)으로부터 분양 받아 실험하였다. 상기생에서 분리한 화합물 (1-12)을 0.
22 ㎛ niter에 여과하여 100, 10, 1 ㎍/mL농도로 만들었다. 사용된 시약들은 특별한 언급이 없으면 모두 Sigma사 (St Louis, MO)에서 구입하였다.
데이터처리
대조군과 실험군의 실험결과에 대한 통계학척 분석은 student-t test를 이용하여 P값이 0.05 이하인 것을 유의성이 있는 것으로 해석하였다.
이론/모형
TNF-a 측정은 상기생 성분을 처리한 macrophage의 상층액을 앞에서 서술한 방법 (macrophage nitiic oxide production)으로 준비한 후 제조사의 방법에 따라 ELISA kit (Endogen, Wobum, MA)를 이용하여 실시하였다.
Cells (5×105cells/well) were treated with Con A(4㎍/mL) or LPS(10 ㎍/mL) for 48 hrs in the presence of various concentrations of compounds. The proliferation of splenocytes was assesed by MTT assay. Cell density was measured at 540 nm.
05% thioglycollate를 1 mL 복강주사하고 3일 후에 RPMI1640 배양액으로 복강을 세척하여 복강세포를 취하였다. 목강세포로부터의 macrophage 분리는 Klimetzek와 Remold (1980)가 서술한 방법대로 시행하였다. 간단히 설명하면, 복강세포를 tefloncoated petri dish (100×15 mm)에 5-6×105 cells/cm2으로 분주하여 macrophage가 바닥에 부착하도록 하였다.
실험에 사용된 상기생의 화합물 (1-12)의 분리 및 동정은 이미 보고한 방법으로 수행하였다(Choi 등, 2001).
성능/효과
따라서 대식세포를 직접 활성화시켜 항암효과를 발휘하는지를 알아보기 위하여 분리동정한 화합물들을 처리한 macrophage와 암세포를 함께 비양한 후 macrophage 암세포독 성능을 측정하였다. 6과 11을 제외한 화합물은 항암효과에 영향을 미치치 않았으며(data not shown) 임파구의 증식력실험과 유사하게 화합물 6과 11 처리군에서만 유의성있는 항암효과를 나타내었다(Fig. 2). 이러한 결과는 이두 화합물에 의해 직접적으로 암세포를 죽일 수 있는 fully activated macrophage 단계로 활성화 되었음을 말해준다.
그 결과 NO 생성량이 증가하였다(Table 1).
그러나, 그 이외의 화합물들은 항원특이성 세포에 영향을 주지 못하였다 (data not shown). 따라서 ConA 처리군과 LPS 처리군 모두에서 유의성 있는 증가가 나타난 점으로 보아 화합물 6과 11은 T cell뿐만 아니라 B cell에도 세포증식력에 영향을 미치는 것으로 여겨진다.
이러한 결과는 이두 화합물에 의해 직접적으로 암세포를 죽일 수 있는 fully activated macrophage 단계로 활성화 되었음을 말해준다. 또한 macrophage의 항바이러스효과를 알아본 실험에서 6과 11 화합물은 항바이러스효과에는 영향을 미치지 않는다는 사실을 알았다(data not shown). 이는 macrophage의 항암작용과 항바이러스작용이 함께 나타나는 것이 아니라, 이들 화합물에 의해 유도되는 macrophage의 항암작용은 항바이러스와는 다른 기선과 분비물질에 의하여 매개됨을 암시한다.
화합물 1은 lupeol, 화합물 2는 betulonic acid, 화합물 3은 betulinic acid, 화합물 4는 tenydnic acid, 화합물 5는 ursolic acid, 화합물 6은 β-sito$terol, 화합물 7은 a-spinasterol, 화합물 8은 oleanolic acid, 화합물 9는 5-hydroxy-l-(4'-hydoxyphenyl)-7-(4"-hydroxyphenyl)-hepta-1- en-3-one, 화합물 10 및 11은 각 각 Z'-hydroxy-4'6'- dimethoxychalcone-4-O-glucoside 및 2'-hydroxy-4',6'-dim-ethoxychalcone-4-O-[apiosy1(1→2)] glucoside, 화합물 12는 syringin으로 각각 동정하였다(Choi 등, 2001). 모든 세포배양 시약, thioglycollate broth와 시험물질은 Limulus lysate test (E-toxate, Sigma)를 이용하여 endo-toxin 오염에 대하여 실험한 결과 10pg/mL 보다 적은 것으로 판명되었다.
시행된 연구 결과를 종합해 보면, 화합물 6과 11은 그 효과가 매우 크진 않지만 면역세포들의 활성화 가능성을 제시하고 있다. T cell과 B cell의 세포증시력을 증가시키며 macrophage의 기능에도 변화를 주고 있어 이들 화합물들은 식물 자원으로부터 손쉽게 얻을 수 있어 새로운 면역조절제로서 가능성을 제시해준다.
6과 11 화합물이 macrophage를 활성화하여 TNF-a를 분비하게 하는지 알아보기 위하여 이 두 화합물을 처리한 masophage의 상층액으로 부터 TNF-a 분비량을 측정해보았다. 실험결과 대조군에 비하여 macrophage의 TNF-a 생성량이 증가하였다(Table 1). TNF-a와 NO는 macrophage가 분비하는 세포 독성물질로 알려져 있어 화합물 6과 11에 의하여 macrophage가 TNF-a 분비량에 증가를 보이는 결과는 NO 생성량에 영향을 미치는 결과와 함께 이 두 화합물이 macrophage의 항암효과에 영향을 미치는 것을 뒷받침해준다.
후속연구
T cell과 B cell의 세포증시력을 증가시키며 macrophage의 기능에도 변화를 주고 있어 이들 화합물들은 식물 자원으로부터 손쉽게 얻을 수 있어 새로운 면역조절제로서 가능성을 제시해준다. 이러한 가능성은 질병치료와 예방에 응용될 수 있을 것이며 또한 복잡한 면역세포들간의 활성을 연구하는데에도 도움이 될 것이다.
참고문헌 (11)
Adams, D. O. and Hamilton, T. A. (1984). The cell biology ofmacrophage activation. Annu. Rev. Immunol. 2, 283-318
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