Streptozotocin-유발 당뇨쥐에서 부추식이의 산화적 스트레스 및 Lipofuscin 생성 억제 효과 Protective Effect of Dietary Buchu (Allium tuberosum Rottler) on Oxidative Stress and Lipofuscin Formation in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats원문보기
산화적 스트레스를 많이 받는 당뇨상태에서 항산화활성이 높은 부추의 섭취가 지질 및 단백질 산화, 활성산소종의 생성, 항산화 효소계 활성 변화 및 lipofuscin생성에 미치는 영향을 조사하고자 S.D.계 쥐에게 streptozotocin을 복강투여하여 당뇨병을 유발시킨 후 대조군 식이와 10% 부추식이를 14주간 섭취시켰다. 부추의 섭취는 대조군식이에 비해 간보다는 피부조직에서 지질 및 단백질 산화를 유의적으로 감소 시켰고(p<0.05), 반응성이 큰 활성산소종인 hydroxyl radical의 생성도 당뇨군에 비해 유의적으로 감소된 것으로 나타났다(p<0.05).부추의 섭취는 간과 피부조직의 항산화 효소계 활성을 증가시키는 것으로 나타났으며 심장과 눈 조직에서 노화색소인 lipofuscin을 측정한 결과 당뇨군에 비해 당뇨부추군에서 감소하였고 특히 눈에서 유의적으로 감소하였다(p<0.001). 이상의 결과로 부추의 섭취는 당뇨 합병증을 일으키는 주요 원인인 산화적 스트레스를 억제하는 효과를 나타내었고, 당뇨 합병증의 증상완화에 도움을 줄 것으로 기대되어 진다.
산화적 스트레스를 많이 받는 당뇨상태에서 항산화활성이 높은 부추의 섭취가 지질 및 단백질 산화, 활성산소종의 생성, 항산화 효소계 활성 변화 및 lipofuscin생성에 미치는 영향을 조사하고자 S.D.계 쥐에게 streptozotocin을 복강투여하여 당뇨병을 유발시킨 후 대조군 식이와 10% 부추식이를 14주간 섭취시켰다. 부추의 섭취는 대조군식이에 비해 간보다는 피부조직에서 지질 및 단백질 산화를 유의적으로 감소 시켰고(p<0.05), 반응성이 큰 활성산소종인 hydroxyl radical의 생성도 당뇨군에 비해 유의적으로 감소된 것으로 나타났다(p<0.05).부추의 섭취는 간과 피부조직의 항산화 효소계 활성을 증가시키는 것으로 나타났으며 심장과 눈 조직에서 노화색소인 lipofuscin을 측정한 결과 당뇨군에 비해 당뇨부추군에서 감소하였고 특히 눈에서 유의적으로 감소하였다(p<0.001). 이상의 결과로 부추의 섭취는 당뇨 합병증을 일으키는 주요 원인인 산화적 스트레스를 억제하는 효과를 나타내었고, 당뇨 합병증의 증상완화에 도움을 줄 것으로 기대되어 진다.
Diabetes mellitus has been known to be a state of increased oxidative stress. Free radical formation and lipid peroxidation are accelerated in this metabolic disorder. Buchu (Allium tuberosum Rottler) contains lots of antioxidative nutrients such as chlorophyll, vitamin C, $\beta$-caroten...
Diabetes mellitus has been known to be a state of increased oxidative stress. Free radical formation and lipid peroxidation are accelerated in this metabolic disorder. Buchu (Allium tuberosum Rottler) contains lots of antioxidative nutrients such as chlorophyll, vitamin C, $\beta$-carotene, phenolic compounds and sulfur compounds. To investigate the protective effects of buchu, 10% lyophilized buchu diet was fed to streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats for 14 weeks and lipid peroxidation, protein oxidation, contents of reactive oxygen species, activities of antioxidative enzymes and contents of accumulated lipofuscin were measured as indicators of oxidative stress. Hepatic MDA and carbonyl contents tended to decrease in 10% buchu diet group compared with control group. Dietary buchu significantly suppressed lipid and protein oxidation in the skin of rats (p<0.05). Contents of hepatic hydroxyl radicals, which exert the highest toxicity among the reactive oxygen species, were significantly decreased in rats fed 10% buchu diet (P<0.05). Activities of antioxidative enzyme, such as superoxide dismutase, catalase, and glutathione peroxidase, tended to increase in liver and skin of rats fed 10% buchu diet, while hepatic catalase activity was significantly increased in buchu group compared with control group. Buchu supplementation significantly inhibited the accumulation of lipofuscin, an end-product of lipid peroxidation reactions induced by reactive oxygen radicals, in eye tissues compared with control diet (p<0.001). In conclusion, buchu supplementation diminished the oxidative stress, so dietary buchu could help to attenuate diabetes complications.
Diabetes mellitus has been known to be a state of increased oxidative stress. Free radical formation and lipid peroxidation are accelerated in this metabolic disorder. Buchu (Allium tuberosum Rottler) contains lots of antioxidative nutrients such as chlorophyll, vitamin C, $\beta$-carotene, phenolic compounds and sulfur compounds. To investigate the protective effects of buchu, 10% lyophilized buchu diet was fed to streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats for 14 weeks and lipid peroxidation, protein oxidation, contents of reactive oxygen species, activities of antioxidative enzymes and contents of accumulated lipofuscin were measured as indicators of oxidative stress. Hepatic MDA and carbonyl contents tended to decrease in 10% buchu diet group compared with control group. Dietary buchu significantly suppressed lipid and protein oxidation in the skin of rats (p<0.05). Contents of hepatic hydroxyl radicals, which exert the highest toxicity among the reactive oxygen species, were significantly decreased in rats fed 10% buchu diet (P<0.05). Activities of antioxidative enzyme, such as superoxide dismutase, catalase, and glutathione peroxidase, tended to increase in liver and skin of rats fed 10% buchu diet, while hepatic catalase activity was significantly increased in buchu group compared with control group. Buchu supplementation significantly inhibited the accumulation of lipofuscin, an end-product of lipid peroxidation reactions induced by reactive oxygen radicals, in eye tissues compared with control diet (p<0.001). In conclusion, buchu supplementation diminished the oxidative stress, so dietary buchu could help to attenuate diabetes complications.
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제안 방법
Gluta thione peroxidase(GSH-px)활성은 Lawrence와 Burk(22)의 방법 에 의 해 측정 하였 다. 즉 효소 활성 은 GSH-px가 压。2를 제거하면서 소비된 GSH을 환원형으로 전환시키는데 필요한 NADPH의 양을 340 nm에서 측정하였고 GSH-px 1 unit 는 1분간 1 Umol NADPH를 산화시 키는 효소의 양으로 정 의하였다. 효소활성 측정 에 필요한 단백질 함량은 Peterson(23) 의 방법 에 의 해 bovine serum albumin을 표준단백 질로 사용하여 측정하였다.
5) 에 용해 시 켜 kg 체중당 50 mg 의 STZ을 복강 주사하여 당뇨를 유발시 켰다. STZ 투여 일주일후, 공복상태인 쥐의 꼬리정맥에서 채혈하여 혈당을 측정 (Accutrend alpha, D-68298 Mannheim, Germany)하였으며 혈당 수준이 200 mg/dL 이상인 쥐 22마리를 당뇨가 유발된 것으로 분류하였고 이때의 당뇨유발율은 88%였다. 당뇨유발 후 체중에 따라 난괴법으로 각각 10마리씩 당뇨군과 당뇨부추군으로 나누어 대조군 식이와 10% 부추식이를 공급하여 14주간 사육하였다.
STZ 투여 일주일후, 공복상태인 쥐의 꼬리정맥에서 채혈하여 혈당을 측정 (Accutrend alpha, D-68298 Mannheim, Germany)하였으며 혈당 수준이 200 mg/dL 이상인 쥐 22마리를 당뇨가 유발된 것으로 분류하였고 이때의 당뇨유발율은 88%였다. 당뇨유발 후 체중에 따라 난괴법으로 각각 10마리씩 당뇨군과 당뇨부추군으로 나누어 대조군 식이와 10% 부추식이를 공급하여 14주간 사육하였다. 물과 식이는 자유로이 섭취하도록하였고 사육실의 온도는 20〜25°C로 유지하였으며, 12시 간간격으로 점등 및 소등하였 다.
두 그룹의 미 량성 분을 동일하게 공급하기 위 해 10% 부추식 이 에 calcium phosphate 3.297 g/kg, sodium chloride 0.659 g/kg, zinc carbonate 0.004 g/kg> 첨 가하였다. 10% 부추 식이 를 급여 한 동물의 식 이 조성 은 Table 1과 같고 냉 장 보관하면서 실험동물에게 14주간 공급하였다.
따라서 본 연구에서는 강력한 항산화효과를 가진 부추가 streptozotocin(이하 STZ)으로 당뇨를 유발시킨 Sprague- Dawley계 쥐의 당뇨 합병증 증세 완화효과를 나타내는지보기 위 하여 10% 부추식 이를 14주간 섭 취 시 켜 간과 피 부조직에서 지질 및 단백질 산화와 활성산소종의 생성 및 항산화효소계의 활성변화를 조사하였다. 또한 노화색소인 lipo- fuscin이 축적되기 쉬운 심장과 눈 조직에서 부추의 항노화효과를 측정하였다.
활성변화를 조사하였다. 또한 노화색소인 lipo- fuscin이 축적되기 쉬운 심장과 눈 조직에서 부추의 항노화효과를 측정하였다.
산화적 스트레스를 많이 받는 당뇨상태에서 항산화활성이높은 부추의 섭취가 지질 및 단백질 산화, 활성산소종의 생성, 항산화 효소계 활성 변화 및 lipofuscin 생성 에 미치는 영향을 조사하고자 S.D계 쥐에게 streptozotocin을 복강투여하여 당뇨병을 유발시킨 후 대조군 식이와 10% 부추식이를 14주간 섭취시켰다. 부추의 섭취는 대조군 식이에 비해 간보다는 피부조직에서 지질 및 단백질 산화를 유의적으로 감소시 켰고(p<0.
함량으로 측정하였다. 이때 표준용액으로는 l, l, 3, 3-tetramethoxypropane(TMP)을 사용하였으며 측정된 값을 표준곡선에 대입시켜 MDA의 양으로 환산하였다.
즉 클로로포름 : 메탄올(2 :1, v/v) 을 첨 가하여 균질화한 뒤 증류수를 가해 혼합하고 3, 000 rpm 에서 2분간 원심 분리시켰다. 클로로포름층을 취해 메탄올과 혼합한 뒤 excitation 365 nm, emission 450 nm에서 형 광스펙트럼을 측정하였고 당뇨군의 형광도와 비교하여 상대적인 형광도로 나타내었다.
활성 산소종의 함량을 측정 하기 위 해 간 subcellular frac- tion을 분리 하여 세포질 획 분에 서 superoxide anion을, 미토콘드리아 획분에서 hydroxyl radical을 Choi 등(24)의 방법을 변형하여 측정하였으며 실험방법은 전보(17)에서 보고한바와 같다.
대상 데이터
Sprague-Dawley계 수컷 쥐(체중 320+10 g) 25마리를 구입하여 2주간 고형사료(Purina chow)를 제공하여 적응시 킨후 기본 식이로 1주간 예비 사육하였다. 예비사육 후 STZ을 0.
본 실험에서는 김해 대동면에서 생산된 부추(그린벨트종, 대동농협)를 구입 하여 동결 건조한 후 가루로 만들어 식 이 에 첨가하였으며 부추 속의 당질, 지질, 단백질, 무기질, 섬유질 등의 성 분을 고려 하여 식 이 (semi-purified diet)를 조성 하였다. 두 그룹의 미 량성 분을 동일하게 공급하기 위 해 10% 부추식 이 에 calcium phosphate 3.
실 험 동물은 드라이 아이 스로 마취 시 켜 간, 안구, 심 장 및 피부를 적 출하여 0.9% 생 리 식 염 수로 세 척 한 뒤 여 과지 로 물기를 제거하고 -70°C에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
실험결과는 평균土표준편차로 표시하였고, SPSS program을 이용하여 t-test로 유의차를 검 정 하였다.
이론/모형
SOD 1 unit는 1 분 동안 pyrogallol의 자동산화를 50%까지 억 제 하는데 요구되는 효소의 양으로 정 의 하였다. Catalase 활성 측정 은 Aebi(21)의 방법 에 의 해 50 mM Na-K 인산완충액 (pH 7.0), 기 질로 30 mM H2O2 용액과 시 료액을 취 해 240 nm에서 흡광도의 변화를 측정 하였고 효소의 활성은 1분동안 1 jJmol 의 H2O2를 분해시키는 효소의 양을 1 unit로 하였다. Gluta thione peroxidase(GSH-px)활성은 Lawrence와 Burk(22)의 방법 에 의 해 측정 하였 다.
Fletcher 등(25)의 방법을 이용하여 심 장과 눈에서 lipo fuscin 함량을 측정하였다. 즉 클로로포름 : 메탄올(2 :1, v/v) 을 첨 가하여 균질화한 뒤 증류수를 가해 혼합하고 3, 000 rpm 에서 2분간 원심 분리시켰다.
0), 기 질로 30 mM H2O2 용액과 시 료액을 취 해 240 nm에서 흡광도의 변화를 측정 하였고 효소의 활성은 1분동안 1 jJmol 의 H2O2를 분해시키는 효소의 양을 1 unit로 하였다. Gluta thione peroxidase(GSH-px)활성은 Lawrence와 Burk(22)의 방법 에 의 해 측정 하였 다. 즉 효소 활성 은 GSH-px가 压。2를 제거하면서 소비된 GSH을 환원형으로 전환시키는데 필요한 NADPH의 양을 340 nm에서 측정하였고 GSH-px 1 unit 는 1분간 1 Umol NADPH를 산화시 키는 효소의 양으로 정 의하였다.
Superoxide dismutase(SOD)활성은 알칼리 상태 에서 py- rogallol의 자동산화에 의 한 발색을 이용한 Marklund와 Mar- klund(20)의 방법을 이용하여 420nm에서 측정하였다. SOD 1 unit는 1 분 동안 pyrogallol의 자동산화를 50%까지 억 제 하는데 요구되는 효소의 양으로 정 의 하였다.
간과 피 부조직 에서 단백 질 carbonyl 함량은 2, 4-dinitro- phenyl hydrazine(2, 4-DNPH)을 이 용한 Oliver 등(19)의 방법에 준하여 측정하였다. 침전된 단백질에 2, 4-DNPH 시약을 가해 반응시킨 후 에타놀과 에틸아세테이트의 혼합액으로 세 척 하고 6 M guanidine-HC1 용액을 가해 용해 시 켜 370 nm에서 흡광도의 차를 측정하고 흡광계수(22X10" mol1 crr「)를 이용하여 환산하였다.
간과 피 부조직 의 지 질과산화물 함량은 Ohkawa 등(18)의방법 을 이 용하여 thiobarbituric acid(TBA)와 반응하는 ma- londialdehyde(MDA)의 함량으로 측정하였다. 이때 표준용액으로는 l, l, 3, 3-tetramethoxypropane(TMP)을 사용하였으며 측정된 값을 표준곡선에 대입시켜 MDA의 양으로 환산하였다.
즉 효소 활성 은 GSH-px가 压。2를 제거하면서 소비된 GSH을 환원형으로 전환시키는데 필요한 NADPH의 양을 340 nm에서 측정하였고 GSH-px 1 unit 는 1분간 1 Umol NADPH를 산화시 키는 효소의 양으로 정 의하였다. 효소활성 측정 에 필요한 단백질 함량은 Peterson(23) 의 방법 에 의 해 bovine serum albumin을 표준단백 질로 사용하여 측정하였다.
성능/효과
1일 평균 섭 취 량은 당뇨군과 부추식이군간의 유의 차는 나타나지 않았다. 대조군과 부추식 이군 모두 체중감소가 나타났으며 식이효율도 유사하게 나타났다.
본 연구에서 당뇨유발된 쥐에서 부추의 섭취는 hydroxyl radical의 생성을 유의적으로 억제하였고 이는 부추 속의 풍부한 항산화물질이 효과적으로 활성산소종의 소거에 관여하는 것으로 보여진다. 부추가 카드뮴 투여로 인한 간과 신장의 괴사와 종창을 억제시켜 독성을 방어하였다(44)는 연구와 장기간 부추를 섭취시켰을 때 정상 ICR 마우스의 간과 피부조직에서 활성산소종의 생성이 유의하게 억제된 것(17), 당뇨 유발 시 증가되는 GOT, GPT 활성을 부추가 정상 수준으로 회복시킨 것(29) 등의 연구결과로 미루어 부추에 존재하는 항산화 활성 물질들, 특히 글루타치 온과 같은 물질들이 간의 독성 물질 대사를 원활히 하도록 도와주고 활성산소종을 빠르게 소거할 수 있도록 작용한 것으로 보여진다.
05). 부추의 섭취는 간과 피부조직의 항산화 효소계활성을 증가시 키는 것으로 나타났으며 심 장과 눈 조직 에서노화색소인 lipofuscin을 측정 한 결과 당뇨군에 비 해 당뇨부추군에서 감소하였고 특히 눈에서 유의적으로 감소하였다 (p<0.001). 이상의 결과로 부추의 섭 취는 당뇨 합병증을 일으키는 주요 원인인 산화적 스트레스를 억제하는 효과를 나타내었고, 당뇨 합병증의 증상완화에 도움을 줄 것으로 기대되어진다.
부추의 섭취는 당뇨쥐의 간과 피부조직에서 단백질의 산화를 억제하였으며 특히 피부조직에서 현저한 효과를 나타내었다. 당뇨병의 피부 증상은 주로 피부 감염, 세소 혈관증, 대사 장애, 신경병증 및 치료 약제에 의한 피부 반응 등으로 인해 유발되며 당뇨병환자의 피부 병변 출현 빈도는 외국의경우 30% 정도로 보고되고 있으나(38), 우리나라에서는 그보다 훨씬 높은 43.
D계 쥐에게 streptozotocin을 복강투여하여 당뇨병을 유발시킨 후 대조군 식이와 10% 부추식이를 14주간 섭취시켰다. 부추의 섭취는 대조군 식이에 비해 간보다는 피부조직에서 지질 및 단백질 산화를 유의적으로 감소시 켰고(p<0.05), 반응성 이 큰 활성산소종인 hydroxyl radical 의 생성 도 당뇨군에 비 해 유의 적 으로 감소된 것으로 나타났다(p<0.05). 부추의 섭취는 간과 피부조직의 항산화 효소계활성을 증가시 키는 것으로 나타났으며 심 장과 눈 조직 에서노화색소인 lipofuscin을 측정 한 결과 당뇨군에 비 해 당뇨부추군에서 감소하였고 특히 눈에서 유의적으로 감소하였다 (p<0.
3% 감소하였으나 유의 적 인 차이 는 나타나지 않았다. 이 에 반해 피 부조직 에서는 당뇨군이 7.36 ±1.77 nmole/mg protein인 반면 부추 섭 취군은 5.46±1.23 nmole/mg protein으로 25.9% 감소하였으며 부추 급여에 의해 단백질 산화가 유의적으로 감소하였다(p< 0.05).
Jung 등(29)은 STZ-당뇨유발시 간의 Mn-SOD 활성은 증가한 반면 GSH peoxidase와 GSH reductase의 활성 이 급격하게 감소하였고 부추의 섭취는 감소되어진 항산화 효소 활성 을 다소 증가시 킨다고 보고하였고 Kwak 등(4W도 김 해산 부추의 SOD 유사활성을 보고한 바 있다. 이상의 결과로 미루어 당뇨상태에서는 유리기 생성이 증가되어 항산화 효소계의 활성이 증가하면서 방어하기 위한 시도를 하나 심한산화적 스트레스가 유지됨에 따라 조직의 산화가 가속화 되는 것으로 여겨지며 부추의 섭취는 조직의 산화를 억제하는데 효과가 있는 것으로 나타났다.
활성산소종의 함량을 측정한 결과(Fig. 3) 당뇨군의 super- oxide anion의 함량은 13.97±5.22 nmole/mg protein이 였고부추섭 취군은 14.02 ±3.07 nmole/mg protein으로 두 군에서 유사한 값을 나타내었다. 그러나 hydroxyl radical의 경우 당뇨 군은 8.
후속연구
뿐만 아니 라 당뇨를 유발하기 위 해 사용된 약제 인 STZ도 H2O2 발생을 자극하여 superoxide anione과 hydroxyl radical 등의 유리기 생성을 증가시키는 것으로 보고되어 있다(37). 따라서 당뇨쥐에서 지질과산화를 억제시키는 것은 당뇨 합병증 유발을 지연시킬 수 있는 좋은 방안이 될 수 있는 것으로 기대된다.
001). 이상의 결과로 부추의 섭 취는 당뇨 합병증을 일으키는 주요 원인인 산화적 스트레스를 억제하는 효과를 나타내었고, 당뇨 합병증의 증상완화에 도움을 줄 것으로 기대되어진다.
본 연구에서부추식이는 당뇨쥐의 간보다는 피부에서 지질과산화를 유의적으로 억제하였고, Lee 등(15, 16)의 연구에서도 장기간의 부추 섭 취 는 ICR mouse의 간보다는 피 부조직 에 서 지 질 과산화를 유의적으로 억제하였다. 즉 부추의 섭취는 당뇨로 유발된산화적 스트레스 조건하에서 피부의 지질과산화를 효과적으로 억제하였고 만성적인 당뇨 상태에서 일어나기 쉬운 피부질환을 예방하거나 지연시킬 수 있을 것으로 기대되어진다. 단백질 산화 억제효과
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