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문제 정의
- 따라서 본 실험은 Chamber를 이용한 간접적인 전기융합 방법과 Needle을 이용한 직접적인 전기융합 방법이 체세포 주입 수정란의 융합율 및 체외 배발달율에 미치는 영향을 비교하고자 실시하였다.
- 실패하거나 lysis가 일어나게 된다. 본 실험에서는 한우 체세포를 이용하여 핵이식을 실시한 후 수핵세포질과 융합을 시도할 때 전기융합 방법에 따른 융합율과 배발달율을 검토하고자 실시하였다. 공여세포는 한우 귀 세포조직을 채취하여 0.
제안 방법
- 사용하였는데 l.Oinm 간격의 electric ch- amber를 융합을 할 때마다 ZCFM 융합배지로 세척하고 융합배지를 채운 후, 전극의 +, - 방향과는 상관없이 수핵란과 주입된 체세포의 위치가 전류방향과 수직이 되도록 micro pipette을 이용하여 수동으로 조정하였다. 그 후 180V, 20]l/sec로 1회통전하여 융합을 실시하였다.
- 그 후 PBS로 원심분리 세정을 2~3회 실시하여 trypsin과 EDTA를제거한 후 DMEM(Gibco, USA) + 10% FBS (Gi- bco, USA) + 10% Antibiotic antimycotics (Gibco, USA) 배양액이 들어있는 culture flask (Falcon,USA)에 분주하여 배양을 실시하였는데, 배양 12 시간 후 바닥에 붙지 않는 세포는 제거하고 그 후 24시간마다 신선한 배양액으로 교체하면서 일주일간 배양을 실시하였다. 계대배양 공여세포는 10%DMSO(Sigma, USA)가 첨가된 DMEM 배양액으로동결보존해 두고, 핵이식에 사용할 때는 37℃ 온수에 융해하여 동결보호제를 제거하였다. 그 후 10% FBS가 첨가된 신선한 DMEM 배양액으로 배양한세포가 dish 바닥에 monolayer를 충분히 형성하였을 때 0.
- 공여 핵으로는 귀세포를 이용하였는데 petri-dish 에 0.5% FBS가 첨가된 PBS drop과 10㎕ PHA-P와 20% FBS가 첨가된 TCM-199 drop을 만든 후 PBS drop에는 공여세포를, TCM-199 drop에는 탈핵 난자를 넣은 후 외경이 20~30㎛인 주입용 pipette을 이용, 공여세포를 흡입하여 탈핵시 만들어진 투명 대의 slit을 통해 위란강에 주입하였는데, 주입 시 세포질과 공여핵이 서로 떨어지지 않고 붙어 있도록 최대한 안으로 밀어 넣었고 이 작업 역시 20분이 넘지 않도록 하였다. 공여핵 주입 후 전기적 융합을 실시할 때까지 20% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액에 넣어 incubator 안에서 배양하였다.
- 계대배양 공여세포는 10%DMSO(Sigma, USA)가 첨가된 DMEM 배양액으로동결보존해 두고, 핵이식에 사용할 때는 37℃ 온수에 융해하여 동결보호제를 제거하였다. 그 후 10% FBS가 첨가된 신선한 DMEM 배양액으로 배양한세포가 dish 바닥에 monolayer를 충분히 형성하였을 때 0.5% FBS가 첨가된 DMEM 배양액으로 3〜 4일간의 serum starvation(Campbell 등, 1996)을 실시하여 세포주기를 G0 또는 G1 기로 유도한 다음공여세포로 사용하였다.
- 05% trypsin (Gibco, USA)과 ImM EDTA(Sigma, USA)의 혼합액을 첨가하여 37℃, 5% CO2 포화습도 배양기에서 30〜60분 동안 정치시켰다. 그 후 PBS로 원심분리 세정을 2~3회 실시하여 trypsin과 EDTA를제거한 후 DMEM(Gibco, USA) + 10% FBS (Gi- bco, USA) + 10% Antibiotic antimycotics (Gibco, USA) 배양액이 들어있는 culture flask (Falcon,USA)에 분주하여 배양을 실시하였는데, 배양 12 시간 후 바닥에 붙지 않는 세포는 제거하고 그 후 24시간마다 신선한 배양액으로 교체하면서 일주일간 배양을 실시하였다. 계대배양 공여세포는 10%DMSO(Sigma, USA)가 첨가된 DMEM 배양액으로동결보존해 두고, 핵이식에 사용할 때는 37℃ 온수에 융해하여 동결보호제를 제거하였다.
- 1% hyaluronidase (Sigma, USA)가 들어 있는 PBS(Gibco, USA)와 함께 conical tube에 넣고 vortex mixer로 1분간 처 리하여 난구세포를 제거하였다. 난구세포 제거 후 세포질의 색조가 균일하고 제 1극체가 방출된 난자만을 선별하여 TCM-199으로 2~3회 세척하였다. 세척한 난자는 10㎕ PHA-P와 20% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액 내에서 탈핵을 실시하였는데, 모든 미세조작은 실온에서 DIC(differential interfe rence contrast)가 장착된 도립현미경 (Nikon, Japan; 200)하에서 실시하였다.
- 체세포가 보이지 않는 난자는 융합 난자로 간주하고 활성화 처리에 들어갔다. 먼저 lOym calcium ionophore(Sigma, USA)가 첨가된 CRl-aa에서 5분간 활성화 후 2.0mM 6-DMAP(Sigma, USA)가 첨가된 CRl-aa에서 3시간 동안 활성화를 실시하였다.
- 모든 micro tools은 자체 제작을 하였는데 Suter 사 capillary tube를 사용하여 보정용(holding) pi pette, 탈핵 용(enucleation) pipette 및 주입 용(injec-tion) pipette을 각각 제작하였다. 보정용 피펫은 외경이 160-180㎛, 탈핵과 주입용 pipette은 외경이 20〜30㎛가 되도록 하였고 제작이 완료된 주입용 pipette은 불화수(J.
- 난구세포 제거 후 세포질의 색조가 균일하고 제 1극체가 방출된 난자만을 선별하여 TCM-199으로 2~3회 세척하였다. 세척한 난자는 10㎕ PHA-P와 20% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액 내에서 탈핵을 실시하였는데, 모든 미세조작은 실온에서 DIC(differential interfe rence contrast)가 장착된 도립현미경 (Nikon, Japan; 200)하에서 실시하였다.
- 세포융합기로는 Fusihira(ET-3, Japan)을 사용하였는데 80mm petri-dish에 ZCFM 융합배지를 채운후 핵이식란을 넣고 수핵란과 공여핵의 위치를 3 시(+) 또는 9시(-) 방향에 위치시킨 후 미세조작기를 이용하여 약간의 압력을 가한 후 25V, 10U /sec 로 1회 통전하여 융합을 실시하였다.
- 운반하였다. 운반된 난소는 항생제가 첨가된 신선한 생리식염수로 난소 표면을 3 〜4.회 세 척 후 18 gauge의 주사침이 부착된 10cc disposable syringe를 이용하여난포의 크기 가 3 〜6mm인 난포에서 난포액 과 난포란을 함께 흡입하여 채란하였다. 흡입된 난포액을80mm petri-dish에 담아 실체현미경, 하에서 pas- teur pipette을 이용, Wiemer 등(1991)의 방법을 참고하여 난구세포가 3층 이상으로 치 밀하게 부착되어 있고 세포질이 균일한 난자만을 선별하였다.
- 융합 후 체외 배양에 있어서는 초기배 발달과정인 배양 3일째까지는 0.3%의 BSA가 첨가된 배지에, 그 이후에는 10% FBS가 첨가된 배지에 배양하며 관찰하였는데, chamber와 needle을 이용한 융합 방법에 따른 난할율 및 배 발달율은 Table 2와 같다.
- 사용하였다. 융합에 앞서 배지사이의 농도충격을 최소화 하기 위해 4well-dish에 TCM : ZCFM 비율이 3:7, 1:9, 0:10으로 만들어 체세포 주입 난자의 평형을 유도하였다. 평형 방법 및 시간은 상온에서 TCM-199 배지에 있는 체세포가 주입 된 난자를 pasteur pipette을 이용하여 단계별로 희석된 ZCFM 배지 상부에 살며시 올려놓은 후 자연적으로 4well-dish 바닥에 가라앉으면 다음 단계 배지로 옮기는 방법을 이용하였으며 전기융합은 37℃ 로 셋팅된 warm plate에서 실시하였다 .
- 전기융합이 끝난 핵이식 난자는 20% FBS가 첨가된 TCM-199에서 30분간 배양한 후 실체현미경 하에서 정상적인 융합유무를 확인하였는데, 주입한 체세포가 보이지 않는 난자는 융합 난자로 간주하고 활성화 처리에 들어갔다. 먼저 lOym calcium ionophore(Sigma, USA)가 첨가된 CRl-aa에서 5분간 활성화 후 2.
- 체외에서 성숙된 난자를 0.1% hyaluronidase (Sigma, USA)가 들어 있는 PBS(Gibco, USA)와 함께 conical tube에 넣고 vortex mixer로 1분간 처 리하여 난구세포를 제거하였다. 난구세포 제거 후 세포질의 색조가 균일하고 제 1극체가 방출된 난자만을 선별하여 TCM-199으로 2~3회 세척하였다.
- Baker)로 내부를 매끄럽게 만든 후 증류수로 세척하고 polyethoxyethanol (Si-gma, USA)로 코팅 후 사용하였다. 탈핵 방법은 먼저 난자의 극체가 12시 방향이 되도록 고정시킨후 극체 바로 윗 부분을 slicing하고 탈핵용 pipette을 이용하여 위에서 아랫 방향으로 눌러 제 1극체와 소량의 세포질을 빼내었는데 모든 과정은 20분이 내에 실시하였다.
- 융합에 앞서 배지사이의 농도충격을 최소화 하기 위해 4well-dish에 TCM : ZCFM 비율이 3:7, 1:9, 0:10으로 만들어 체세포 주입 난자의 평형을 유도하였다. 평형 방법 및 시간은 상온에서 TCM-199 배지에 있는 체세포가 주입 된 난자를 pasteur pipette을 이용하여 단계별로 희석된 ZCFM 배지 상부에 살며시 올려놓은 후 자연적으로 4well-dish 바닥에 가라앉으면 다음 단계 배지로 옮기는 방법을 이용하였으며 전기융합은 37℃ 로 셋팅된 warm plate에서 실시하였다 .
- 한우 성축의 귀 조직을 5x5mm 정도 절제하여 Ca2+과 Mg2+ free PBS에서 2〜3회 세 정 후 멸균 핀셋과 메스를 이용하여 세절하고 0.05% trypsin (Gibco, USA)과 ImM EDTA(Sigma, USA)의 혼합액을 첨가하여 37℃, 5% CO2 포화습도 배양기에서 30〜60분 동안 정치시켰다. 그 후 PBS로 원심분리 세정을 2~3회 실시하여 trypsin과 EDTA를제거한 후 DMEM(Gibco, USA) + 10% FBS (Gi- bco, USA) + 10% Antibiotic antimycotics (Gibco, USA) 배양액이 들어있는 culture flask (Falcon,USA)에 분주하여 배양을 실시하였는데, 배양 12 시간 후 바닥에 붙지 않는 세포는 제거하고 그 후 24시간마다 신선한 배양액으로 교체하면서 일주일간 배양을 실시하였다.
- 핵이식 수정란은 38.5℃, 90% N2, 5% CO2로 조정된 배양기에서 6일간 배양하였는데, 처음 3일은0.3% BSA(Sigma, USA)가 첨가된 CRl-aa 배 양액에서 배양을 실시하였고 배양 4일째부터는 10%FBS가 첨가된 CRl-aa 배양액에서 배양을 실시하여 배반포배까지의 발달을 유도하였다.
- 05 % trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS로 세포를 분리한 후 DMEM 배양액으로 계대배양을 실시하여 사용하였다. 핵이식을 위하여 체외성숙시킨 난자를 탈핵용 micro pipette을 이용하여 투명대를 절개하고 수핵난자의 극체와 핵을 제거한 후 공여세포를 주입하였으며, 핵이식 수정란은 직접, 간접적인 전기적 자극으로 융합을 실시한 후 calcium iono- phore와 6-DMAP를 이용하여 활성화를 유도하였다. 활성화된 수정 란은 38.
- 핵이식을 위하여 체외성숙시킨 난자를 탈핵용 micro pipette을 이용하여 투명대를 절개하고 수핵난자의 극체와 핵을 제거한 후 공여세포를 주입하였으며, 핵이식 수정란은 직접, 간접적인 전기적 자극으로 융합을 실시한 후 calcium iono- phore와 6-DMAP를 이용하여 활성화를 유도하였다. 활성화된 수정 란은 38.5℃, 90% N2, 5% CO2로조정된 배양기에서 처음 3일은 0.3% BSA가 첨가된 CRl-aa 배양액에서, 배양 4일째부터는 10% FBS가 첨가된 CRl-aa 배양액에서 배양을 실시하였다. 본 연구결과를 요약하면 다음과 같다.
대상 데이터
- 본 실험에서는 한우 체세포를 이용하여 핵이식을 실시한 후 수핵세포질과 융합을 시도할 때 전기융합 방법에 따른 융합율과 배발달율을 검토하고자 실시하였다. 공여세포는 한우 귀 세포조직을 채취하여 0.05 % trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS로 세포를 분리한 후 DMEM 배양액으로 계대배양을 실시하여 사용하였다. 핵이식을 위하여 체외성숙시킨 난자를 탈핵용 micro pipette을 이용하여 투명대를 절개하고 수핵난자의 극체와 핵을 제거한 후 공여세포를 주입하였으며, 핵이식 수정란은 직접, 간접적인 전기적 자극으로 융합을 실시한 후 calcium iono- phore와 6-DMAP를 이용하여 활성화를 유도하였다.
- 본 실험에 사용된 난소는 도살 직후 한우 암소에서 적출하여 penicillin G(100 units/ml)와 strepto mycin sulfate(100 ㎍/ml)가 함유된 생리식염수(30〜36℃)에 넣어 2시간 이내에 실험실로 운반하였다. 운반된 난소는 항생제가 첨가된 신선한 생리식염수로 난소 표면을 3 〜4.
- 전기융합 배지로는 Zimmermann Cell Fusion Medium(ZCFM)을 사용하였다. 융합에 앞서 배지사이의 농도충격을 최소화 하기 위해 4well-dish에 TCM : ZCFM 비율이 3:7, 1:9, 0:10으로 만들어 체세포 주입 난자의 평형을 유도하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻어진 결과는 SAS package를 이용하여 실시하였으며 요인의 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- 회 세 척 후 18 gauge의 주사침이 부착된 10cc disposable syringe를 이용하여난포의 크기 가 3 〜6mm인 난포에서 난포액 과 난포란을 함께 흡입하여 채란하였다. 흡입된 난포액을80mm petri-dish에 담아 실체현미경, 하에서 pas- teur pipette을 이용, Wiemer 등(1991)의 방법을 참고하여 난구세포가 3층 이상으로 치 밀하게 부착되어 있고 세포질이 균일한 난자만을 선별하였다. 선별된 난자는 Hepes-buffered tissue culture medium 199(TCM-199 ; Gibco, USA)에 2〜3회 세척을 한 후 10% 우헐청(Fetal Bovine Serum ; FBS, Gibco, USA)을 첨가한 TCM.
성능/효과
- 높은 전압을 간접적으로 이용한 chamber를 사용했을 때 73.2%의 난할율로, needle을 이용하여 낮은 전압을 직접적으로 사용했을 시 80.3%보다 유의적으로 낮은 난할율을 보였다. 초기배 상태인2~4 세포기 역시 각각 54.
- 세포가 작을수록 더 높은 전압이 요구되지만(Zimmermann and Vienken, 1982), 전압이 낮으면 세포의 융합이 이루어지지 않게 되고, 너무 높으면cell lysis의 원인이 된다(Zakharchenko 등, 1995).본 실험에서도 chamber를 이용하여 높은 전압을 가하는 것보다 needle을 이용하여 낮은 전압을 가하는 구에서 유의적으로 높은 융합율을 보였다. 또한 소의 체세포 핵이식에서 융합율은 50〜80%로보고되고 있는데(Goto 등, 1999 ; Kato 등, 1998 ; Wells 등, 1998 ; Zakhartchenko 등, 1999a, b), 본 실험에서도 chamber, needle을 이용한 두 구 모두 51.
- 1%를 보임으로써 needle방법이 유의적으로 높은 발달율을 보였다. 상실배 단계는 각각 6.7%와 6.2%로 비슷한 발달율을 보였지만 이식 가능한 단계인 배반포배 발달율은 needle을 사용하여 융합을 시도한 체세포 복제란이 26.3%로 chamber# 사용하여 융합을 시도한 구 18.4% 보다 유의 적으로 높은 발달율을 보였다 (P< 0.05).
- 세포융합기 BTX 2000과 1.0㎜ 간격 의 electric chamber를 이용하여 180V, 20p/sec로 1회 통전하여 융합을 시도했을 때 체세포 융합율과 lysis율은각각 51.6%, 10.7%를 보였다. 한편 Fusihira 융합기에 needle을 연결하여 체세포 주입 수정란에 직접 25V, 10p/sec로 1회 통전하여 융합을 시도했을 경우 체세포 융합율과 lysis율은 각각 68.
- 융합 후 체외 발달과정을 살펴보면 난할율에 있어서 needle을 이용했을 시 80.3%로 chamber# 이용했을 시 73.2%보다 유의적으로 높은 난할율을 보였다. 초기배 발달단계인 2〜4세포기의 발달율역시 needle을 사용한 구가 61.
- 전기자극 융합방법에 따른 수핵난자의 융합율과 lysis율은 electric chamber를 이용하여 간접융합을 실시하였을 경우 51.6%와 10.7%를 보였고, needle을 이용하여 직접 융합을 실시하였을 경우 68.9%의 융합율과 11.5%의 lysis율을 보임으로써 needle을 이용한 직접융합 방법이 유의적으로 높은 융합율을 보였다(PV0.05).
- 2%보다 유의적으로 높은 난할율을 보였다. 초기배 발달단계인 2〜4세포기의 발달율역시 needle을 사용한 구가 61.1%로 chamber를 사용한 구 54.1%보다 유의적으로 높은 차이를 보였다. 상실배 단계는 chamber를 사용한 구가 6.
- 3%보다 유의적으로 낮은 난할율을 보였다. 초기배 상태인2~4 세포기 역시 각각 54.1%, 61.1%를 보임으로써 needle방법이 유의적으로 높은 발달율을 보였다. 상실배 단계는 각각 6.
- 2%보다 약간 높았지만 유의적인 차이는 없었다. 하지만 이식 가능한 단계인 배반포배 발달율에 있어서는 needle을 사용하여 융합을 시도한 구가 26.3%로 chamber를 사용한 구 18.4%보다 유의적으로 높은 발달율을 보였다(Pv0.05).
- 7%를 보였다. 한편 Fusihira 융합기에 needle을 연결하여 체세포 주입 수정란에 직접 25V, 10p/sec로 1회 통전하여 융합을 시도했을 경우 체세포 융합율과 lysis율은 각각 68.9%, 11.5 %로 chamber를 이용하여 간접적인 전기자극을 주었을 때보다 유의적으로 높은 융합율을 보였고(P <0.05), lysis 비율은 약간 높았으나 유의적인 차이를 보이지 않았다.
후속연구
- 9%의 융합율을 보임으로써 비슷한 결과를 나타냈다. 하지만 체세포 복제수정란의 전기융합 시 전극의 거리, 전압, 통전시간, 통전회수, 배양액, 기구 등에 따라 많은 차이가 있으므로 자기 실험실 고유의 최적 세포융합 조건을 확립해야 할 것으로 생각된다.
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