[논문]감수분열 재개 동기화가 소 미성숙 난자의 체외 성숙에 미치는 영향

박종임; 장유니

감수분열 재개 동기화가 소 미성숙 난자의 체외 성숙에 미치는 영향
Effect of the Synchronization of Meiotic Resumption in Bovine Oocytes Matured In Vitro 원문보기

韓國受精卵移植學會誌 = Korean journal of embryo transfer, v.18 no.3, 2003년, pp.263 - 267

박종임 (건국대학교 수의과대학 산과학교실) , 장유니 (건국대학교 수의과대학 산과학교실)

초록
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본 연구에서 소 미성숙 난자의 성숙 배양 시 세포주기 억제제인 cycloheximide, 6-DMAP, rosco-vitine를 첨가하였을 때 난자의 감수분열이 억제제비 첨가난자에 비해 높은 비율로 germinal vesicle 기에서 정지된 것이 관찰되었다. 또한 cyclohexi-mide, 6-DMAP, roscovitine을 배지에서 제거한 후 다시 추가적인 체외 성숙 배양을 실시하여 ger-minal vesicle기에 정지된 세포주기의 진행이 재개되어 난자의 감수분열 완료 및 성숙이 세포주기억제제 비 첨가난자와 거의 동등하게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 cyclo-heximide, 6-DMAP, roscovitine의 소 미성숙 난자의 세포주기 조절작용이 가역적임을 알 수 있었으며 난자의 세포 주기 동기화에 이용할 수 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was carried out to test the efficacy of pharmacological inhibitors of the cell cycle transition in keeping bovine oocytes at the germinal vesicle(GV) stage and the reversibility of this inhibition. Bovine oocytes were incubated for 22∼24 hrs in the presence of various inhibitors : cycloheximide (2$\mu\textrm{g}$/$m\ell$), 6-DMAP (2 mM), and roscovitine (50$\mu$M). Bovine oocytes cultured with any of the inhibitors were significantly blocked at the GV stage. Reversibility of pharmacological inhibitors was assessed by culturing oocytes an additional 22∼24 hours in inhibitor-free medium. Examination of oocytes revealed that the inhibitory effect was fully reversible and effect of resuming meiotic progression on nuclear maturation varied according to the various inhibitors. This study suggests that cycloheximide, 6-DMAP and roscovitine can be applied to control meiotic arrest and resumption in maturation culture of bovine oocytes in vitro. More investigations are needed to better understand how the cell cycle of oocyte is blocked without problems to future developmental competence.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

, 2001). 본 연구에서는 GV기 상태에서 동시에 인위적인 감수분열 정지를 해제하였을 때 처리한 약제의 종류에 따라 세포 주기 진행 정도에 차이가 있음을 핵상 분석을 통해 알 수 있었으며, 이는 향후 발달 정도가 다른 난포에서 서로 다른 세포 주기 상태인 난자를 채취하여 이용하고자 할 때 감수분열 억제 작용이 있는 약제의 선별이 중요함을 나타내는 것이라고 할 수 있다. 포유류의 난자는 GnRH surge가 일어나고 감수분열 재개가 일어날 때까지 diplotene 시기에 정지되어 있으며, 난포에서 채취한 난자는 자발적으로 감수분열을 재개하고 대형 난포에서 채취한 난자일수록 작은 난포 유래의 난자에 비해 발생능이 높은 것으로 알려져 있다(Lonergan et al.
이들 세포주기 조절 약제는 다양한 작용 기전에 의해 난자의 GV breakdown (GVBD)를 저해를 유도하는 작용이 있는데(Alberio 등, 2001: Sirard 등, 1998) 본 연구에서는 cycloheximide (CHX), 6-di- methylaminopurine (6-DMAP), roscovitine# 이용하여 소 미성숙 난자에 있어서 가역적인 감수분열 저해가 핵성숙에 미치는 영향을 알아보았다.

제안 방법

약제 제거 후 22시간 체외 성숙 배양 이후에 실시하였다. 0.2 % (w/v) hyaluronidase (Sigma-Aldrich Co.)와 신속한 pipetting으로 난구세포를 제거한 후 1% aceto-orcein 염색액으로 염색하여 도립현미경 하에서 관찰하였다. 핵상에 따라 GV, GVBD, metaphase I, metaphase II로 분류하였다 (Ponderato 등, 2002).
Cycloheximide (CHX; Sigma-Aldrich Co.), 6-di- methylaminopurine (6-DMAP; Sigma-Aldrich Co.), Roscovitine (Sigma-Aldrich Co.)를 배지에 각각 2 ㎍/ml, 2 mM, 50 11M를 상기의 체외 성숙 배지에 첨가하여 5% CO₂, 20% O₂의 기상 조건으로 포화 습도 배양기에서 22~24시간 배양을 실시하였다. 이후 난자를 수 회 수정하여 상기 약제를 제거한 체외 성숙 배지에서 다시 22시간 배양하였다.
) 이 첨가된 Hepes-buffered tissue culture medium-199 (TCM 199; Life Technologies)로 3회 세정 후 체외 성숙 배양에 공시하였다. 세포주기 조절 약제 비처리 난자군은 난자 세정 후 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS; Hyclone), 1 mM Na-pyruvate, 5 IU follicular stimulating hormone (FSH, Intervet), 10 fzg/ ml estradiol (Sigma-Aldrich Co.), 10 yg/ml peni- cillin-streptomycin solution (Sigma-Aldrich Co.) 이 첨가된 성숙 배양 배지에서 39℃, 5% CO₂, 20% O₂, 기상조건인 포화 습도 배양기에서 22~24시간 배양하였다.
실체 현미경 하에서 난구세포층이 치밀하고 난 세포질이 균질하며 동등한 색조를 지닌 것만을 회수하여 실험에 공시하였다.
체외 성숙 및 감수분열 정지와 재개 후의 핵상관찰은 세포주기 저해제를 첨가하지 않은 난자는 배양 후 22~24시간 후, 세포주기 저해제 처리 난자는 약제 제거 후 22시간 체외 성숙 배양 이후에 실시하였다. 0.

대상 데이터

도축우의 난소의 직경 3~8 mm 난포에서 18 gauge 주사침으로 미성숙 난자를 흡인 채취하였다. 실체 현미경 하에서 난구세포층이 치밀하고 난 세포질이 균질하며 동등한 색조를 지닌 것만을 회수하여 실험에 공시하였다.

데이터처리

각 실험군 간의 핵상에 관한 유의성 검정은 SAS 8.12 program을 이용한 general linear model (PROC-GLM)로 실시하였다.

성능/효과

CHX, 6-DMAP 및 roscovitine을 배지에서 제거한 후 다시 22~24시간 배양하여 핵상을 관찰하여 약제에 의한 감수분열 저해가 가역적으로 해제되었는지 알아본 결과 약제 비첨가 성숙 배양군과 유사한 핵 성숙율을 나타냄을 알 수 있었다 (Table 2). CHX와 6-DMAP의 경우 roscovitine에 비해 MII로 이행한 성숙 난자의 비율이 유의적으로 높았으며 (PV0.
CHX와 6-DMAP의 경우 roscovitine에 비해 MII로 이행한 성숙 난자의 비율이 유의적으로 높았으며 (PV0.05), GV 상태로 정지된 후 세포주기가 다시 진행되었을 때 GV 상태에서 정치된 비율은 CHX로 처리한 난자에서 가장 낮게 나타났다. GVBD로의 이행도 CHX와 6-DMAP 처리 시 높게 나타났으며, MI 기로의 이행은 약제를 처리하지 않은 난자와 CHX, roscovitine처리 난자에서 높게 나타났다.
05), GV 상태로 정지된 후 세포주기가 다시 진행되었을 때 GV 상태에서 정치된 비율은 CHX로 처리한 난자에서 가장 낮게 나타났다. GVBD로의 이행도 CHX와 6-DMAP 처리 시 높게 나타났으며, MI 기로의 이행은 약제를 처리하지 않은 난자와 CHX, roscovitine처리 난자에서 높게 나타났다. 이는 CHX, 6-DMAP 및 roscovitine0] 가역적인 감수분열 저해 작용이 있음을 나타낸다고 할 수 있다.
정지된 것이 관찰되었다. 또한 cycloheximide, 6-DMAP, roscovitine을 배 지 에서 제거한 후 다시 추가적인 체외 성숙 배양을 실시하여 ger- minal vesicle기에 정지된 세포주기의 진행이 재개되어 난자의 감수분열 완료 및 성숙이 세포주기 억제제 비 첨가난자와 거의 동등하게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 cycloheximide, 6-DMAP, roscovitine의 소 미성숙 난자의 세포주기 조절작용이 가역적임을 알 수 있었으며 난자의 세포 주기 동기화에 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서 소 미성숙 난자의 성숙 배양 시 세포주가 억제제인 cycloheximide, 6-DMAP, roscovitine를 첨가하였을 때 난자의 감수분열이 억제 제비 첨가난자에 비해 높은 비율로 germinal vesicle 기에서 정지된 것이 관찰되었다. 또한 cycloheximide, 6-DMAP, roscovitine을 배 지 에서 제거한 후 다시 추가적인 체외 성숙 배양을 실시하여 ger- minal vesicle기에 정지된 세포주기의 진행이 재개되어 난자의 감수분열 완료 및 성숙이 세포주기 억제제 비 첨가난자와 거의 동등하게 나타난 것을 확인할 수 있었다.
소 미성숙 난자를 cycloheximide (CHX), 6- DMAP, roscovitine을 첨가하여 22~24시간 체외 성숙 배양을 실시한 결과 이들 약제를 첨가하지 않고 배양한 난자에 비해 핵성숙 과정이 저해되어 높은 비율의 germinal vesicle (GV)상태를 유지하고 있음을 알 수 있었다 (P<0.05)(Table 1). 이는 CHX, 6-DMAP처리한 소 난자, (Saeki et al.

후속연구

또한 cycloheximide, 6-DMAP, roscovitine을 배 지 에서 제거한 후 다시 추가적인 체외 성숙 배양을 실시하여 ger- minal vesicle기에 정지된 세포주기의 진행이 재개되어 난자의 감수분열 완료 및 성숙이 세포주기 억제제 비 첨가난자와 거의 동등하게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 cycloheximide, 6-DMAP, roscovitine의 소 미성숙 난자의 세포주기 조절작용이 가역적임을 알 수 있었으며 난자의 세포 주기 동기화에 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
(Mermillod 등, 2000). 추후 소 난자의 감수 분열의 정확한 진행 기전 및 이에 관여하는 인자에 대한 규명과 함께 세포주기 조절 약제가 난자의 초기 embryo 발생에 미치는 영향이 함께 연구되어야 할 것이다.

참고문헌 (16)

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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