[논문]Nitrone계 항산화제 (PBN)의 뇌에서 혈액으로의 배출과 뇌 수송 특성

이나영; 강영숙

문제 정의

PBN의 혈액-뇌 관문 수송 특성을 밝히기 위하여 본 연구에서는 in vivo 상태를 잘 반영하고 있는 BBB in vitro 모델인 TR-BBB 세포주12)를 사용하여 in 成m에서 구조 유사체인 [3H]choline uptake에 대한 PBN의 영향을 평가하였다. PBN의뇌 수송 특성을 알아보기 위하여 세포에서 PBN의 uptake 실험을 실시하는 것이 이상적인 방법이지만 PBN의 방사성 동위원소표식체가 시판되고 있지 않고, 염기성 약물은 amine 수송체를 통하여 BBB를 투과한다는 이전의 보고9)도 있어서 대신 구조 유사체인 [^choline을 선택하여 실험을 실시하였다.
시사하는 것이다. 그러므로 본 연구에서는 PBN의 뇌에서 혈액으로의 배출을 BEI법을 사용하여 검토하였다. BEI 법을 실시하여 얻은 PBN의 대표적인 chromatogram을 Fig.
따라서 본 연구에서는 PBN의 뇌 수송 특성을 choline 수송계와 七련하여 in vitro BBB 모델인 조건적 불사화 흰쥐 뇌 모세혈란 세포주(conditionally immortalized rat brain capillary encoihelial cell line, TR-BBB)12)< 통하여 알아보고자 하였다. 또한 BEI법을 사용하여 PBN의 뇌에서 혈액으로의 배출을 in 力机에서 검토하고자 하였다.
하였다. 또한 BEI법을 사용하여 PBN의 뇌에서 혈액으로의 배출을 in 力机에서 검토하고자 하였다. 이 때 뇌에 남아있는 PBN의 양은 hig:i performance liquid chromatography(HPLC)법으로 정량하여 깁토하였다.
검토하였다. 본 연구실에서는 BBB를 통하여 choline의 뇌에서 혈액으로의 배출 수송계가 존재한다는 것을 실험으로 증명하여 보고 중에 있으므로 본 논문에서는 pHJcholine의 뇌 배출에 관한 상세한 특성은 나타내지 않았다. 실험 결과, PBN 및 choline, choline의 대사산물이면서 GABA 수송체의 저해제인 betaine을 FH]choline과 동시에 뇌의 Par2 영역으로 투여하였다.
05인 유의적인 증가를 나타내었는데, 이것은 pHEholine의 뇌 배출이 PBN 등에 의해 억제되고 있음을 나타내고 있다(Table I). 이러한 결과는 PBN이 뇌에서 혈액으로 배출될 때에도 choline 수송계를 경유할 가능성을 시사하는 것이다. 그러나 betaine은 control과 유사한 100 - BEI(%)를 나타내어 pHkholine의 뇌 배출을 억제시키지 못하였다.

제안 방법

4)로 3번 세척하였다. 1 Ki의 FHlcholine과 0.2 |」Ci의 [“Glinulin에 choline과 PBN을 각각 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 5, 10 mM이 되도록 조제한 ECF buffer 200 以를 TR-BBB 세포에 적용하여 37°C에서 반응을 시작하였다. 5분간 반응시킨 후 적용했던 용액을 흡인제거하고 4气:의 isotope-free ECF buffer 1 血를 적용하여 반응을 멈췄다.
HPLC 분석은 Shimadzu LC-10AS gradient liquid chromato graphic system을 사용하여 실시하였고 UV detector를 사용하여 280nm에서 chromatogram을 얻었다. Column은 C₁₈ reverse phase column(CLC-ODS 5 |im, 4 mm x 250 mm)을 사용하였다.
)을 연결한 5 山 microsyringe에 취하여 Par2 영역에 2분간 적용하였다. Injectate 를 투여하고 40분 후에 단두하여 뇌를 꺼내고 위와 같은 방법으로 방사활성을 측정하였다.
0 mm의 구멍을 만들어 놓았다. Injectate는 PBN lmg을 DMSO로 용해시키고 PEG 200과 ECF buffer로 잘 혼합하여 전체가 가 되도록 조제하였는데, 이 때 사용한 DMSO는 전체량의 1%가 되도록 하였다. 조제한 injectate 중 0.
)에 취하여 미리 만든 구멍을 통해 흰쥐의 P云2 영역에 2분간 적용하였다. Injectate를 순시에 주입하고 2, 5, 10분 후에 단, 두하여 동측의 뇌를 적출한 다음, 생리완충액(PB, 10mM HEPES, 141 mM NaCl, 4mM KC₁, 2.8 mM CaCl2, ImM MgSO₄, 1 mM NaH₂PO₄, 10 mM D-glucose, pH 7.4) 500 卩/> 넣고 균질화한 후 chloroform 3 m/를 넣어 5분간 추출하였다. 추출액 중 유기층만을 취하고 N₂ gas를 적용하여 유기용매를 완전히 날린 후 acetonitrile 200 )1/에 녹여 pore size가 0.
뇌로부터 배출된 약물의 양은 주입한 약물의 양에서 뇌에 남아있는 약물의 양을 뺀 것과 같으며 , BBB를 통과할 수 없는 표준물질을 약물과 동시에 뇌로 투여하여 뇌에 남아있는 약물의 양을 보정할 수 있도록 하였다. 그러므로 위의 수식은 다음과 같은 식으로 바꾸어 표현할 수 있다.
또한 PBN의 뇌에서 혈액으로의 배출 수송계와 choline의 배출 수송계와의 관계를 알아보기 위하여 in vitro 실험에서와 마찬가지로 PBN을 대신하여 [3H]choline2] 뇌 배출을 BEI법을 사용하여 검토하였다. 본 연구실에서는 BBB를 통하여 choline의 뇌에서 혈액으로의 배출 수송계가 존재한다는 것을 실험으로 증명하여 보고 중에 있으므로 본 논문에서는 pHJcholine의 뇌 배출에 관한 상세한 특성은 나타내지 않았다.
뇌 배출에 미치는 영향을 살펴보았다. 먼저 choline, PBN 및 betaine을 각각 50, 10, 100 mM의 농도로 함유하는 0.5 但 ECF buffer에 [3H]choline (80nCi)과 [“Clinulin을 (4nCi)를 녹여 injectate를 만들었다. 이들 injectate 0.
)를 人]용하여 여과하고 그 중 100B를 HPLC에 적용하였다. 본 실험에서는 BBB를 통과하지 못하는 표준 물질로 im血을 사용하는 대신 논문에 보고되어진 값을 근거로 하여 咧 표준 물질의 뇌내 농도를 보정하여 계산하였다.
5분간 반응시킨 후 적용했던 용액을 흡인제거하고 4气:의 isotope-free ECF buffer 1 血를 적용하여 반응을 멈췄다. 세포들을 IN NaOH 750B로 녹이고 그 중 50B를 사용하여 DC protein assay kit에 적용하여 protein량을 정량하였고 나머지 500 B를 취 하여 scintillation cocktail인 Hionic-F 5 mZ와 잘 혼합하여 방사활성을 측정하였다.
본 연구실에서는 BBB를 통하여 choline의 뇌에서 혈액으로의 배출 수송계가 존재한다는 것을 실험으로 증명하여 보고 중에 있으므로 본 논문에서는 pHJcholine의 뇌 배출에 관한 상세한 특성은 나타내지 않았다. 실험 결과, PBN 및 choline, choline의 대사산물이면서 GABA 수송체의 저해제인 betaine을 FH]choline과 동시에 뇌의 Par2 영역으로 투여하였다.
5 但 ECF buffer에 [3H]choline (80nCi)과 [“Clinulin을 (4nCi)를 녹여 injectate를 만들었다. 이들 injectate 0.5 B를 위에서 언급한 방법과 동일하게 needle (100 |im i.d., 350 pm o.d.)을 연결한 5 山 microsyringe에 취하여 Par2 영역에 2분간 적용하였다. Injectate 를 투여하고 40분 후에 단두하여 뇌를 꺼내고 위와 같은 방법으로 방사활성을 측정하였다.
Injectate는 PBN lmg을 DMSO로 용해시키고 PEG 200과 ECF buffer로 잘 혼합하여 전체가 가 되도록 조제하였는데, 이 때 사용한 DMSO는 전체량의 1%가 되도록 하였다. 조제한 injectate 중 0.5 世를 needle(100 |im i.d., 350 |im o.d., Natume Co.)을 연결한 5 山 microsyringe(Hamilton Co.)에 취하여 미리 만든 구멍을 통해 흰쥐의 P云2 영역에 2분간 적용하였다. Injectate를 순시에 주입하고 2, 5, 10분 후에 단, 두하여 동측의 뇌를 적출한 다음, 생리완충액(PB, 10mM HEPES, 141 mM NaCl, 4mM KC₁, 2.
한편 BEI법을 사용하여 choline, PBN 및 betaine이 [3H]choline 의 뇌 배출에 미치는 영향을 살펴보았다. 먼저 choline, PBN 및 betaine을 각각 50, 10, 100 mM의 농도로 함유하는 0.
흰쥐에 ketamine(100 mgkg)과 xylazine(2 m以kg)을 근육 주사하여 마취시키고 stereotaxic frame(Stoelting Co.)에 고정시킨 후두개골을 노출시키고 bregma로부터 lateral로 5.5 mm, anterial 로 0.2 mm의 위치에 dental drill(Eicom Co.)로 1.0 mm의 구멍을 만들어 놓았다. Injectate는 PBN lmg을 DMSO로 용해시키고 PEG 200과 ECF buffer로 잘 혼합하여 전체가 가 되도록 조제하였는데, 이 때 사용한 DMSO는 전체량의 1%가 되도록 하였다.

대상 데이터

280nm에서 chromatogram을 얻었다. Column은 C₁₈ reverse phase column(CLC-ODS 5 |im, 4 mm x 250 mm)을 사용하였다. HPLC 이동상은 A액과 B액을 각각 0.
에서 구입하여 사용하였다. [methyl-3H]Choline chloride (Fh choline, 86.0 Ci/mmol) 과 [carboxy-14C]inulin ([14C]inulin, 1.92mCi/g)은 NEN Life Science(부경사(주))에서 구입하였다. 마취 제로 사용한 염산 ketamine은 유한양행(주) 제품을, 근이완제인 xylazine은 Sigma Co.
에서 구입하였다. 기타 dimethyl sulfoxide(DMSO), polyethylene glycol 200(PEG 200) 등의 시약은 일급 이상의 제품을 덕산이화학(주)에서 구입하여 사용하였다.
실험돔물

실험동물로는 Sprague-Dawley(SD)계 수컷 흰쥐를 셈타코(주) 에서 구입하여 일주일간 동물실에서 사육하여 8주령된 약 250〜 30( 의 흰쥐를 사용하였다. 동물실험실 온도는 22~25°C, 습도는 =0-60%, 조명시간은 12시간으로 자동조절이 되도록 하였다.

데이터처리

)로 표시하였다. 두 그룹간 유의성은 student's t-testS. 계산하고 p<0.

이론/모형

TR-BBB 세포주는 temperature-sensitive SV40 large T- antigen gene을 harboring한 transgenic rat에서 이미 보고된 논문의 방법12)으로 수립하였다. TR-BBB 세포는 33°C, 95% 02, 5% C02 조건하에서 20 mM NaHCO₃, 2 mM L-glutamine, 15 ng/ml endothelial cell growth factor, 100 U/m/ benzyl peni cillin, lOOmg/mZ streptomycin sulfate, 10% fetal bovine ser- um을 포함하는 dulbecco's modified eagle's mediuin(DMEM)에서 배양시켰다.
또한 BEI법을 사용하여 PBN의 뇌에서 혈액으로의 배출을 in 力机에서 검토하고자 하였다. 이 때 뇌에 남아있는 PBN의 양은 hig:i performance liquid chromatography(HPLC)법으로 정량하여 깁토하였다.

성능/효과

3분에서 PBN의 peak를 얻을 수 있었다. HPLC chromatogram 의 결과를 바탕으로 뇌에서의 PBN의 표준 검량선을 작성한 결과 직선 상관 계수가 §=0.936인 회귀직선을 얻을 수 있었고 이 직선을 사용하여 적출한 뇌에서의 PBN의 농도를 정량하였다.
5에 나타내었다. 그 결과 대부분의 PBN。] 투여 후 10분 이내에 뇌로부터 소실되었고, 그 때의 PBN의 Keff 값은 0.32/min, 반감기는 2.2분으로 매우 빠른 속도로 소실되는 것을 알 수 있었다. 그러나 본 실험에서는 PBN의 steady-state에서의 뇌 분포용적을 구하지 않았기 때문에 PBN의 뇌투과와 뇌 배출간의 정확한 차이를 비교할 수는 없었다.
뇌내에 축적되는 것을 알 수 있다.° 또한 cerebral endotheilal cell에서 uptake 실험을 실시하였을 때 PBN은 nicotine보다도 높은 뇌 투과 상수를 나타내었다戶 그리고, 본 연구실에서 이미 보고한 논문에서 PBN이 정맥투여 후 2시간까지 높은 뇌 이행량을 나타내는 것을 알 수 있었다.7)
그 결과 뇌에 남♦아있는『HJchoIine의 양{100-BEK%)}은 control과 비교하였을 때 PBN, choline에서 각각 33%, 36% 증가하여 p<0.05인 유의적인 증가를 나타내었는데, 이것은 pHEholine의 뇌 배출이 PBN 등에 의해 억제되고 있음을 나타내고 있다(Table I). 이러한 결과는 PBN이 뇌에서 혈액으로 배출될 때에도 choline 수송계를 경유할 가능성을 시사하는 것이다.
농도 의존적인 특이적인 저해 현상을 나타내었다. 또한 BBB 를 통한 PBN의 뇌 배출은 뇌에서 혈액으로 아주 빠르게 배출되었으며, PBN의 뇌 투과와 뇌 배출 수송은 choline 수송계에 인식되어 수송될 가능성을 시사하였다.
본 연구 결과, PBN은 TR-BBB 세포에서 구조 유사체인 choline의 수송을 유의적으로 저해하였으며 이와 같은 저해작용은 농도 의존적인 특이적인 저해 현상을 나타내었다. 또한 BBB 를 통한 PBN의 뇌 배출은 뇌에서 혈액으로 아주 빠르게 배출되었으며, PBN의 뇌 투과와 뇌 배출 수송은 choline 수송계에 인식되어 수송될 가능성을 시사하였다.
秆.한, 본 연구실에서 실험한 결과, PBN은 투여 초기에 매우높5 뇌 투과량를 나타내었으나 약물투여 후 2시간에서는 뇌 투과专이 약 80배 이상 감소하는 것을 알 수 있었다.7)이와 같이 PBN 의 뇌 분포가・ 감소하는 것은 PBN이 빠르게 뇌로 분포된 후다, ' 뇌에서 혈액으로 배출될 가능성을 시사하는 것으로 사료된다.

후속연구

또한 이와 같은 PBN의 빠른 소실은 PBN이 뇌에서 혈액으로 배출될 뿐만 아니라 뇌에서 대사됨을 통해 소실될 가능성도 배재할 수 없다. 여러 보고에서 PBN은 여러 종류의 radical과 빠르게 반응하여 안정한 화합물로 변화된다고 알려져 있는데, PBN이 간에서 hydroxyl radical과 결합하여 주로 4-hydroxyPBN로 대사된다는 보고가 있고, ")허혈 상태의 뇌에서 PBN。] hydroxyl radical과 결합하여 3, 4』ihydro- benzoate 등으로 변화된다는 보고도 있다.")그러므로 PBN의 뇌 배출 기전에 대해서는 방사성 동위원소와 대사체 등을 사용하여 앞으로 더 상세한 연구가 수행되어야 할 것이다.
이러한 결과는 흰쥐 뇌 모세힐관 내피세포주(rat brain capillary endothelial ceil line)인 REE4 세포에서 실험하였을 때 얻은 choline의 IC^인 12 pM13) 과 우사한 값으로 TR-BBB에서의 choline의 수송이 carrier에 의해서 수송되고 있음이 잘 나타나고 있다. 이러한 결과들은 PBN 이 EBB의 특수 수송계인 amine 수송계를 통해 뇌내로 수송될 가능 싱을 시사하고 있지만, 앞으로 PBN의 수송과 choline 수송계와의 저해 특성 등에 대해서 약물측에서 더욱 상세한 연구가 진행되어야 할 것이다.

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