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문제 정의
- 최근 이러한 민간에서 쓰이고 있는 천연물의 유효 활성 성분을 추출하여 분리된 물질들로 여러 염증 인자들의 생성억제를 검색 및 기전 연구를 통해 새로운 항염제개발이 많이 시도되고 있다. 이에 본 연구는 우묵사스레피 (E?切舛 刼翊写:滋&?)의 추출물 및 분획물로부터 LPS로 활성화된 RAW 64.7 세포에서 NO의 생성억제 효과 및 TNF-a, IL-6, Ⅱ.-邱외 같은 pro-inflammatory cytokine에 미치는 영향을 조사하였으기 뜨한 iNOS, COX-2의 생성 및 활성저해 정도를 검색하였다
- 이에 본 실험에서는 항산화 작용 및 항염 작용이 prostaglangins 합성의 저해 및 TNF-a와 같은 cytokine의 억제와 관련이 있을 것으로 사료되어짐에 따라서, 우묵사스레피의 추출물이 염증반응의 주체가 되는 대식세포 모델계에서 LPS로 유도된 TNF-a, IL-6, IL-邱와 같은 pro-inflammatory cytokine과 iNOS 및 COX-2의 발현 억제 효과를 알아 보았다.
제안 방법
- 7 세포에서 NO의 생성억제 효과 및 TNF-a, IL-6, Ⅱ.-邱외 같은 pro-inflammatory cytokine에 미치는 영향을 조사하였으기 뜨한 iNOS, COX-2의 생성 및 활성저해 정도를 검색하였다
- 97이 되도록 에탄올로 희석하여 10초간 진탕시춧 그리고, 용매 lm;에 분말로 추출된 시료 lmg을 섞은 후 恁분히 녹이고, 준비된 DPPH 450 B에 시료용액 50 W를 넣어 I 은 후 실온에서 10분간 방치하였다가 517nm에서 흡광도를 T 정 하였다. 대조군으로는 butylated hydroxy anisole(BHA), 비C, 비타민 E, 소나무 추출물인 pycnogenol 등을 사용하였] , 항산화효과는 DPPH의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 耳체의 농도(RC50)로 표시하였으며, 각 시료는 3회 반복하여 실흔을 실시하여 평균값을 구하였다.
- 5xlO5 cells/mZ 로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 시료 농도 100 jig/m/과 LPS 11丄以m® 동시에 처리하여 48시간 배양하였다. 생성된 NO 의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2 의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100W와 Griess 시약 [l%(w/v) sulfanilamide, 0.
- 생성된 NO 의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2 의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100W와 Griess 시약 [l%(w/v) sulfanilamide, 0.1%(w/v) naphylethylenediamine in 2.5%(v/v) phosphoric acid] 100 也를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 540nm는 ELISA reader를 이용하여 측정하였으며, sodium nitrite(NaNC)2)를 standards.
- Total RNA 추출은 TRI-reagent(MRC)를 이용하였으며, RNase-free한 조건하에서 이루어졌다. 1熙의 Total RNA 를 oligo (dT)18 primer, dNTP(0.5 卜1M), 1 unit RNase inhibitor 그리고 M-MuEV reverse transcriptase(2U)로 70℃ 5 min, 37℃ 5 min, 37℃ 60 min, 그리고 70℃에서 10 min heating 시킴으로서 반응을 중지시켰다.
- Polymerase Chain Reaction(PCR)은 합성된 cDNA로부터 TNF-a, IL-6, IL-lp, iNOS, COX-2, "Actin를 증폭시키기 위하여 2 以 cDNA, 4 皿의 S과 3' primer, 10xbuffer(10 mM Tns-HC1, pH 8.3, 50 mM KC1, 0.1% Triton X-100), 250 pM dNTR 25mM MgCl2, limit Taq polymerase(Promega, USA) 를 섞고 distilled water로 전체를 25B로 맞춘 다음 Perkin-Elmer Thermal Cycler를 이용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 조건은 94℃/45초, 55~60℃/45초, 72℃/60초, 35회이며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.
- 1% Triton X-100), 250 pM dNTR 25mM MgCl2, limit Taq polymerase(Promega, USA) 를 섞고 distilled water로 전체를 25B로 맞춘 다음 Perkin-Elmer Thermal Cycler를 이용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 조건은 94℃/45초, 55~60℃/45초, 72℃/60초, 35회이며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동을 실시하고 ethidium bromide로 염색하여 특정 band을 확인하였다. 본 실험의 RT-PCR에 사용된 primer는 Table I에 제시하였다.
- 1% Tween 20) 용액에서 상온에서 2시간 동안 실시하였다. iNOS의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 antimouse iNOS(l: 1000)(Santa-Cruz» COX-2의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-rabbit COX-2(1:1000)(Santa-Cmz)을 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP(Horse Radish Peroxidase) 가 결합된 anti-mouse 또는 anti-rabbit IgG(Amersham Co.
- 우묵사스레피의 80% MeOH 추출물과 각각의 용매분획 물을 기존에 잘 알려져 있는 합성 항산화제인 BHA와 천연 항산화제인 비타민 C, E 및 소나무 추출물인 pycnogenol을 대조 군으로 하여 DPPH radical 소거법에 의한 항산화활성 실험을 실시하였다. 실험결과 합성 항산화제인 BHA와 천연 황산화제인 비타민 C, 비타민 E, 소나무 추출물인 pycnogenol의 1«危값과 비교해보면 EtOAc 분획물, BuOH 분획물, EF 5-4-6, EF 5-4-7, BF 1 에서는 각각 10.
- 7와 같은 macrophage 또는 monocyte에서 TNF-a, IL-6, IL-ip와 같은 pro-inflammatory cytokine을 증가시키는 것으로 알려져 있다." 1 曲/ng LPS를 사용하여 RAW 264.7 세포로부터 이러한 cytokine의 발현 정도를 RT-PCR를 통해 알아보았다. 본 실험에 사용된 우묵사스레피 시료(lOOgg/m/) 단독 처리시에는 cytoki眼이 발현되지 않았으며, 세포독성 시험 결과도 :험에 사용된 농도에서는 세포독성을 나타내지 않았다(data not shown).
- 3). IFN-7(50U/m/) 및 LPS(lpig/mT)를 사용하여 RAW264.7 세포에서 iNOS와 COX-2의 생성을 유도한 후 우묵사스레피에 의한 저해 정도를 Western blot를 통해 알아 보았다. 그 결과 EtOAc 분획물과 n-BuOH 분획물에서 iNOS와 COX-2의 단백질 발현이 현저히 저해되는 것을 확인할 수 있었으며 (Fig.
- Macrophage RAW 264.7 세포에서 염증성 cytokine 억제 효과를 mouse ELISA kit를 이용하여 정량하였다. 그 결과 TNF-a 생성억제는 EF 5-4-6-3-2, EF 5-4-6-3-3, EF 5-4-7, BF 1에서 각각 24.
- 최근 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 nitric oxide(NO) 생성에 대한 효과를 알아보기 위해 Murine macrophage cell line인 RAW264.7 세포에 LPS와 우묵사스레피의 추출물 및 분획물을 동시 처리하여 그 생성억제 정도를 알아보았다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO?의 형태로 측정하였다.
- 23)생체는 이러한 활성 산소종의 독성으로 부 : 자기를 보호하기 위하여 superoxide dismutase(SOD), pero: i let POD), catalase(CAT) 등의 항산화 효소와 ascorbic acid, c -tocopherol, glutathione 등의 항산화물질을 생산한다.2纽5) 우묵、스레피의 80% MeOH 추출물과 각각의 용매분획물 및 subfrntion들을 기존에 잘 알려져 있는 합성 항산화제인 BHA와 천연 항산화제인 비타민 C, E 및 소나무 추출물인 pycnogenol 을 디 土군으로 하여 DPPH radical 소거법에 의한 항산화활성 실험을 시시하였다. 실험 결과 EtOAc 분획물, BuOH 분획물, EF 5-4-t, EF 5-4-7, BF 1에서 높은 항산화활성을 보였다.
대상 데이터
- 저 그도에 자생하고 있는 우묵사스레피의 잎을 채집하여 음건한 다으 마쇄기로 갈아 미세말로 하였다. 미세말 시료(175.
- Murine macrophage cell line인 RAW264.7 세포는 KCLB (Kore an Cell Line Bank)로 부터 분양 받아 100 units/m/ penicillir - streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 녀대 배양은 3~4일에 한번씩 시행흐}였다. Lipopolysaccharide (LPS.
- 7 세포는 KCLB (Kore an Cell Line Bank)로 부터 분양 받아 100 units/m/ penicillir - streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 녀대 배양은 3~4일에 한번씩 시행흐}였다. Lipopolysaccharide (LPS. E. coli serotype 0111: B4)는 Sigma로부터 구입 하 여사분 하였으며, Interferon-emlFN-y, recombinant E. 는 Rocw로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
- Murine macrophage cell line 인 RAW264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.0X 106 cells/m血로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO2 항온기에서 18시간 전배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 10배 농도(lmg/m/)로 조제된 시험물질 50 W와 450 B의 LPS 최종농도 (1 (ig/mZ)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 전배양과 동일 조건에서 배양하였다.
- RAW264.7 세포(LOX106 cells/m/)< DMEM 배지를 이용하여 5% CO2 항온기에서 18시간 전배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 10배 농도(lmg/ml)로 조제된 시험물질과 LPSd와 INFt(50U/m/)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 전 배양과 동일 조건에서 배양하였다.
- 7 세포로부터 이러한 cytokine의 발현 정도를 RT-PCR를 통해 알아보았다. 본 실험에 사용된 우묵사스레피 시료(lOOgg/m/) 단독 처리시에는 cytoki眼이 발현되지 않았으며, 세포독성 시험 결과도 :험에 사용된 농도에서는 세포독성을 나타내지 않았다(data not shown). LPS 자극과 함께 처리하여 TNF-a, IL-6, IL-lp 생성 억제에 대한 우묵사스레피의 용매분획물을 100|ig/m/ 농도로처리호]■였을 때 TNF-a 생성 억제는 EtOAc 분획물에서 다소 억제 효과를 나타냈으며 , IL-6 생성 억제는 EtOAc 분획물이, Ⅱ.
성능/효과
- 실험결과 합성 항산화제인 BHA와 천연 황산화제인 비타민 C, 비타민 E, 소나무 추출물인 pycnogenol의 1«危값과 비교해보면 EtOAc 분획물, BuOH 분획물, EF 5-4-6, EF 5-4-7, BF 1 에서는 각각 10.9 I回ml, 12.7 (xg/mZ, 9.93 |丄以m/, 10.09 |ig/m/, 9.09 gg/in/ 정도의 높은 항산화활성을 보였다(Eble II).
- LPS 자극과 함께 처리하여 TNF-a, IL-6, IL-lp 생성 억제에 대한 우묵사스레피의 용매분획물을 100|ig/m/ 농도로처리호]■였을 때 TNF-a 생성 억제는 EtOAc 분획물에서 다소 억제 효과를 나타냈으며 , IL-6 생성 억제는 EtOAc 분획물이, Ⅱ.-1P 생성 억제는 n-BuOH 분획물에서 억제 효과를 보였다(Fig. 1. ) Subfraction에서는 EF 5-4-6-3-2과 BF 1에서 TNF-a 뿐만 아니라 IL-6, IL-고에서도 아주 높은 억제 효과를 보였으며 (Fig. 2), iNOS와 COX-221 경우도 높은 억제 효과를 보였다(Fig. 3). IFN-7(50U/m/) 및 LPS(lpig/mT)를 사용하여 RAW264.
- 7 세포에서 염증성 cytokine 억제 효과를 mouse ELISA kit를 이용하여 정량하였다. 그 결과 TNF-a 생성억제는 EF 5-4-6-3-2, EF 5-4-6-3-3, EF 5-4-7, BF 1에서 각각 24.84%, 16.77%, 13.39%, 19.35%의 억제 효과를 보였으며, IL-6 생성억제는 각각 24.67%, 12.1%, 11.71%, 46.14%를, IL-邱에서는 각각 24.65%, 15.21%, 14.82%, 44.32%의 생성억제 효과를 나타내었다(Fig. 6).
- 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO?의 형태로 측정하였다. 실험결과 EtOAc 분획물, n-BuOH 분획물, EF 5-4-6-3-2, BF 1에서 대조군인 LPS 단독처리 군에 비해 높은 NO 생성 억제효과를 관찰할 수 있었다 (Fig. 7).
- 2纽5) 우묵、스레피의 80% MeOH 추출물과 각각의 용매분획물 및 subfrntion들을 기존에 잘 알려져 있는 합성 항산화제인 BHA와 천연 항산화제인 비타민 C, E 및 소나무 추출물인 pycnogenol 을 디 土군으로 하여 DPPH radical 소거법에 의한 항산화활성 실험을 시시하였다. 실험 결과 EtOAc 분획물, BuOH 분획물, EF 5-4-t, EF 5-4-7, BF 1에서 높은 항산화활성을 보였다. 여기서 얻은 결고'를 통해 subfraction를 결정 하였다.
- -1|3와같은 : >ro-inflammatory cytokine의 억제 효과 및 iNOS의 발현, CC以 .:!의 생성 및 활성저해 정도를 알아본 결과, 우묵사스레피의 추출 * 및 분획물들이 다소 차이는 있었지만 EtOAc 분획물에서 얻은 subfraction EF 5-4-6-3-2과 n-BuOH subfraction 인 BF 1 이 TMF-a, IL-6, IL-고에서 높은 생성 억제 효과를 나타냈으며, iNOS”] 발현 및 COX-2의 생성억제 효과도 나타냈다. 또한 염증 유발 >| 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 nitric oxide(NO) 생성에 可한 효과를 측정하였는데, 71 결과 EtOAc 분획물(EF 5-4-6)<1'서 언은 subfraction EF 5-4-6-3-2과 n-BuOH subfraction 인 1에서 높은 NO 생성억제 효과를 관찰할 수 있었다.
- :!의 생성 및 활성저해 정도를 알아본 결과, 우묵사스레피의 추출 * 및 분획물들이 다소 차이는 있었지만 EtOAc 분획물에서 얻은 subfraction EF 5-4-6-3-2과 n-BuOH subfraction 인 BF 1 이 TMF-a, IL-6, IL-고에서 높은 생성 억제 효과를 나타냈으며, iNOS”] 발현 및 COX-2의 생성억제 효과도 나타냈다. 또한 염증 유발 >| 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 nitric oxide(NO) 생성에 可한 효과를 측정하였는데, 71 결과 EtOAc 분획물(EF 5-4-6)<1'서 언은 subfraction EF 5-4-6-3-2과 n-BuOH subfraction 인 1에서 높은 NO 생성억제 효과를 관찰할 수 있었다. 이러한 긴 나는 항산화 효과를 갖는 분획물일수록 TNF-a, IL-6, Ⅱ.
- 7 세포에서 iNOS와 COX-2의 생성을 유도한 후 우묵사스레피에 의한 저해 정도를 Western blot를 통해 알아 보았다. 그 결과 EtOAc 분획물과 n-BuOH 분획물에서 iNOS와 COX-2의 단백질 발현이 현저히 저해되는 것을 확인할 수 있었으며 (Fig. 4), 또한 subtraction EF 5-4-6-3-2과 BF 1에서도 RT-PCR 결과와 마찬가지로 현저히 iNOS의 단백질 발현이 저해됨을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
후속연구
- 09 g), H2O 분획(E '59g)을 얻었다. 여기서 얻은 각각의 추출물 및 분획물을 항신하 작용 및 염증성 cytokine 억제효과 검색의 시료로 사용하免 다(Scheme 1).
- 2。-兰 보아 이에 따른 PGE;;의 형성도 감소된 것으로 사註 되는 4 염증억제의 promoter로 알려진 NF-kB같은 유전자 발현 조 실 등의 연구도 수반되어야 될 것으로 여겨진다.
- 본 실험결과를 요약하면, 우묵사스레피의 EtOAc 분획물에서 얻은 subfraction EF 546-3-2과 n-BuOH subfraction인 BF 1 에서 높은 항산화 효과, TNF-a, IL-6, IL-邛 형성억제 및 iNOS, COX-2의 발현억제를 나타냈으며, 이러한 결과는 우묵사스레피에서의 유효성분 추출을 통한 항염증 물질의 암예방제 연구 또는 예방하거나 치료할 수 있는 염증 억제 성분의 분리 및 그 작용기전 연구에 중요한 기초 자료가 될 것이라 사료된다.
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