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제안 방법
- 5 ml 씩 모아서 효소 활성측정을 통하여 nitroreductase가 포함된 용출액을 분리하였고, 분리한 용액은 Bradford 방법⑵을 응용하여 단백질 정량을 실시하였으며, bovine serum albumin (BSA)으로 표준곡선을 작성하였다. 1ml의 Bradford 용액에 각각 10, 20, 30 ㎍의 BSA를 첨가하여 5분간 반응 후 595 nm에서 홉 광도를 측정하여 표준곡선을 작성하였고, 측정하고자 하는 단백질 시료는 표준곡선의 흡광도의 범주를 벗어나지 않도록 첨가한 후, 홉 광도를 측정하여 정량을 실시하였다.
- Crude extract 상태의 효소 용액을 40-60% ammonium sulfate 침전을 통하여 단백질의 양을 절반으로 줄였고, DEAE-sepharose, Q-sepharose column을 실시하여 nitroreductase# 분리 및 정제하였으며, 이 후 세 개의 다른 fractions이 나타남을 확인하였다(Fig. 2). Nitroreductase를 정제하는 일반적인 방법은 acetone이나 ammonium sulfate로 포화시킨 용액에서 단백질을 침전시킨 후음이 온의 성질을 가진 nitroreductase# 정제하기 위하여, DEAE 나 DE52, Mono Q 등의 음이온 교환 chromatography를 이용하는 것이었으나<4, 5), 본 연구에서는 분리세균 OK-5로부터 nitroreductase 정제하는 과정에서 acetone 침전을 실시하지 않고, ammonium sulfate 침전을 이용한 일련의 과정을 통하여 순수한 nitroreductase# 분리하였다.
- 0에서의 효소 활성은 50 mM potassium phosphate buffer 에서 측정하였고, pH 7, 5~120에서의 활성측정은 50mM Tris- HCl buffer를 이용하여 활성 측정을 실시하였다. H/+, Ag+, Cu2\ Ca2+, Mn2+, Fe2+ 등의 금속에 의한 nitroreducatse의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)에 각각 10 mM의 금속을 첨가하고, 실온에서 5분간 방치 후에 200μl의 0.1 mM TNT와 10μl의 0.2 mM NADH 용액 및 분리된 효소용액을 첨가하였으며, 반응은 실온에서 1분간 실시한 후에 흡광도를 측정하였다.
- 의해서 활성 측정을 실시하였다. Nitroreductase 활성측정은 Tris-HCl buffer(50mM, pH 7.5)에 기질로 TNT (0.1 mM), NADH(0.2mM)와 정제한 nitroreductase를 최종 1 ml로 맞추어 첨가한 후 분광광도계를 이용하여 340 nm에서 NADH (Sigma)가 산화되면서 1분 동안 감소되는 값을 측정하였다. 반응 산물인 NADH의 몰 흡광계수 (molar extinction coefficient)는 6, 300 M-1cm-1이며, 1 imit은 25P에서 분당 1 mole의 NADH가 산화되는 양으로 정하고, 비활성(specific activity)은 unit/mg으로 정하였다.
- 2). Nitroreductase를 정제하는 일반적인 방법은 acetone이나 ammonium sulfate로 포화시킨 용액에서 단백질을 침전시킨 후음이 온의 성질을 가진 nitroreductase# 정제하기 위하여, DEAE 나 DE52, Mono Q 등의 음이온 교환 chromatography를 이용하는 것이었으나<4, 5), 본 연구에서는 분리세균 OK-5로부터 nitroreductase 정제하는 과정에서 acetone 침전을 실시하지 않고, ammonium sulfate 침전을 이용한 일련의 과정을 통하여 순수한 nitroreductase# 분리하였다. 또한, nitroreductase의 등전점이 낮은 pH에서 나타나는 것으로 알려져 있어 다양한 음이온 교환체 chromatography를 이용한 분석 결과 여러 개의 peak들이 나타난다고 보고된 바 있다(4, 7).
- Nitroreductase의 활성에 영향을 미치는 요인으로 pH, 온도, 그리고 금속의 첨가에 따른 효소 활성을 측정하여 비교하였다. 효소 활성의 최적 온도를 알아보기 위하여, 반응온도를 10~5(TC 로 변화를 시키면서 효소활성을 측정하였다.
- 본 연구에서는 세균의 생장에서 TNT를 기질로 이용하는 Stenotrophomonas sp. OK-5를 TNT가 포함된 최소배지에 배양한 후, 분해에 관여하는 효소인 NAD(P)H-nitroreductase (fractions I, II, 및 III)를분리 및 정제하고 SDS-PAGE를 통하여 각각의 분자량을 확인하였으며, 온도와 pH, 그리고 여러 가지 금속의 첨가가 이들 효소에 미치는 영향에 대하여 조사하였다.
- 침전된 균체를 4 ml의 50 mM Tris-HCl로 재현탁한 후, sonicator (Fisher M-300, Pittsburgh, USA)를 이용하여 파쇄하였다. Sonication은 30초 간격으로 25회 실시하였다. 파쇄한 용액은 8, 700 X g로 4℃에서 20분간 원심분리하여 상등액을 취하였다.
- TNT에 오염된 토양으로부터 농화 배양을 통하여 TNT 분해 세균 OK-5를 분리하였다. 균주 OK-5는 Biolog 시험과 생리 생화학적 시험을 통하여 Stenotrophomonas 종으로 동정되었으며, Stenotrophomonas sp.
- 1% Coomassie blue R-250, 45% methanol, 10% glacial acetic acid)으로 2시간 염색을 실시하였고. gel destaining solution I (10% methanol, 10% glacial acetic acid)로 1시간 동안 처리한 후, gel destaining solution II (5% methanol, 7% glacial acetic acid)로 8시간 처리하였다.
- 따라서, 본 실험에서도 FMN이 효소 활성을 증가시킬 수 있는 조효소 역할을 하는 것으로 확인되었다. 각 정제단계에서 분리된 효소 용액의 단백질 정량과 NADH를 이용한 효소 활성 측정을 실시하여 효소의 단계별 분리표를 작성하였다(Table 1). 정제된 nitroreductase (fractions I, II, IU)의 specific activity는 각각 5.
- 효소 반응은 순환 온도 장치를 이용하여 해당되는 온도를 맞추었다. 각각의 온도에 해당하는 반응용액을 사용하여 1분간 반응 후에 340nm에서 흡광도 측정을 하였으며, 최대 흡광도 값을 100% 기준으로 상대적 활성을 측정하였다. 효소활성의 최적 pH를 조사하기 위하여, pH 5.
- 금속에 의 한 nitroreductase (fractions I, U, 및 III)의 효소 활성 저해 효과를 알아보기 위해서 다양한 금속 이온들을 첨가하여 활성을 조사하였다. 먼저 nitroreductase fraction I은 HgCl2, AgNO3 와 CuSQ에 의해서 각각 26.
- 약 6, 300xg 에서 20분간 원심분리하여 침전물은 제거하고, 상등액을 취하였다. 다시 상등액에 L 당 130 g의 ammonium sulfate를 위와 같은 방법으로 첨가하여 60% 포화 ammonium sulfate를 만들었고, 6, 300 X g에서 20분간 원심분리하여 침전물을 취하였다. 침전물은 0.
- 5X20 cm)에 주입하였다. 단백질은 1 M의 NaCl 농도로 약 40분 동안 분취기로 2.5 ml 씩 모아서 효소 활성측정을 통하여 nitroreductase가 포함된 용출액을 분리하였고, 분리한 용액은 Bradford 방법⑵을 응용하여 단백질 정량을 실시하였으며, bovine serum albumin (BSA)으로 표준곡선을 작성하였다. 1ml의 Bradford 용액에 각각 10, 20, 30 ㎍의 BSA를 첨가하여 5분간 반응 후 595 nm에서 홉 광도를 측정하여 표준곡선을 작성하였고, 측정하고자 하는 단백질 시료는 표준곡선의 흡광도의 범주를 벗어나지 않도록 첨가한 후, 홉 광도를 측정하여 정량을 실시하였다.
- 2mM)와 정제한 nitroreductase를 최종 1 ml로 맞추어 첨가한 후 분광광도계를 이용하여 340 nm에서 NADH (Sigma)가 산화되면서 1분 동안 감소되는 값을 측정하였다. 반응 산물인 NADH의 몰 흡광계수 (molar extinction coefficient)는 6, 300 M-1cm-1이며, 1 imit은 25P에서 분당 1 mole의 NADH가 산화되는 양으로 정하고, 비활성(specific activity)은 unit/mg으로 정하였다.
- 5)를 2 ml/min의 유속으로 용액을 용출하였다. 용출액은 nitroreductase의 활성이 높은 부분을 확인하여 단백질 정량을 실시하였고, 다시 Q-sepharose (Amersharm Phamacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) column (2.5X20 cm)에 주입하였다. 단백질은 1 M의 NaCl 농도로 약 40분 동안 분취기로 2.
- 전기영동은 stacking gel에서는 60 V에서 30분간 실시하였고, separating gel에서는 100 V에서 1시간 30분 동안 실시하였다. 전기 영동이 끝난 gel은 gel staining solution (0.1% Coomassie blue R-250, 45% methanol, 10% glacial acetic acid)으로 2시간 염색을 실시하였고. gel destaining solution I (10% methanol, 10% glacial acetic acid)로 1시간 동안 처리한 후, gel destaining solution II (5% methanol, 7% glacial acetic acid)로 8시간 처리하였다.
- 효소 활성의 최적 온도를 알아보기 위하여, 반응온도를 10~5(TC 로 변화를 시키면서 효소활성을 측정하였다. 효소 반응은 순환 온도 장치를 이용하여 해당되는 온도를 맞추었다. 각각의 온도에 해당하는 반응용액을 사용하여 1분간 반응 후에 340nm에서 흡광도 측정을 하였으며, 최대 흡광도 값을 100% 기준으로 상대적 활성을 측정하였다.
- 효소 활성의 최적 온도를 알아보기 위하여, 반응온도를 10~5(TC 로 변화를 시키면서 효소활성을 측정하였다. 효소 반응은 순환 온도 장치를 이용하여 해당되는 온도를 맞추었다.
- 각각의 온도에 해당하는 반응용액을 사용하여 1분간 반응 후에 340nm에서 흡광도 측정을 하였으며, 최대 흡광도 값을 100% 기준으로 상대적 활성을 측정하였다. 효소활성의 최적 pH를 조사하기 위하여, pH 5.0 ~7.0에서의 효소 활성은 50 mM potassium phosphate buffer 에서 측정하였고, pH 7, 5~120에서의 활성측정은 50mM Tris- HCl buffer를 이용하여 활성 측정을 실시하였다. H/+, Ag+, Cu2\ Ca2+, Mn2+, Fe2+ 등의 금속에 의한 nitroreducatse의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.
대상 데이터
- 준비된 시료를 100°C에서 5분간 열처리하여, 얼음에 냉각 후 주입하였다. 표지 단백질은 prestained SDS-PAGE standard (Bio-rad, Hercules, USA)를 사용하였다. 전기영동은 stacking gel에서는 60 V에서 30분간 실시하였고, separating gel에서는 100 V에서 1시간 30분 동안 실시하였다.
이론/모형
- Separating gel 은 12%의 acrylamide gel을 사용하였고, stacking gel은 5%의 acrylamide gel을 사용하여 전개하였다. Bradford 방법으로 단백질 정량을 실시하여 동일량의 단백질을 준비하였고, lx sample buffer로 총량을 맞추었다. 준비된 시료를 100°C에서 5분간 열처리하여, 얼음에 냉각 후 주입하였다.
- Nitroreductase의 정제 여부와 분자량을 확인하기 위하여 Bollag 등의 방법⑴을 이용하여 SDS-EAGE를 실시하였다. Separating gel 은 12%의 acrylamide gel을 사용하였고, stacking gel은 5%의 acrylamide gel을 사용하여 전개하였다.
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Nitnmeductase의 활성 측정
정제된 nitroreductase는 염의 제거와 농축을 위하여 Centriprep 10 concentrator (Amicon, Beverly, USA)를 사용하여 10배로 농축한 후, 전자 공여체인 NADH의 산화에 의해 측정되는 French 방법⑺에 의해서 활성 측정을 실시하였다. Nitroreductase 활성측정은 Tris-HCl buffer(50mM, pH 7.
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