폭약 TNT 분해세균 Stenotrophomonas sp. OK-5에서 분리된 NAD(P)H-nitroreductase의 정제 및 특성 연구 Characterization of NAD(P)H-nitroreductase Purified from the TNT-degrading Bacterium, Stenotrophomonas sp. OK-5원문보기
2,4,6-Trinitrotoluene (TNT)을 분해할 수 있는 Stenotrophomonas sp. OK-5에서 분리한 NAD(P)H-nitroreductase의 특성을 조사하였다. 먼저 ammonium sulfate precipitation, DEAE-sepharose, 그리고 Q-sepharose 등의 일련의 정제 과정을 통하여 NAD(P)H-nitroreductase을 분리정제하였다. 분취기로부터 얻어진 시료로부터 NAD(P)H-nitroreductase의 효소활성을 가지는 3개의 다른 fractions (I, II 및 III)이 탐침되었다. NAD(P)H-nitroreductase의 fractions I, II, 그리고 III의 비활성(specific activity)은 각각 5.06 unit/mg, 4.95 unit/mg, and 4.86 unit/mg이었으며, crude extract와 비교하여 각각 10.5배, 9.8배, 8.9배 이상 농축되었다. 이 실험에서 이들 3개의 fractions 가운데, fraction I이 가장 높은 비활성을 나타내었다. NAD(P)H-nitroreductase (fractions I, II 및 III)의 효소활성에 영향을 미치는 몇 가지 요인을 조사하였다. 모든 NAD(P)H-nitroreductase (fractions I, II 및 III)의 최적 온도는 30$^{\circ}C$이었으며, 최적 pH는 약 7.5이었다. 4Ag^+, Cu_2^+, Hg_2^+$ 등의 금속이온은 약 80%의 효소활성을 저해하였으나, $Mn_2^+ 이나 Ca_2^+$의 첨가 시에는 약 30~40% 정도의 활성이 감소되었다. 그러나 $Fe_3^+$은 이들 효소의 활성을 증진시켰다. SDS-PAGE에 의해 측정된 NAD(P)H-nitroreductase의 fractions I, II 및 III의 분자량은 모두 약 27 kDa임이 확인되었다.
2,4,6-Trinitrotoluene (TNT)을 분해할 수 있는 Stenotrophomonas sp. OK-5에서 분리한 NAD(P)H-nitroreductase의 특성을 조사하였다. 먼저 ammonium sulfate precipitation, DEAE-sepharose, 그리고 Q-sepharose 등의 일련의 정제 과정을 통하여 NAD(P)H-nitroreductase을 분리정제하였다. 분취기로부터 얻어진 시료로부터 NAD(P)H-nitroreductase의 효소활성을 가지는 3개의 다른 fractions (I, II 및 III)이 탐침되었다. NAD(P)H-nitroreductase의 fractions I, II, 그리고 III의 비활성(specific activity)은 각각 5.06 unit/mg, 4.95 unit/mg, and 4.86 unit/mg이었으며, crude extract와 비교하여 각각 10.5배, 9.8배, 8.9배 이상 농축되었다. 이 실험에서 이들 3개의 fractions 가운데, fraction I이 가장 높은 비활성을 나타내었다. NAD(P)H-nitroreductase (fractions I, II 및 III)의 효소활성에 영향을 미치는 몇 가지 요인을 조사하였다. 모든 NAD(P)H-nitroreductase (fractions I, II 및 III)의 최적 온도는 30$^{\circ}C$이었으며, 최적 pH는 약 7.5이었다. 4Ag^+, Cu_2^+, Hg_2^+$ 등의 금속이온은 약 80%의 효소활성을 저해하였으나, $Mn_2^+ 이나 Ca_2^+$의 첨가 시에는 약 30~40% 정도의 활성이 감소되었다. 그러나 $Fe_3^+$은 이들 효소의 활성을 증진시켰다. SDS-PAGE에 의해 측정된 NAD(P)H-nitroreductase의 fractions I, II 및 III의 분자량은 모두 약 27 kDa임이 확인되었다.
The purpose of this work was to perform the characterization of NAD(P)H-nitroreductase isolated from Stenotrophomonas sp. OK-5 capable of degrading 2,4,6-trinitrotoluene (TNT). Initially, NADP(H)-nitroreductase by a series of purification processes including ammonium sulfate precipitation, DEAE-seph...
The purpose of this work was to perform the characterization of NAD(P)H-nitroreductase isolated from Stenotrophomonas sp. OK-5 capable of degrading 2,4,6-trinitrotoluene (TNT). Initially, NADP(H)-nitroreductase by a series of purification processes including ammonium sulfate precipitation, DEAE-sepharose, andQ-sepharose was prepared. From samples harvested from fraction collector, three different fractions (I, II & III)having the enzyme activity of NAD(P)H-itroreductase were detected. Specific activities of three fractions I, II,and III of NAD(P)H-nitroreductase were determined to approximately 5.06 unit/mg, 4.95 unit/mg and 4.86 unit/mg, and concentrated to 10.5, 9.8, and 8.9-fold compared to crude extract, respectively. Among these three fractions,the fraction I of NAD(P)H-nitroreductase demonstrated the highest specific activity in this experiment. Several factors affecting on the enzyme activity of NAD(P)H-nitroreductase (fractions I, II & III) were investigated.The optimum temperature of all NAD(P)H-nitroreductase (fractions I, II & III) was 30oC, and the optimal pH was approximately 7.5. Metal ions such as Ag+, Cu2+, Hg2+ inhibited approximately 80% enzyme activity of all NAD(P)H-nitroreductase, and the enzyme activities were decreased about 30-40% inhibition in the presence of Mn2+ or Ca2+. However, Fe3+ showed stimulatory effect on the enzyme activity. The molecular weights of NAD(P)H-nitroreductase (fractions I, II & III) were measured about 27 kDa on the SDS-PAGE.
The purpose of this work was to perform the characterization of NAD(P)H-nitroreductase isolated from Stenotrophomonas sp. OK-5 capable of degrading 2,4,6-trinitrotoluene (TNT). Initially, NADP(H)-nitroreductase by a series of purification processes including ammonium sulfate precipitation, DEAE-sepharose, andQ-sepharose was prepared. From samples harvested from fraction collector, three different fractions (I, II & III)having the enzyme activity of NAD(P)H-itroreductase were detected. Specific activities of three fractions I, II,and III of NAD(P)H-nitroreductase were determined to approximately 5.06 unit/mg, 4.95 unit/mg and 4.86 unit/mg, and concentrated to 10.5, 9.8, and 8.9-fold compared to crude extract, respectively. Among these three fractions,the fraction I of NAD(P)H-nitroreductase demonstrated the highest specific activity in this experiment. Several factors affecting on the enzyme activity of NAD(P)H-nitroreductase (fractions I, II & III) were investigated.The optimum temperature of all NAD(P)H-nitroreductase (fractions I, II & III) was 30oC, and the optimal pH was approximately 7.5. Metal ions such as Ag+, Cu2+, Hg2+ inhibited approximately 80% enzyme activity of all NAD(P)H-nitroreductase, and the enzyme activities were decreased about 30-40% inhibition in the presence of Mn2+ or Ca2+. However, Fe3+ showed stimulatory effect on the enzyme activity. The molecular weights of NAD(P)H-nitroreductase (fractions I, II & III) were measured about 27 kDa on the SDS-PAGE.
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제안 방법
5 ml 씩 모아서 효소 활성측정을 통하여 nitroreductase가 포함된 용출액을 분리하였고, 분리한 용액은 Bradford 방법⑵을 응용하여 단백질 정량을 실시하였으며, bovine serum albumin (BSA)으로 표준곡선을 작성하였다. 1ml의 Bradford 용액에 각각 10, 20, 30 ㎍의 BSA를 첨가하여 5분간 반응 후 595 nm에서 홉 광도를 측정하여 표준곡선을 작성하였고, 측정하고자 하는 단백질 시료는 표준곡선의 흡광도의 범주를 벗어나지 않도록 첨가한 후, 홉 광도를 측정하여 정량을 실시하였다.
Crude extract 상태의 효소 용액을 40-60% ammonium sulfate 침전을 통하여 단백질의 양을 절반으로 줄였고, DEAE-sepharose, Q-sepharose column을 실시하여 nitroreductase# 분리 및 정제하였으며, 이 후 세 개의 다른 fractions이 나타남을 확인하였다(Fig. 2). Nitroreductase를 정제하는 일반적인 방법은 acetone이나 ammonium sulfate로 포화시킨 용액에서 단백질을 침전시킨 후음이 온의 성질을 가진 nitroreductase# 정제하기 위하여, DEAE 나 DE52, Mono Q 등의 음이온 교환 chromatography를 이용하는 것이었으나<4, 5), 본 연구에서는 분리세균 OK-5로부터 nitroreductase 정제하는 과정에서 acetone 침전을 실시하지 않고, ammonium sulfate 침전을 이용한 일련의 과정을 통하여 순수한 nitroreductase# 분리하였다.
0에서의 효소 활성은 50 mM potassium phosphate buffer 에서 측정하였고, pH 7, 5~120에서의 활성측정은 50mM Tris- HCl buffer를 이용하여 활성 측정을 실시하였다. H/+, Ag+, Cu2\ Ca2+, Mn2+, Fe2+ 등의 금속에 의한 nitroreducatse의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)에 각각 10 mM의 금속을 첨가하고, 실온에서 5분간 방치 후에 200μl의 0.1 mM TNT와 10μl의 0.2 mM NADH 용액 및 분리된 효소용액을 첨가하였으며, 반응은 실온에서 1분간 실시한 후에 흡광도를 측정하였다.
의해서 활성 측정을 실시하였다. Nitroreductase 활성측정은 Tris-HCl buffer(50mM, pH 7.5)에 기질로 TNT (0.1 mM), NADH(0.2mM)와 정제한 nitroreductase를 최종 1 ml로 맞추어 첨가한 후 분광광도계를 이용하여 340 nm에서 NADH (Sigma)가 산화되면서 1분 동안 감소되는 값을 측정하였다. 반응 산물인 NADH의 몰 흡광계수 (molar extinction coefficient)는 6, 300 M-1cm-1이며, 1 imit은 25P에서 분당 1 mole의 NADH가 산화되는 양으로 정하고, 비활성(specific activity)은 unit/mg으로 정하였다.
2). Nitroreductase를 정제하는 일반적인 방법은 acetone이나 ammonium sulfate로 포화시킨 용액에서 단백질을 침전시킨 후음이 온의 성질을 가진 nitroreductase# 정제하기 위하여, DEAE 나 DE52, Mono Q 등의 음이온 교환 chromatography를 이용하는 것이었으나<4, 5), 본 연구에서는 분리세균 OK-5로부터 nitroreductase 정제하는 과정에서 acetone 침전을 실시하지 않고, ammonium sulfate 침전을 이용한 일련의 과정을 통하여 순수한 nitroreductase# 분리하였다. 또한, nitroreductase의 등전점이 낮은 pH에서 나타나는 것으로 알려져 있어 다양한 음이온 교환체 chromatography를 이용한 분석 결과 여러 개의 peak들이 나타난다고 보고된 바 있다(4, 7).
Nitroreductase의 활성에 영향을 미치는 요인으로 pH, 온도, 그리고 금속의 첨가에 따른 효소 활성을 측정하여 비교하였다. 효소 활성의 최적 온도를 알아보기 위하여, 반응온도를 10~5(TC 로 변화를 시키면서 효소활성을 측정하였다.
본 연구에서는 세균의 생장에서 TNT를 기질로 이용하는 Stenotrophomonas sp. OK-5를 TNT가 포함된 최소배지에 배양한 후, 분해에 관여하는 효소인 NAD(P)H-nitroreductase (fractions I, II, 및 III)를분리 및 정제하고 SDS-PAGE를 통하여 각각의 분자량을 확인하였으며, 온도와 pH, 그리고 여러 가지 금속의 첨가가 이들 효소에 미치는 영향에 대하여 조사하였다.
침전된 균체를 4 ml의 50 mM Tris-HCl로 재현탁한 후, sonicator (Fisher M-300, Pittsburgh, USA)를 이용하여 파쇄하였다. Sonication은 30초 간격으로 25회 실시하였다. 파쇄한 용액은 8, 700 X g로 4℃에서 20분간 원심분리하여 상등액을 취하였다.
TNT에 오염된 토양으로부터 농화 배양을 통하여 TNT 분해 세균 OK-5를 분리하였다. 균주 OK-5는 Biolog 시험과 생리 생화학적 시험을 통하여 Stenotrophomonas 종으로 동정되었으며, Stenotrophomonas sp.
1% Coomassie blue R-250, 45% methanol, 10% glacial acetic acid)으로 2시간 염색을 실시하였고. gel destaining solution I (10% methanol, 10% glacial acetic acid)로 1시간 동안 처리한 후, gel destaining solution II (5% methanol, 7% glacial acetic acid)로 8시간 처리하였다.
따라서, 본 실험에서도 FMN이 효소 활성을 증가시킬 수 있는 조효소 역할을 하는 것으로 확인되었다. 각 정제단계에서 분리된 효소 용액의 단백질 정량과 NADH를 이용한 효소 활성 측정을 실시하여 효소의 단계별 분리표를 작성하였다(Table 1). 정제된 nitroreductase (fractions I, II, IU)의 specific activity는 각각 5.
효소 반응은 순환 온도 장치를 이용하여 해당되는 온도를 맞추었다. 각각의 온도에 해당하는 반응용액을 사용하여 1분간 반응 후에 340nm에서 흡광도 측정을 하였으며, 최대 흡광도 값을 100% 기준으로 상대적 활성을 측정하였다. 효소활성의 최적 pH를 조사하기 위하여, pH 5.
금속에 의 한 nitroreductase (fractions I, U, 및 III)의 효소 활성 저해 효과를 알아보기 위해서 다양한 금속 이온들을 첨가하여 활성을 조사하였다. 먼저 nitroreductase fraction I은 HgCl2, AgNO3 와 CuSQ에 의해서 각각 26.
약 6, 300xg 에서 20분간 원심분리하여 침전물은 제거하고, 상등액을 취하였다. 다시 상등액에 L 당 130 g의 ammonium sulfate를 위와 같은 방법으로 첨가하여 60% 포화 ammonium sulfate를 만들었고, 6, 300 X g에서 20분간 원심분리하여 침전물을 취하였다. 침전물은 0.
5X20 cm)에 주입하였다. 단백질은 1 M의 NaCl 농도로 약 40분 동안 분취기로 2.5 ml 씩 모아서 효소 활성측정을 통하여 nitroreductase가 포함된 용출액을 분리하였고, 분리한 용액은 Bradford 방법⑵을 응용하여 단백질 정량을 실시하였으며, bovine serum albumin (BSA)으로 표준곡선을 작성하였다. 1ml의 Bradford 용액에 각각 10, 20, 30 ㎍의 BSA를 첨가하여 5분간 반응 후 595 nm에서 홉 광도를 측정하여 표준곡선을 작성하였고, 측정하고자 하는 단백질 시료는 표준곡선의 흡광도의 범주를 벗어나지 않도록 첨가한 후, 홉 광도를 측정하여 정량을 실시하였다.
2mM)와 정제한 nitroreductase를 최종 1 ml로 맞추어 첨가한 후 분광광도계를 이용하여 340 nm에서 NADH (Sigma)가 산화되면서 1분 동안 감소되는 값을 측정하였다. 반응 산물인 NADH의 몰 흡광계수 (molar extinction coefficient)는 6, 300 M-1cm-1이며, 1 imit은 25P에서 분당 1 mole의 NADH가 산화되는 양으로 정하고, 비활성(specific activity)은 unit/mg으로 정하였다.
5)를 2 ml/min의 유속으로 용액을 용출하였다. 용출액은 nitroreductase의 활성이 높은 부분을 확인하여 단백질 정량을 실시하였고, 다시 Q-sepharose (Amersharm Phamacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) column (2.5X20 cm)에 주입하였다. 단백질은 1 M의 NaCl 농도로 약 40분 동안 분취기로 2.
전기영동은 stacking gel에서는 60 V에서 30분간 실시하였고, separating gel에서는 100 V에서 1시간 30분 동안 실시하였다. 전기 영동이 끝난 gel은 gel staining solution (0.1% Coomassie blue R-250, 45% methanol, 10% glacial acetic acid)으로 2시간 염색을 실시하였고. gel destaining solution I (10% methanol, 10% glacial acetic acid)로 1시간 동안 처리한 후, gel destaining solution II (5% methanol, 7% glacial acetic acid)로 8시간 처리하였다.
효소 활성의 최적 온도를 알아보기 위하여, 반응온도를 10~5(TC 로 변화를 시키면서 효소활성을 측정하였다. 효소 반응은 순환 온도 장치를 이용하여 해당되는 온도를 맞추었다. 각각의 온도에 해당하는 반응용액을 사용하여 1분간 반응 후에 340nm에서 흡광도 측정을 하였으며, 최대 흡광도 값을 100% 기준으로 상대적 활성을 측정하였다.
효소 활성의 최적 온도를 알아보기 위하여, 반응온도를 10~5(TC 로 변화를 시키면서 효소활성을 측정하였다. 효소 반응은 순환 온도 장치를 이용하여 해당되는 온도를 맞추었다.
각각의 온도에 해당하는 반응용액을 사용하여 1분간 반응 후에 340nm에서 흡광도 측정을 하였으며, 최대 흡광도 값을 100% 기준으로 상대적 활성을 측정하였다. 효소활성의 최적 pH를 조사하기 위하여, pH 5.0 ~7.0에서의 효소 활성은 50 mM potassium phosphate buffer 에서 측정하였고, pH 7, 5~120에서의 활성측정은 50mM Tris- HCl buffer를 이용하여 활성 측정을 실시하였다. H/+, Ag+, Cu2\ Ca2+, Mn2+, Fe2+ 등의 금속에 의한 nitroreducatse의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.
대상 데이터
준비된 시료를 100°C에서 5분간 열처리하여, 얼음에 냉각 후 주입하였다. 표지 단백질은 prestained SDS-PAGE standard (Bio-rad, Hercules, USA)를 사용하였다. 전기영동은 stacking gel에서는 60 V에서 30분간 실시하였고, separating gel에서는 100 V에서 1시간 30분 동안 실시하였다.
이론/모형
Separating gel 은 12%의 acrylamide gel을 사용하였고, stacking gel은 5%의 acrylamide gel을 사용하여 전개하였다. Bradford 방법으로 단백질 정량을 실시하여 동일량의 단백질을 준비하였고, lx sample buffer로 총량을 맞추었다. 준비된 시료를 100°C에서 5분간 열처리하여, 얼음에 냉각 후 주입하였다.
Nitroreductase의 정제 여부와 분자량을 확인하기 위하여 Bollag 등의 방법⑴을 이용하여 SDS-EAGE를 실시하였다. Separating gel 은 12%의 acrylamide gel을 사용하였고, stacking gel은 5%의 acrylamide gel을 사용하여 전개하였다.
Nitnmeductase의 활성 측정
정제된 nitroreductase는 염의 제거와 농축을 위하여 Centriprep 10 concentrator (Amicon, Beverly, USA)를 사용하여 10배로 농축한 후, 전자 공여체인 NADH의 산화에 의해 측정되는 French 방법⑺에 의해서 활성 측정을 실시하였다. Nitroreductase 활성측정은 Tris-HCl buffer(50mM, pH 7.
성능/효과
3%로 활성이 감소하였다. CaSO4, Mnq에 의해서는 활성이 소폭 감소하였고, FeC\의 첨가 시에는 효소의 활성이 증가호}는 것으로 확인되었다 . Nitroreductase fraction U도 AgNC)3에 의해서 활성이 감소하였고, FeC% 에 의해서 효소 활성이 증가하였다.
따라서 본 연구에서 확인된 OK-5의 NAD(P)H-ntaeductase는 E .cloacae의 NAD(P)H-nitrc)reductase와 유사성이 있는 것으로 확인되었다.
온도가 35°C 이상으로 증가하면 활성은 급격히 감소하였고 40°C 이상에서는 활성이 20% 이하로 낮아졌다. pH에 의한 nitroreductase(fractions I, II, 및 III)의 활성 조사에서는 pH 5.0에서는 활성이 거의 나타나지 않았고 pH 6.0 이상에서 효소의 활성이 나타나기 시작하여 효소의 적정 pH는 7.0~8.0으로 나타났으며, 최적 pH는 7.5로 확인되었다(Fig. 5). 이범위를 벗어난 pH에서는 효소 활성이 감소하는 것으로 나타났다.
FMN은 nitroieductag 간의 수소결합에 영향을 주어 안정화시킨다고 알려져 있으며(9), Salmonella typhimurium^, E cloacae 등에서 분리된 nitroreductase 를 이용한 연구에서 FMN에 의해 효소 활성이 증가됨을 보고하였다(4, 22). 따라서, 본 실험에서도 FMN이 효소 활성을 증가시킬 수 있는 조효소 역할을 하는 것으로 확인되었다. 각 정제단계에서 분리된 효소 용액의 단백질 정량과 NADH를 이용한 효소 활성 측정을 실시하여 효소의 단계별 분리표를 작성하였다(Table 1).
9배 농축되었다. 본 연구에서 분리된 nitroreductase (fractions I, II, III)는 실온에서 불안정한 것으로 나타났으며, -70℃에서도 장시간 보관 시에 활성이 크게 감소되는 것으로 확인되었다.
Cu2+4 Hg2+ 등은 NADH의 산화에 영향을 주어 효소 활성을 감소시키고, A* g는 단백질 내의 sulfohydryl group에 결합하여 억제되는 것으로 보고되었다(9). 본 연구에서 실시한 금속이 효소 활성에 미치는 영향에 대한 조사에서도 CiH, Hg2+ 그리고 Ag+ 에 의하여 효소 활성이 억제됨을 확인하였다. 향후 본 연구에서는 얻어진 결과를 바탕으로 TNT 분해세균 OK-5로부터 분리, 정제된 NAD(P)H-nitroreductase의 아미노산 서열을 분석하여 다른 세균에서 분리된 NAD(P)H-nitroreductase와의 유사성을 규명하고, 관련 유전자의 분자 생물학적 특성 규명 실험이 진행될 것이다.
온도가 nitroreductase (fractions I, H, 및 III)의 활성에 미치는 영향에 대한 조사에서는 KFC에서 최대 활성 온도의 20~30%로 나타나기 시작하여 25°C에서 활성이 증가하고, 최적 활성 온도는 3UC로 나타났다(Fig. 4). 온도가 35°C 이상으로 증가하면 활성은 급격히 감소하였고 40°C 이상에서는 활성이 20% 이하로 낮아졌다.
각 정제단계에서 분리된 효소 용액의 단백질 정량과 NADH를 이용한 효소 활성 측정을 실시하여 효소의 단계별 분리표를 작성하였다(Table 1). 정제된 nitroreductase (fractions I, II, IU)의 specific activity는 각각 5.24 unit/mg, 4.91 unit/mg, 그리고 4.46 unit/mg으로 나타났으며, crude extract에 비해 10.5배, 9.8배, 8.9배 농축되었다. 본 연구에서 분리된 nitroreductase (fractions I, II, III)는 실온에서 불안정한 것으로 나타났으며, -70℃에서도 장시간 보관 시에 활성이 크게 감소되는 것으로 확인되었다.
Nitroreductase의 분자량 측정
정제된 nitroreductase의 분자량 측정을 위해 각 정제단계별 시료를 12%의 SDS-B\GE gel에 전개하여 nitroreductase (ftactiOTs L D, 및 HI) 의 분리 여부를 단일 band로 확인하였고, 분자량은 약 27 kDa임을 확인하였다(Fig. 3). Watanabe 등(21)은 Salmonella ryphimurium등에서 분리된 nitroreductase의 분자량이 약 24.
후속연구
본 연구에서 실시한 금속이 효소 활성에 미치는 영향에 대한 조사에서도 CiH, Hg2+ 그리고 Ag+ 에 의하여 효소 활성이 억제됨을 확인하였다. 향후 본 연구에서는 얻어진 결과를 바탕으로 TNT 분해세균 OK-5로부터 분리, 정제된 NAD(P)H-nitroreductase의 아미노산 서열을 분석하여 다른 세균에서 분리된 NAD(P)H-nitroreductase와의 유사성을 규명하고, 관련 유전자의 분자 생물학적 특성 규명 실험이 진행될 것이다.
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