혈구응집억제반응과 효소면역측정법을 이용한 닭 뉴캣슬병 바이러스에 대한 혈중항체가 비교 The comparative study on Newcastle disease virus antibody titer by hemagglutination inhibition test and enzyme-linked immunosorbent assay원문보기
This study was conducted to investigate the similarity between hemagglutination inhibition (HI) test and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) titers and sample to positive ratio (S/P ratio) of Newcastle disease(ND) virus. To perform this study, the 372 sera of broiler chicks and 120 sera of laye...
This study was conducted to investigate the similarity between hemagglutination inhibition (HI) test and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) titers and sample to positive ratio (S/P ratio) of Newcastle disease(ND) virus. To perform this study, the 372 sera of broiler chicks and 120 sera of layers and breed chicks were collected from slaughter house and farms, respectively. As a result of HI test out of different chicks, the positive percentage of ND antibody titer of broiler, layer and breeder, when a standard positive HI titer were '2', was 84.4%, 100% and 100%, respectively. The positive percentage of ND antibody titer by ELISA was shown 38.4%, 100% and 100% and S/P ratio were also shown 81.5%, 98.2% and 99.2%, respectively. The results of comparative survey with same sera by two experimental methods were as follows; In low HI titer, ELISA titer was not similar to HI titer, but S/P ratio was similar to it. In high HI titer, ELISA titer was not similar to HI titer. Therefore, HI titer was more similar to S/P ratio than ELISA titer.
This study was conducted to investigate the similarity between hemagglutination inhibition (HI) test and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) titers and sample to positive ratio (S/P ratio) of Newcastle disease(ND) virus. To perform this study, the 372 sera of broiler chicks and 120 sera of layers and breed chicks were collected from slaughter house and farms, respectively. As a result of HI test out of different chicks, the positive percentage of ND antibody titer of broiler, layer and breeder, when a standard positive HI titer were '2', was 84.4%, 100% and 100%, respectively. The positive percentage of ND antibody titer by ELISA was shown 38.4%, 100% and 100% and S/P ratio were also shown 81.5%, 98.2% and 99.2%, respectively. The results of comparative survey with same sera by two experimental methods were as follows; In low HI titer, ELISA titer was not similar to HI titer, but S/P ratio was similar to it. In high HI titer, ELISA titer was not similar to HI titer. Therefore, HI titer was more similar to S/P ratio than ELISA titer.
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제안 방법
96 well microplate에 항원 (양성대 조혈 청 포함)을 2진법으로 계단회석하고 최종 회석배수의 항원과 PBS 혼합액을 버린 다음 1% 적혈구 부유액을 동량 넣은 후 잘 혼들어 혼합하였으며, 회석이 끝난 후 실온에서 40분간 정치시킨 후 판독하였다.
가검혈청을 혈청희석제로 500배(1:500) 희석하고 음성 및 양성대조 혈청과 회석한 가검혈청을 100㎕ 씩 주입 후 실온에서 30분 정치하였다. Plate를 3~5회 세척하고 HRPO con- jugate를 각 well에 100㎕ 씩 주입하였고, 재차 실온에서 30분간 배양 후 위와 동일한 방법으로 세척하였다.
가검혈청의 S/P Ratio 산출은 [가검혈청 A(650) - 음성대조의 평균흡광도 (NCx)] / [양성대조의 평균흡광도(PCx) - NCx]로 하였으며, 결과는 S/P가 0.2 이하일 때 음성, S/P가 0.2 이상일 때 양성 (ELISA titer가 396 이상으로 ND virus에 대한 항체가 추정)으로 판독하였다.
뉴캣슬병 바이러스 항원이 코팅되어 있는 96 well plate에 가검혈청과 양성 및 음성대조 시액을 대조 well과의 발색정도(흡광도)를 비교하여 항체가를 측정하였다.
닭 뉴캣슬병 항체가 없는 닭에서 채혈한 혈액에 동량의 AlserveFs 액을 가하여 원심관에 옮긴 후 1,500 rpm에서 10분간 원심침전하여 상층액과 백혈구를 제거시킨 후 다시 PBS를 가하여 3회 세척한 후 침전된 적혈구 용적을 감안하여 닭 적혈구가 1%가 함유되도록 PBS에 부유시켰다.
본 연구의 비교시험에서 혈구응집억제반응과 효소 면역측정법의 실험결과 값에서 유사성을 조사했으며 결과는 다음과 같다.
비교실험을 위한 시료는 가검혈청 중 육계에서는 역가가 가장 낮은 농가(A농가)와 가장 높은 농가(B농가) 각각 1호씩 선정하여 12수씩 24수를, 산란계 (C)와 종계 (D)는 특별한 기준없이 무작위로 12수씩 선정하여 검사하였으며모든 시료는 3회 반복 실험한 평균값을 비교하였고, HI titer와 ELISA titer는 소수점 첫째자리, 효소면역측정법의 S/P ratio는 소수점 넷째자리에서 반올림하였다.
적혈구(1%)를 25㎕ 씩 전 well에 주입 후 plate를 잘 흔들어 실온에서 40분간 정치시킨후 혈구응집억제정도를 관찰하였다. 이때 양성혈청도 동일한 방법으로 시행하였다.
혈구응집반응과 응집억제반응에 사용한 진단액은 대성미생물회사의 제품을, 닭 뉴캣슬병바이러스 항체를 측정하는 진단킷트는 IDEXX 사의 제품을 각각 사용하였고 검사방법 및 실험결과치의 분석 방법도 각각 그 제조회사에서 제시한 방법에 따라 실험하였다.
대상 데이터
시료의 채취기간은 2002년 4월부터 7월까지이며 관내 도계장에서 도축되는 35~40일령 육계 372수(31농가별 12수)와 산란계 16~90주령 120수(12농가별 10수), 종계 20~35주령 120수 (6농가별 20수)의 혈액을 1500rpm, 10분 동안 원심 침전 분리 후 혈청을 취하고 항온수조에서 56℃에서 30분간 비동화시켜 가검혈청으로 사용하였다.
성능/효과
B농가에서의 HI 역가는 4~9의 범위, C와 D 농가에서는 각각 6~10, 5-102] 범위까지로 HI titer 및 ELISA titer에서 모두 양성으로 판정되었다. 한편 몇몇 시료를 제외하고는 대부분의 경우에서 HI titer, S/P ratio 및 ELISA titer의 값이 함께 올라갔다.
ELISA에 대한 titertlogio titer)는 1.09 x (logio S/P ratio) + 3.36으로 계산하였으며, 그 결과 ELISA titer가 2,000 이상일 경우 방어 항체 수준(양^)으로 판독하였다.
Table 3의 결과와 같이 HI titer 2 이상을 양성 판정기준으로 했을 때 역가가 가장 낮은 육계 농가(A농가)는 12수 중 8수가 양성, 4수가 음성으로 나타났고 S/P ratio에서는 12수 중 7 수에서만 ND 항체를 검출할 수 있었다. ELISA titer로는 3수 양성에 9수 음성으로 나타났다.
각각의 실험방법으로 1 plate당 검사소요 시간은 HI test(8~12수)가 대략 3.5 시간, ELISA (90수)는 2.5 시간정도 소요되었으며 실험 후폐기되는 소모품의 양도 전자가 더 많았다.
있었다. 높은 응집억제역가에서는 ELISA titer와 S/P ratio 모두 유사성이 있음을 알 수 있었다. 혈중항체를 진단할 수 있는 양성 수치는 HI titei.
본 연구 조사에서도 육계의 항체형성 수준은 84.4%에 달했지만 질병 방어수준의 항체 역가 4를 기준으로 하였을 때는 48.4%로, 항체 역가 5를 기준으로 하였을 때는 35%로 감소함을 알수 있었으며, ELISA titer의 양성률 38.4%와비교하면 HI titer 5와 비슷한 수치를 보였다.
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