유전자 재조합체는 상동염색체간의 예정된 DNA 가닥 전이와 교환이 이루어지는 상동염색체 재조합 과정에 의하여 생성된다. 이 재조합 경로는 DNA 이중 가닥 절단(double-strand breaks, DSBs)에 의해서 개시되며, 전이 과정의 중간단계에서 DNA의 구조적 변이 중간체인 단일 가닥 침투(single-end invasions, SEIs)와 이중 홀리데이 접합(double-Holliday junctions, dHJs)이 형성되어 교차성(crossover, CO) 혹은 비교차성(non-crossover, NCO) 결과물이 만들어진다. 본 연구는 이중 가닥 절단, 단일 가닥 침투, 이중 홀리데이 접합과 같은 재조합 중간체와 재조합 결과물의 구조분석에 초점을 두고, 이를 출아효모에서 인위적으로 이중 가닥 절단을 발생시킬 수 있는 HIS4LEU2 "hot spot" 을 이용한 물리적 분석방법으로 감수분열 재조합 중간체를 규명하였다. 물리적 분석을 위하여 동조화 된 세포에 감수분열을 유도한 후 hot spot 자리를 인식하는 제한효소를 처리하면, 재조합 중간체를 형성하고 있는 DNA 단편들을 Southern 분석법을 통해 탐지 및 정량 할 수 있다. 본 연구는 이 시스템으로 감수분열에서 이중가닥 절단으로부터 기인하는 단일 가닥 침투, 이중 홀리데이 접합 그리고 교차성/비교차성 재조합체로 전이되는 DNA의 구조 다형을 분석할 수 있음을 제시한다.
유전자 재조합체는 상동염색체간의 예정된 DNA 가닥 전이와 교환이 이루어지는 상동염색체 재조합 과정에 의하여 생성된다. 이 재조합 경로는 DNA 이중 가닥 절단(double-strand breaks, DSBs)에 의해서 개시되며, 전이 과정의 중간단계에서 DNA의 구조적 변이 중간체인 단일 가닥 침투(single-end invasions, SEIs)와 이중 홀리데이 접합(double-Holliday junctions, dHJs)이 형성되어 교차성(crossover, CO) 혹은 비교차성(non-crossover, NCO) 결과물이 만들어진다. 본 연구는 이중 가닥 절단, 단일 가닥 침투, 이중 홀리데이 접합과 같은 재조합 중간체와 재조합 결과물의 구조분석에 초점을 두고, 이를 출아효모에서 인위적으로 이중 가닥 절단을 발생시킬 수 있는 HIS4LEU2 "hot spot" 을 이용한 물리적 분석방법으로 감수분열 재조합 중간체를 규명하였다. 물리적 분석을 위하여 동조화 된 세포에 감수분열을 유도한 후 hot spot 자리를 인식하는 제한효소를 처리하면, 재조합 중간체를 형성하고 있는 DNA 단편들을 Southern 분석법을 통해 탐지 및 정량 할 수 있다. 본 연구는 이 시스템으로 감수분열에서 이중가닥 절단으로부터 기인하는 단일 가닥 침투, 이중 홀리데이 접합 그리고 교차성/비교차성 재조합체로 전이되는 DNA의 구조 다형을 분석할 수 있음을 제시한다.
During meiosis, genetic recombinants are formed by homologous recombination accompanying with the programmed double-strand breaks (DSBs) and strand exchanges between homologous chromosomes. The mechanism is generated by recombination intermediates such as single-end invasions (SEIs) and double-Holli...
During meiosis, genetic recombinants are formed by homologous recombination accompanying with the programmed double-strand breaks (DSBs) and strand exchanges between homologous chromosomes. The mechanism is generated by recombination intermediates such as single-end invasions (SEIs) and double-Holliday junctions (dHJs), and followed by crossover (CO) or non-crossover (NCO) products. Our study was focused on the analysis of meiotic recombination intermediates (DSBs, SEIs, and dHJs) and final recombination products (CO and NCO). We identified these meiotic recombination intermediates using DNA physical analysis under HIS4LEU2 "hot spot" system in budding yeast, Saccharomyces cerevisiae. For DNA physical analysis, when the hot spot locus is recognized by restriction enzyme from synchronous meiotic cells, the fragmented DNA that are forming recombination intermediates can be detected and quantified through Southern hybridization analysis. Our study suggests that this system can analyze the structural change of recombination intermediates during DSB-SEI transition, double-Holiday junctions and crossover/non-crossover products in meiosis.
During meiosis, genetic recombinants are formed by homologous recombination accompanying with the programmed double-strand breaks (DSBs) and strand exchanges between homologous chromosomes. The mechanism is generated by recombination intermediates such as single-end invasions (SEIs) and double-Holliday junctions (dHJs), and followed by crossover (CO) or non-crossover (NCO) products. Our study was focused on the analysis of meiotic recombination intermediates (DSBs, SEIs, and dHJs) and final recombination products (CO and NCO). We identified these meiotic recombination intermediates using DNA physical analysis under HIS4LEU2 "hot spot" system in budding yeast, Saccharomyces cerevisiae. For DNA physical analysis, when the hot spot locus is recognized by restriction enzyme from synchronous meiotic cells, the fragmented DNA that are forming recombination intermediates can be detected and quantified through Southern hybridization analysis. Our study suggests that this system can analyze the structural change of recombination intermediates during DSB-SEI transition, double-Holiday junctions and crossover/non-crossover products in meiosis.
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문제 정의
물리적 분석을 위하여 동조화 된 세포에 감수분열을 유도한 후 hot spot 자리를 인식하는 제한효소를 처리하면, 재조합 중간체를 형성하고 있는 DNA 단편들을 Southern 분석법을 통해 탐지 및 정량 할 수 있다. 본 연구는 이 시스템으로 감수분열에서 이중 가닥 절단으로부터 기인하는 단일 가닥 침투, 이중 홀리데이 접합 그리고 교차성/비교차성 재조합체로 전이되는 DNA의 구조다형을 분석할 수 있음을 제시한다.
본 연구에서는 HIS4LEU2 “hotspot” 시스템을 이용하여 감수분열을 유도하고 재조합 과정에서의 DNA를 분석하여 어떻게 재조합이 진행되는지를 관찰하였다.
제안 방법
“Mom” 의 유전자형을 가진 반수체 효모와 “Dad” 의 유전자형을 가진 반수체 효모를 각각의 교배형에 맞게 교배하여 6시간 동안 YPD 고체배지에서 배양하였다.
“Mom”과 “Dad”의 DNA를 제한효소로 처리하여 각각 다른 길이의 절편으로 절단하고 이것을 정량하여 재조합의 진행과정을 모니터링하였다.
“Mom”과 “Dad”의 유전자형을 가진 반수체 효모를 각각의 교배형에 맞게 교배하고 감수분열을 유도하였다.
침전시킨 효모는 250 ml SPM 배지로 현탁하여 오비탈 교반 배양기에서 300 rpm, 30℃로 감수분열을 유도하였다. 10% Sodium Azide를 0.23 ml씩 분주한 튜브에 각 시간 별로(0, 2.5, 3.5, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 24 h) 23 ml씩을 취해 3000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 재조합이 진행 중인 DNA간의 교차결합(cross-link)을 안정화하기 위해 Psoralen 용액(0.
1차원 아가로즈 젤 전기영동을 실시하고 각 lane을 잘라내어 이를 90°의 각도로 돌려 한번 더 전기영동을 실시하였다.
1차원 젤 분석을 위해, 2 µg의 DNA를 XhoI (Enzynomics) 제한효소로 처리한 후 0.6% SeaKem LE 아가로즈에 1 × TBE, 2 V/cm의 조건으로 24시간 동안 전기영동을 하였다.
1차원 젤 전기영동을 통하여 각 시간 별로 발생한 이중 가닥 절단과 재조합 결과물을 DNA크기로 분리하였고 발생시기와 비율을 정량하였다. 이중 가닥 절단은 감수분열을 유도한지 2.
2차원 젤 분석을 위해, 2.5 µg의 DNA 를 XhoI 제한효소로 처리한 후 0.4% SeaKem GOLD 아가로즈에 1 × TBE, 1 V/cm의 조건으로 20시간 동안 전기영동을 하고 Ethidium Bromide (EtBr, 0.5 µg/ml)로 염색을 하였다.
3). 2차원 젤 전기영동을 통해 이중 가닥 절단의 형성부터 재조합 결과물이 만들어지기까지의 재조합 중간체를 분석하였다. 이중 가닥 절단이 관찰된 시간 이후에 노출된 3′ 단일 가닥이 상동염기서열을 찾아 침투한 상태의 DNA가 관찰되었고 이중 홀리데이 접합을 형성한 상태의 DNA가 차례로 관찰되었다(Fig.
교차결합된 상태가 분리되지 않게 하기 위하여 vortex 믹서는 사용하지 않았다. Guanidine과 Phenol/Chloroform을 이용한 방법으로 각 시간 별 샘플에서 genomic DNA (gDNA)를 추출하였다. 해동된 세포에 1 ml Spheroplasting buffer (1 M Sorbitol, 50 mM KPO4; pH 7.
현미경에 설치된 Yeast Tetrad Dissection 전용 바늘을 이용하여 4개의 포자를 YPD 고체배지 위에 분리하여 나열하고 30℃에서 2일간 배양하였다. YPD 고체배지의 크기보다 약간 작은 지름의 평평한 원통에 100% 면을 올려 놓고 그 위에 YPD 고체배지를 뒤집어서 찍어낸 다음 HIS, LEU 그리고 URA가 각각 결핍된 고체배지를 하나씩 찍어서 복사하였다. 또한 각 포자의 교배형을 확인하기 위하여 YPD 액체배지에 교배형이 확실한 반수체 효모를 배양하여 YPD 고체배지에 도말한 것을 복사하고 30℃에서 1일간 배양하였다 (Fig.
gDNA를 XhoI 제한효소로 처리하여 “Mom”과 “Dad”에서 유래한 HIS4LEU2 “hotspot”을 각기 다른 크기로 절단하였고 이를 아가로즈 젤 전기영동으로 분리하였다.
동조화된 모든 세포에 일제히 감수분열을 유도하면 이중 가닥 절단과 그 이후의 과정에서 생성되는 중간체와 재조합 결과물을 전시간에 걸쳐 관찰할 수 있다. 감수분열을 유도하여 각 시간 별로 수확한 세포에서 gDNA를 추출하였다. gDNA를 XhoI 제한효소로 처리하여 “Mom”과 “Dad”에서 유래한 HIS4LEU2 “hotspot”을 각기 다른 크기로 절단하였고 이를 아가로즈 젤 전기영동으로 분리하였다.
고정된 세포는 0.01 mg/ml DAPI (4', 6-diamidino2-phenylindole)로 염색하고 세포 하나 당 형광을 띄는 핵의 갯수가 1개인 것과 2개 또는 4개인 것으로 구분하여 감수분열을 통한 포자화 진행 정도를 확인하였다(Fig. 1A).
교차성 재조합 산물과 비교차성 재조합 산물을 1차원 젤에서 분석하기 위해, 2 µg의 DNA를 XhoI과 NgoMIV (New England Biolabs) 제한효소로 처리하여 0.6% SeaKem LE 아가로즈에 1 × TBE, 2 V/cm의 조건으로 24시간 동안 전기영동을 하였다.
본 연구에서는 HIS4LEU2 “hotspot” 시스템을 이용하여 감수분열을 유도하고 재조합 과정에서의 DNA를 분석하여 어떻게 재조합이 진행되는지를 관찰하였다. 동조화된 세포에 일제히 감수분열을 유도시킨 뒤 gDNA를 추출하였고 1차원 또는 2차원 젤 전기영동을 통해 재조합 중간과정의 DNA가 어떤 형태로 존재하는지 분석하였다. “Mom”과 “Dad”의 DNA를 제한효소로 처리하여 각각 다른 길이의 절편으로 절단하고 이것을 정량하여 재조합의 진행과정을 모니터링하였다.
YPD 고체배지의 크기보다 약간 작은 지름의 평평한 원통에 100% 면을 올려 놓고 그 위에 YPD 고체배지를 뒤집어서 찍어낸 다음 HIS, LEU 그리고 URA가 각각 결핍된 고체배지를 하나씩 찍어서 복사하였다. 또한 각 포자의 교배형을 확인하기 위하여 YPD 액체배지에 교배형이 확실한 반수체 효모를 배양하여 YPD 고체배지에 도말한 것을 복사하고 30℃에서 1일간 배양하였다 (Fig. 2B). 이 실험기법은 HIS4LEU2 “hotspot”을 지닌 돌연변이를 만드는 데 매우 유용한 방법으로 돌연변이를 만들고자 하는 단백질에 아미노산 혹은 항생제 내성 유전자로 표지하여 각각의 선택배지에서 손쉽게 돌연변이의 포함 여부를 알 수 있으며, 서로 다른 교배형과 융합하여 이배체 세포가 되면 스스로 아미노산을 합성하여 아미노산이 결여된 배지에서 성장할 수 있으므로 이를 통해 반수체 세포의 교배형 역시 확인할 수 있다(Fig.
본 연구는 이중 가닥 절단, 단일 가닥 침투, 이중 홀리데이 접합과 같은 재조합 중간체와 재조합 결과물의 구조분석에 초점을 두고, 이를 출아효모에서 인위적으로 이중 가닥 절단을 발생시킬 수 있는 HIS4LEU2 “hot spot” 을 이용한 물리적 분석방법으로 감수분열 재조합 중간체를 규명하였다.
선별한 이배체 효모를 SPM 배지에 10시간이상 배양하여 감수분열을 유도하였다. 세포벽을 제거하고 4개의 포자를 하나씩 분리하기 위해 Zymolyase를 처리하였다. YPD 고체배지 위에 포자를 하나씩 나열하고 30℃에서 2일간 배양하였다.
이번 연구의 초점은 이전 논문에 기술된 HIS4LEU2 “hotspot”을 이용하여(Kim et al., 2010) 제 1 감수분열 전기에 시작되는 이중 가닥 절단과 이후 형성되는 재조합 중간 단계에 있는 DNA 구조다형을 Southern 분석 방법을 통해 확인할 수 있음을 제시한다.
재조합 중간체 산물들은 HIS4LEU2 “hot spot”으로 분석하였다(Hunter and Kleckner, 2001; Oh et al., 2007).
5, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 24 h) 23 ml씩을 취해 3000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 재조합이 진행 중인 DNA간의 교차결합(cross-link)을 안정화하기 위해 Psoralen 용액(0.01 mg/ml Trioxalen, 50 mM Tris-HCl; pH 8.0, 50 mM EDTA; pH 8.0)을 첨가하고, 365 nm 파장의 자외선을 10분간 조사하였다. 각 시간 별 세포는 원심분리하여 상등액을 제거하고 -20℃로 냉각시켜 더 이상의 감수분열이 진행되지 않도록 하였다.
본 실험에 사용한 모든 배지는 미리 30℃로 예열하여 사용하였다. 출아효모는 -80℃에서 YPG 액체배지(1% Yeast Extract, 2% Bacto-Peptone, 40% Glycerol)에 저장 중인 것으로부터 YPG 고체배지(1% Yeast Extract, 2% Bacto-Peptone, 2% Bacto-Agar, 3% Glycerol)로 접종하고, 다음날 YPD 고체배지 (1% Yeast Extract, 2% Bacto-Peptone, 2% Bacto-Agar, 2% Glucose)에 도말하여 2일간 배양하였다. YPD 고체배지에서 자란 단일 colony를 YPD 액체배지(1% Yeast Extract, 2% Bacto-Peptone, 2% Glucose)로 접종하여 24시간 동안 배양한뒤, G1기에 동조화 시키기 위해 200 ml SPS (Supplemented Pre-Sporulation Medium; 0.
대상 데이터
본 실험에 사용한 출아효모(Saccharomyces cerevisiae)는 유성생식을 하는 SK1에서 유래한다. ho::hisG, leu2::hisG, ura3(PstI-SmaI), nuc1::hph (Goldstein and McCusker, 1999)이 동형접합이고 HIS4::LEU2-(BamHI)/his4X::LEU2-(NgoMIV)-URA3(Kim et al.
본 연구에서는 하나의 이중 가닥 절단이 높은 빈도로 발생되는 HIS4LEU2 “hotspot”을 지닌 야생형 출아 효모 균주를 사용하였다.
이론/모형
3′ 단일 가닥이 상동서열을 찾아 침투하고 있는 DNA와 이중 홀리데이 접합으로 연결되어 있는 DNA는 가지를 형성하고 있어 아가로즈 젤에 EtBr을 함유시키면 재조합 중간체의 구조에 따라 이동되는 속도에 차이를 보이므로 각 상태 별로 분리해낼 수 있다. 1차원 젤 전기영동 분석과 마찬가지로 Southern 분석법을 수행하여 재조합 중간체를 분석하였다(Fig. 4A).
, 2007). DNA 물리적 구조분석을 위해 이전에 기술된 방법을 사용하였다(Wanat et al., 2008; Kim et al., 2010). 1차원 젤 분석을 위해, 2 µg의 DNA를 XhoI (Enzynomics) 제한효소로 처리한 후 0.
Southern 분석법은 이전 연구에 기술된 “Probe A”를 이용하여 수행하였다(Schwacha and Kleckner, 1997). Probe는 Prime-It RmT Random Primer Labeling Kits (Agilent Technologies)를 이용하여 방사성 동위원소로 식별하였다. 혼성화한 DNA는 Bio-Rad phosphoimager and Quantity One® 소프트웨어로 정량하였다.
Southern 분석법은 이전 연구에 기술된 “Probe A”를 이용하여 수행하였다(Schwacha and Kleckner, 1997).
감수분열 재조합 과정 중 만들어지는 각각의 재조합 중간체를 분석하기 위해서 HIS4LEU2 “hotspot” system을 이용하였다(Cao et al., 1990; Hunter and Kleckner, 2001; Oh et al., 2007).
본 연구는 이중 가닥 절단, 단일 가닥 침투, 이중 홀리데이 접합과 같은 재조합 중간체와 재조합 결과물의 구조분석에 초점을 두고, 이를 출아효모에서 인위적으로 이중 가닥 절단을 발생시킬 수 있는 HIS4LEU2 “hot spot” 을 이용한 물리적 분석방법으로 감수분열 재조합 중간체를 규명하였다. 물리적 분석을 위하여 동조화 된 세포에 감수분열을 유도한 후 hot spot 자리를 인식하는 제한효소를 처리하면, 재조합 중간체를 형성하고 있는 DNA 단편들을 Southern 분석법을 통해 탐지 및 정량 할 수 있다. 본 연구는 이 시스템으로 감수분열에서 이중 가닥 절단으로부터 기인하는 단일 가닥 침투, 이중 홀리데이 접합 그리고 교차성/비교차성 재조합체로 전이되는 DNA의 구조다형을 분석할 수 있음을 제시한다.
상동인 반수체 효모 “Mom”과 “Dad” 의 유전자형을 확인하기 위하여 Yeast Tetrad Dissection Replication기법을 사용하였다.
재조합이 진행되고 있는 DNA는 전체 중의 일부이며 “hotspot”이 외에도 XhoI 에 의하여 절단된 여러 다른 조각들이 혼재하고 있기 때문에“hotspot”의 특정 염기서열을 인식할 수 있는 Probe와 방사성 동위원소(P32-dCTP)를 이용하여 Southern 분석법을 수행하였다.
성능/효과
“Mom”과 “Dad”의 DNA를 제한효소로 처리하여 각각 다른 길이의 절편으로 절단하고 이것을 정량하여 재조합의 진행과정을 모니터링하였다. 1차원 젤 전기영동으로 DNA를 분석한 결과 이중 가닥 절단은 3.5 h에서 최대치에 도달한 후 점차 감소하였고 이와 반대로 재조합 결과물들은 점차 증가하다가 이중 가닥 절단이 감소하는 시기의 3시간쯤 후에는 더 이상 증가하지 않았다. 이것은 이중 가닥 절단이 상동재조합을 통하여 회복되어 재조합 결과물들이 생성되었음을 의미한다(Fig.
YPD 고체배지 위에 포자를 하나씩 나열하고 30℃에서 2일간 배양하였다. 나열된 4개의 포자에서 증식한 콜로니 수를 측정한 결과, 이배체 효모에서 감수분열을 통해 분리된 반수체 효모는 90% 이상이 생존하였다(Fig. 2A).
이중 가닥 절단이 관찰된 시간 이후에 노출된 3′ 단일 가닥이 상동염기서열을 찾아 침투한 상태의 DNA가 관찰되었고 이중 홀리데이 접합을 형성한 상태의 DNA가 차례로 관찰되었다(Fig. 4).
후속연구
향후, 재조합 관련 단백질의 돌연변이 균주를 HIS4LEU2 “hotspot” 시스템을 이용하여 1차원 및 2차원 젤 전기영동 기법으로 분석하면 재조합에 관련된 단백질들의 경로와 기능을 밝히는데 유용할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
상동염색체 재조합 과정의 경로는 무엇에 의해 개시되는가?
유전자 재조합체는 상동염색체간의 예정된 DNA 가닥 전이와 교환이 이루어지는 상동염색체 재조합 과정에 의하여 생성된다. 이 재조합 경로는 DNA 이중 가닥 절단(double-strand breaks, DSBs)에 의해서 개시되며, 전이 과정의 중간단계에서 DNA의 구조적 변이 중간체인 단일 가닥 침투(single-end invasions, SEIs)와 이중 홀리데이 접합(double-Holliday junctions, dHJs)이 형성되어 교차성(crossover, CO) 혹은 비교차성(non-crossover, NCO) 결과물이 만들어진다. 본 연구는 이중 가닥 절단, 단일 가닥 침투, 이중 홀리데이 접합과 같은 재조합 중간체와 재조합 결과물의 구조분석에 초점을 두고, 이를 출아효모에서 인위적으로 이중 가닥 절단을 발생시킬 수 있는 HIS4LEU2 "hot spot" 을 이용한 물리적 분석방법으로 감수분열 재조합 중간체를 규명하였다.
상동재조합이란 무엇인가?
감수분열은 두 번의 연속된 분열로 염색체 수가 반감하고 상동염색체가 서로 분리된다. 다양한 종에서 감수분열은 공통적으로 2개의 상동 DNA 염기서열이 서로 교차하고, 교차가 일어난 부위의 염기서열은 원래 DNA 염기서열대로 유지된다. 이러한 재조합을 상동재조합(homologous recombination, HR)이라고 한다.
출아효모가 DNA 복제, 재조합, 세포주기 조절 등의 원리를 이해하는 모델 생물로 사용되는 까닭은 무엇인가?
출아효모는 가장 간단한 형태의 진핵 생물로 다루기 쉽고 빠르게 배양할 수 있으며, 고등생물에 이르기까지 많은 유전자가 잘 보존되어 있어 생체 내 DNA 복제, 재조합, 손상 후 회복, 세포주기 조절 등의 원리를 연구하는데 유용한 모델생물로 널리 쓰이고 있다. 출아효모는 인간의 세포주기와 매우 유사하여 DNA 복제 시 발생되는 신호경로와 단백질-단백질 또는 단백질-DNA간의 상호작용에 대해 많은 연구가 진행되어 왔다.
참고문헌 (18)
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Kim, K.P., Weiner, B.M., Zhang, L., Jordan, A., Dekker, J., and Kleckner, N. 2010. Sister cohesion and structural axis components mediate homolog bias of meiotic recombination. Cell. 143, 924-937.
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Wanat, J.J., Kim, K.P., Koszul, R., Zanders, S., Weiner, B., Kleckner, N., and Alani, E. 2008. Csm4, in collaboration with Ndj1, mediates telomere led chromosome dynamics and recombination during yeast meiosis. PLoS Genet. 4, e1000188. doi:10.1371/journal.pgen.1000188.
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