공업적 목적으로 사용된 후의 아연은 육지와 수계로 유입되며, 토양으로 유입된 후의 아연은 부식되어 수계로 유입된다. 과량의 아연은, 수서생물에 대해 중금속으로서 독성을 가지며 수서 동 ${\cdot}$ 식물의 성장억제를 유발하고, 나아가서는 동물의 기형발생을 초래한다. 본 연구에서는 FETAX (frog embryo teratogenetic assay with Xenopus) 방법에 의해 in vivo에서 과량 아연의 독성을 밝혔다. st. 9 시기에 있는 Xenopus 개구리의 배를 $100{\sim}900\;{\mu}M$$ZnCl_2$용액에 7일간 노출시켰을 때 100 ${\mu}M$ 아연에서는 81%의 개체가 생존하였고 1000 ${\mu}M$ 에서는 25%가 생존하였다. 그 결과 외형적 이상은 복부팽만과 소화관 형성부전이 일반적으로 나타났고 200 ${\mu}M$ 이상의 아연처리 시 모든 개체에서 이러한 현상이 나타났다. 400 ${\mu}M$ 이상의 농도에서는 모든 개체에서 심장탈색을 보였다. 또한 신체의 탈색과 눈의 수정체 헤르니아, 그리고 느슨한 소화관은 100 ${\mu}M$ 이상의 아연처리에서 매우 빈번히 나타났다. 아연처리 된 유생의 파라핀 조직절편에서는 망막의 광수용기의 파괴, 눈의 초자체방 축소, 심장적혈구수의 감소, 비정상적 간조직, 원신관 세포의 팽윤, 근육형성부전, 그리고 구전정의 유두종 형성 등의 이상을 보였다. 이러한 이장은 미토콘드리아의 파괴 $Ca^{2+}$과 $Zn^{2+}$의 치환에 의한 세포결합의 저해, 그리고 아연에 의한 적혈구내 leghemoglobin의 형성 등이 원인일 것이다. 과량 아연에 의해 유생의 체장은 감소하였고, 통계분석 결과 체장은 대조군의 체장과 비교했을 때, 300 ${\mu}M$ 아연처리 군부터 매우 유의미하게 체장의 감소가 나타났다. 현재 자연상태에서 양서류의 수적감소와 기형발생이 세계적으로 보고되고 있으며, 본 연구의 결과로 고려했을 때, 과잉 아연은 수계를 오염시켜 양서류의 수적감소를 일으키는 중요한 원인물질로 생각되므로 이의 관리에 관심을 두어야 할 것이다.
공업적 목적으로 사용된 후의 아연은 육지와 수계로 유입되며, 토양으로 유입된 후의 아연은 부식되어 수계로 유입된다. 과량의 아연은, 수서생물에 대해 중금속으로서 독성을 가지며 수서 동 ${\cdot}$ 식물의 성장억제를 유발하고, 나아가서는 동물의 기형발생을 초래한다. 본 연구에서는 FETAX (frog embryo teratogenetic assay with Xenopus) 방법에 의해 in vivo에서 과량 아연의 독성을 밝혔다. st. 9 시기에 있는 Xenopus 개구리의 배를 $100{\sim}900\;{\mu}M$$ZnCl_2$용액에 7일간 노출시켰을 때 100 ${\mu}M$ 아연에서는 81%의 개체가 생존하였고 1000 ${\mu}M$ 에서는 25%가 생존하였다. 그 결과 외형적 이상은 복부팽만과 소화관 형성부전이 일반적으로 나타났고 200 ${\mu}M$ 이상의 아연처리 시 모든 개체에서 이러한 현상이 나타났다. 400 ${\mu}M$ 이상의 농도에서는 모든 개체에서 심장탈색을 보였다. 또한 신체의 탈색과 눈의 수정체 헤르니아, 그리고 느슨한 소화관은 100 ${\mu}M$ 이상의 아연처리에서 매우 빈번히 나타났다. 아연처리 된 유생의 파라핀 조직절편에서는 망막의 광수용기의 파괴, 눈의 초자체방 축소, 심장적혈구수의 감소, 비정상적 간조직, 원신관 세포의 팽윤, 근육형성부전, 그리고 구전정의 유두종 형성 등의 이상을 보였다. 이러한 이장은 미토콘드리아의 파괴 $Ca^{2+}$과 $Zn^{2+}$의 치환에 의한 세포결합의 저해, 그리고 아연에 의한 적혈구내 leghemoglobin의 형성 등이 원인일 것이다. 과량 아연에 의해 유생의 체장은 감소하였고, 통계분석 결과 체장은 대조군의 체장과 비교했을 때, 300 ${\mu}M$ 아연처리 군부터 매우 유의미하게 체장의 감소가 나타났다. 현재 자연상태에서 양서류의 수적감소와 기형발생이 세계적으로 보고되고 있으며, 본 연구의 결과로 고려했을 때, 과잉 아연은 수계를 오염시켜 양서류의 수적감소를 일으키는 중요한 원인물질로 생각되므로 이의 관리에 관심을 두어야 할 것이다.
Concentrated releases of zinc into water usually results from discharges associated with industrial purpose. The released zinc into soil is corroded and released into water. In aquatic environment, exess zinc is toxic to the organisms and causes the growth inhibition and malformation of them as a he...
Concentrated releases of zinc into water usually results from discharges associated with industrial purpose. The released zinc into soil is corroded and released into water. In aquatic environment, exess zinc is toxic to the organisms and causes the growth inhibition and malformation of them as a heavy metal. In this study, excess zinc toxicity was tested by FETAX (frog embryo teratogenetic assay with Xenopus)as in vivo system. Xenopus embryos at st.9 were exposed to $100{\sim}900\;{\mu}M$ of zinc for 7 days and 81% of individuals were survived in 100 ${\mu}M$, and 25% were survived in 1000M of zinc solution. In external malformations, swelled belly and intestinal dysplasia were common, and all of tested individuals showed these malformations in 200 ${\mu}M$ or higher concentration of zinc. In 400 ${\mu}M$ or higher concentration, all of tested tadpoles showed faded heart. Also, hypo-pigmentation, lens hernia and loose digestive track were very frequently found in 100 ${\mu}M$ of zinc. The histological study with paraffin section of zinc treated tadpoles showed following abnormalities; regeneration of photoreceptor on retina, reduced vitreous chamber in eye, reduction of red blood cells in heart, abnormal liver, swelling of pronephric cell, muscle dysplasia and palatal papilloma. These abnormalities may be caused by the degeneration of mitochondria, inhibition of cell adhesion, and the formation of leghemoglobin by zinc due to the substitution of $Ca^{2+}$ by $Zn^{2+}$. The body length was reduced due to the excess zinc. From a statistical result, body lengths of 300 ${\mu}M$ or higher concentrative g개ups was significantly reduced comparing that of control group. Recently, many spontaneous malformations and reduction of amphibians are reported, From the results of present study, excess zinc mi호t be a factor of amphibian reduction, and the control of zinc discharges is very important.
Concentrated releases of zinc into water usually results from discharges associated with industrial purpose. The released zinc into soil is corroded and released into water. In aquatic environment, exess zinc is toxic to the organisms and causes the growth inhibition and malformation of them as a heavy metal. In this study, excess zinc toxicity was tested by FETAX (frog embryo teratogenetic assay with Xenopus)as in vivo system. Xenopus embryos at st.9 were exposed to $100{\sim}900\;{\mu}M$ of zinc for 7 days and 81% of individuals were survived in 100 ${\mu}M$, and 25% were survived in 1000M of zinc solution. In external malformations, swelled belly and intestinal dysplasia were common, and all of tested individuals showed these malformations in 200 ${\mu}M$ or higher concentration of zinc. In 400 ${\mu}M$ or higher concentration, all of tested tadpoles showed faded heart. Also, hypo-pigmentation, lens hernia and loose digestive track were very frequently found in 100 ${\mu}M$ of zinc. The histological study with paraffin section of zinc treated tadpoles showed following abnormalities; regeneration of photoreceptor on retina, reduced vitreous chamber in eye, reduction of red blood cells in heart, abnormal liver, swelling of pronephric cell, muscle dysplasia and palatal papilloma. These abnormalities may be caused by the degeneration of mitochondria, inhibition of cell adhesion, and the formation of leghemoglobin by zinc due to the substitution of $Ca^{2+}$ by $Zn^{2+}$. The body length was reduced due to the excess zinc. From a statistical result, body lengths of 300 ${\mu}M$ or higher concentrative g개ups was significantly reduced comparing that of control group. Recently, many spontaneous malformations and reduction of amphibians are reported, From the results of present study, excess zinc mi호t be a factor of amphibian reduction, and the control of zinc discharges is very important.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 in vivo 독성실험으로서 Xenopus laevis의 포배기에 아연을 100~1000 μM의 생존범위 내에서 7일간 처리하였을 때의 독성을 밝히고, 개체발생 시 기관형성에 과량의 아연이 미치는 외형적 이상 및 조직학적 이상을 밝히고자 하였다. 그리고 과량의 아연이 함유된 수환경이 양서류에게 초래하는 독성 및 이상을 밝힘으로써 최근 양서류의 격감원인을 규명하는데 도움을 줄 것으로 생각한다.
과량의 아연은, 수서생물에 대해 중금속으로서 독성을 가지며 수서 동 · 식물의 성장억제를 유발하고, 나아가서는 동물의 기형발생을 초래한다. 본 연구에서는 FETAX (frog embryo teratogenetic assay with Xenopus) 방법에 의해 in vivo에서 과량 아연의 독성을 밝혔다. st.
또한 아연은 체내에 생존에 필요한 물질로서 가지고 있으면서도 인간의 간섭에 의해 수중 생물에 독성을 유발할 수 있으므로 수서 환경오염원으로서 매우 중요한 물질이라 할 수 있다. 본 연구에서는 수서 생태계에서 소량의 육수에서 살면서 육상으로부터의 영향을 평생 받고 그 자손에게까지 영향을 물려주게 되는 양서류에 대한 아연의 영향에 초점을 맞추었으며 국내의 양서류종으로 초기발생 이상을 연구하는 것이 더욱 이상적일 수 있겠으나, 다수 개체로 반복실험을 해야 하는 특성상 양서류로서 독성실험 재료로 확립 된 Xenopus laevise 대하여 아연의 독성 을 연구하게 되었다.
가설 설정
Leukocytes are increased but erythrocytes are severely decreased. bar: 50 μm; Plate 11. Normal eye is seen in 7day-tadpole. Vitreous chamber (blank arrow) is distinct.
Photoreceptor cells (open arrowhead) are degenerated. bar: 50 μm; Plate 13. Many of mature erythrocytes in atrium of normal tadpole. LA: left atrium.
LA: left atrium. bar: 50 μm; Plate 14. Red blood cells of atrium are reduced by excess zinc. Erythrocytes are degenerated and leukocytes are increased.
NT: notochord M: muscle PN: pronephric duct E: esophagous L: liver SI: small intestine S: spinal cord. bar: 100 μm; Plate 16. The abnormalities in abdomens were caused by excess zinc. Swelled pronephric duct (PN), loose liver tissue (L), muscular dysplasia (M), and eosinophilic
The hypo-pigmentation is distinct in eye, in dorsal region and in abdomen of abnormal tadpole. bar: 1 mm; Plate 2. The serial changes were seen in 7 day-tadpoles to the concentration of zinc. From the right side, the tadpoles exposed to Steinberg's solution (saline), 200, 400, 600, 800 and 1000 μm of zinc, respectively.
Paraffin section and H-E stain. Open arrow head: tongue, bar: 50 μm; Plate 7. Normal pronephric duct are seen in 7 day-tadpoles. Nucleus is located centrally and the cell inclusions are somewhat basic and clear.
제안 방법
Xenopus laevis는 수입하여 (Xenopus I : USA) 실험실 20~23℃ 수조에서 유지하였다. 3년 이상 성적으로 성숙된 암수개체를 사용하여, 산란을 위해 암수 공히500~800 IU씩HCG (human chorionic gonadotrophin)를 주사하여 수정란을 얻고 3% cystein hydrochloride (pH 7.8)로 젤리층을 제거한 뒤에 멸균된 Steinberg’s 생리식염수(pH 7.4)로 수 회 세척하였다.
멸균된 petri dish에서 stage. 9(후기포배기)의 난을 선별하여 Steinberg, s 생리식염수로 2이에서 1주일간 배양한 정상배를 대조구로 하였다. 처리구는 zinc chloride (Sigma) 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 μM (in Steinberg's solution)의 농도에서 각 농도당 100개체씩 처리한 뒤, 역시 20℃에서 1주일 배양하였다.
일주일 배양된 올챙이는 투명하여 외부에서 거의 모든 기관이 관찰되며 농도별로 수거하여 실체현미경하에서 박동하는 심장의 색을 관찰, 심장내 혈액의 변화를 기록하였다. 그리고 외형적 이상을 관찰하여 농도별로 그 비율을 기록하였다.
다시 50%, 70%, 90%, 100% ethanol 탈수과정을 거친 후 mount 용액 (Permount)으로 봉입하여 광학현미경(Olympus Bx50)으로 관찰하였다. 조직표본은 대조군, 800 μM과 1000 μM 처리 개체 중 20개체씩 작성하여 현미경하에서 조직판독 후 이상조직의 비율을 기록하였다.
대조구 및 아연에 7일 처리한 올챙이 중 생존한 개체의 고정표본을 농도별 정리한 후 100개체씩 무작위 추출하고, 체장을 해부현미경하에서 micrometer로 측정하였다. 측정을 위해 이동되는 도중 파손된 표본은 측정대상에서 제외되었으며 각 농도별 개체에 대하여 평균길이와 표준편차를 구하여 대조군에 비해 유의미한 체장변화를 나타내기 시작하는 농도를 구하였다.
그리고 1100 μM의 농도 처리도 하였으나 모든 개체가 치사되지는 않았고 10% 이상의 생존율을 보였다. 본 연구에서는 정확한 LD (lethal density)를 찾는 것이 목표가 아니므로 올챙이가 약간의 운동을 하면서 생존할 수 있는 1000 μM까지만 기록하였다 (Table 1).
1, Plate 10 and 16). 이러한 조직학적 이상의 구체적 경향을 파악하기 위해 대조군과 800μM, 1000μM의 고농도 아연처리 개체에 대하여 농도별 20개체씩의 절편표본으로 7종류의 조직학적 이상에 대하여 비율을 조사하였다. 눈의 망막에서 광수용세포는 최고 83%의 개체에서 붕괴를 보였고 초자체방(vitreous chamber)의 소실은 88%까지 나타났으며 적혈구수의 감소는 1000 μM에서 100%로 나타났다.
실험은 7회 하였으며 대조군의 올챙이가 모두 생존한 경우의 결과 중 하나를 택하였다. 일주일 배양된 올챙이는 투명하여 외부에서 거의 모든 기관이 관찰되며 농도별로 수거하여 실체현미경하에서 박동하는 심장의 색을 관찰, 심장내 혈액의 변화를 기록하였다. 그리고 외형적 이상을 관찰하여 농도별로 그 비율을 기록하였다.
다시 50%, 70%, 90%, 100% ethanol 탈수과정을 거친 후 mount 용액 (Permount)으로 봉입하여 광학현미경(Olympus Bx50)으로 관찰하였다. 조직표본은 대조군, 800 μM과 1000 μM 처리 개체 중 20개체씩 작성하여 현미경하에서 조직판독 후 이상조직의 비율을 기록하였다.
9(후기포배기)의 난을 선별하여 Steinberg, s 생리식염수로 2이에서 1주일간 배양한 정상배를 대조구로 하였다. 처리구는 zinc chloride (Sigma) 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 μM (in Steinberg's solution)의 농도에서 각 농도당 100개체씩 처리한 뒤, 역시 20℃에서 1주일 배양하였다. 이 때 참고로 최고 농도의 ZnCl2 처리시 주어지는 Cl의 양의 증가는 Xenopus 배에 영향을 주지 않을 정도이다.
측정을 위해 이동되는 도중 파손된 표본은 측정대상에서 제외되었으며 각 농도별 개체에 대하여 평균길이와 표준편차를 구하여 대조군에 비해 유의미한 체장변화를 나타내기 시작하는 농도를 구하였다. 유의성 검증을 위해서 Student's t-test의 독립표본 검증법을 사용하였다.
관찰할 수 있다. 포배기부터 1주일간 100~1000 μM까지 아연 처리한 개체를 다시 Steinberg’solution에서 7일간 키웠을 때 심장의 혈액색의 회복율을 조사하였다. 그 결과 100 μM 전처리개체에서 조차도 완전하게 심장 색을 회복한 개체는 없었으며 저농도 전처리 개체일수록 약간씩의 회복은 관찰되었다.
(photoreceptor)의 형성, 신장, 심장 및 혈액에 이상이 나타난 것으로 확인되었다. 혀가 보이는 조직 절편에서 구강전정을 확인하여 정상개체의 구전정은 단층의 편평 상피 인 것을 관찰하였다 (Fig. 1, Plate 5). 과량 아연 처리에 의해 구전정은 다층의 papilloma 유사구조를 보여주었으며 각 세포의 형태는 둥글게, 또는 비정 형으로 부풀어 있었다 (Fig.
후기포배기부터 일주일간 배양한 대조구 및 처리구의 올챙 이를 Bouin's solution (Picric acid 15 : Formalin 5 : Acetic acid 1)에 3~16시간 고정한 후, 70%, 90%, 100% ethan이로 탈수하고 paraffin (Paraplast Plus: Sigma) 포매하여 microtome으로 6~8 μm로 절편한 후 xylene으 로 paraffin을 제거하고 100%, 90%, 70%, 50% ethanol로 탈수한 다음, hematoxylin-eosin으로 염색하였다. 다시 50%, 70%, 90%, 100% ethanol 탈수과정을 거친 후 mount 용액 (Permount)으로 봉입하여 광학현미경(Olympus Bx50)으로 관찰하였다.
대상 데이터
The tested tadpoles of each concentration were 20 individuals.
데이터처리
23 mm로 줄어들었다. 유생은 아연의 농도가 증가할수록 길이는 감소하고 폭은 오히려 증가하는 양상을 보였으며 이의 유의성을 검증하기 위해 t-test를 행하였다. 그 결과 대조군과 100 μM 처리군, 대조군과 200 μM 처리군 사이에는 각각 비교시 유의도가 낮아 그 차이에 대한 의미가 없는 것으로 나타났다.
측정을 위해 이동되는 도중 파손된 표본은 측정대상에서 제외되었으며 각 농도별 개체에 대하여 평균길이와 표준편차를 구하여 대조군에 비해 유의미한 체장변화를 나타내기 시작하는 농도를 구하였다. 유의성 검증을 위해서 Student's t-test의 독립표본 검증법을 사용하였다.
이론/모형
실험중 먹이 공급은 하지 않았으며 배양용기는 무처리 표면 및 멸균 96-well plate를 사용하였고 1 well당 1개씩의 배를 넣고, 대조구 및 처리배양액은 120 Rl씩 분주하였다. Xenopus의 배 발생단계는 Nieuwkoop과 Faber(1956)를 따랐다. 배의 독성실험은 배의 초기 상태에 따라 약간씩 그 결과가 달라지며 초기 배의 대조군이 모두 생존하는 경우를 가장 이상적인 상태의 재료로 간주하였다.
성능/효과
St. 9시기에 100 μM부터 1000 μM까지 100 μM 간격으로 아연을 처리한 결과 각 농도별 100개체에 대한 독성효과를 생존율로 파악할 수 있었다. 대조구에서 7일간 100% 생존하는 초기유생이 아연의 처리농도에 따라 100 μM에서는 81%가 생존하였고 200 μM에서는 85%, 300 μM에서는 85%, 400 μM에서는 77%, 500 μM에서는 71%가 생존하였고 아연농도가 높아짐에 따라 생존율이 점차로 낮아져 1000 μM(=1mM)에서는 25%의 낮은 생존율을 보였다.
포배기부터 1주일간 100~1000 μM까지 아연 처리한 개체를 다시 Steinberg’solution에서 7일간 키웠을 때 심장의 혈액색의 회복율을 조사하였다. 그 결과 100 μM 전처리개체에서 조차도 완전하게 심장 색을 회복한 개체는 없었으며 저농도 전처리 개체일수록 약간씩의 회복은 관찰되었다. 그러나 600 μM 이상의 고농도 전처리개체들은 전혀 회복되지 않았다.
유생은 아연의 농도가 증가할수록 길이는 감소하고 폭은 오히려 증가하는 양상을 보였으며 이의 유의성을 검증하기 위해 t-test를 행하였다. 그 결과 대조군과 100 μM 처리군, 대조군과 200 μM 처리군 사이에는 각각 비교시 유의도가 낮아 그 차이에 대한 의미가 없는 것으로 나타났다. 그러나 300 μM 처리군부터는 대조군과 비교시 매우 유의미 한 차이가 있는 것으로 나타났다 (Table 3).
9 시기에 있는 Xenopus 개구리의 배를 100~ 900μM ZnCl2 용액에 7일간 노출시켰을 때 100μM 아연에서는 81%의 개체가 생존하였고 1000 μM에서는 25% 가 생존하였다. 그 결과 외형적 이상은 복부팽만과 소화관 형성부전이 일반적으로 나타났고 200 μM 이상의 아연처리 시 모든 개체에서 이러한 현상이 나타났다. 400 μM 이상의 농도에서는 모든 개체에서 심장탈색을 보였다.
대조구에서 7일간 100% 생존하는 초기유생이 아연의 처리농도에 따라 100 μM에서는 81%가 생존하였고 200 μM에서는 85%, 300 μM에서는 85%, 400 μM에서는 77%, 500 μM에서는 71%가 생존하였고 아연농도가 높아짐에 따라 생존율이 점차로 낮아져 1000 μM(=1mM)에서는 25%의 낮은 생존율을 보였다. 그리고 1100 μM의 농도 처리도 하였으나 모든 개체가 치사되지는 않았고 10% 이상의 생존율을 보였다. 본 연구에서는 정확한 LD (lethal density)를 찾는 것이 목표가 아니므로 올챙이가 약간의 운동을 하면서 생존할 수 있는 1000 μM까지만 기록하였다 (Table 1).
이러한 조직학적 이상의 구체적 경향을 파악하기 위해 대조군과 800μM, 1000μM의 고농도 아연처리 개체에 대하여 농도별 20개체씩의 절편표본으로 7종류의 조직학적 이상에 대하여 비율을 조사하였다. 눈의 망막에서 광수용세포는 최고 83%의 개체에서 붕괴를 보였고 초자체방(vitreous chamber)의 소실은 88%까지 나타났으며 적혈구수의 감소는 1000 μM에서 100%로 나타났다. 원신관 세포와 간조직의 붕괴는 매우 심각했으며 근육 형성 부전도 대부분의 개체에서 나타났다.
9시기에 100 μM부터 1000 μM까지 100 μM 간격으로 아연을 처리한 결과 각 농도별 100개체에 대한 독성효과를 생존율로 파악할 수 있었다. 대조구에서 7일간 100% 생존하는 초기유생이 아연의 처리농도에 따라 100 μM에서는 81%가 생존하였고 200 μM에서는 85%, 300 μM에서는 85%, 400 μM에서는 77%, 500 μM에서는 71%가 생존하였고 아연농도가 높아짐에 따라 생존율이 점차로 낮아져 1000 μM(=1mM)에서는 25%의 낮은 생존율을 보였다. 그리고 1100 μM의 농도 처리도 하였으나 모든 개체가 치사되지는 않았고 10% 이상의 생존율을 보였다.
이 현상은 100]M 농도에서 44%로 높게 나타났고 2001μM부터는 100%로 나타나 아연처리에 의해 매우 강하게 나타나는 이상이었다. 두폭이 정상보다 넓어지는 현상은 안배의 비정상적 인형 태형 성에 의하여 생기며 본 실험에서는 정상안배 보다 길고 가늘게 나타났다. 이 기형은 100 μM에서 54% 로 발생 하여 300 μM 이 상에서는 100%로 나타났다.
그러나 아연 처리개체는 정상적인 눈의 방향, 즉 렌즈의 정상 방향발달을 보여주지 못하여 꼬리 쪽을 향하고 있고 초자체방 소실에 의한 수정체 헤르니아가 확인되었다. 또한 광수용세포의 붕괴가 뚜렷하게 관찰되었으며 색소상피는 불균일하게 망막층내에 분산되어 있어 정상적인 시각형성을 할 수 없음을 시사하였다(Fig. 1, Plate 12). 신관은 정상적인 경우 세포가 팽대되어 있지 않고 핵은 가운데에 위치하며 세포 내 함유물이 과다하게 포함되어 있지 않았다 (Fig.
1, Plate 1). 또한 몸의 색소저하, 몸이 전체적으로 줄어들면서 지느러미는 더 커지고 주름이 지는 현상 (Fig. 1, Plate 2), 피부에 수포가 생기는 현상, 눈의 수정체 헤르니아, 굵어지고 짧아져 회전이 감소한 소화관 (Fig. 1, Plate 4), 눈의 발생저해 및 안배의 발달 이상으로 두폭이 넓어지는 현상 (Fig. 1, Plate 3), 눈의 맥락막 열구 (opened choroid), 외부에서 관찰이 되는 심장내의 붉은 색 저하, 안배의 색소상피 이상 등 10가지의 외형적 이상이 아연농도 의존적으로 나타났다. 아연 처리에 의해 복부가 부풀어 오르고 복수가 차는 현상은 아연농도에 따라 매우 민감하게 나타났으며 200 μM 이상의 농도에서는 100%로 나타났으며 , 농도가 높을수록 정도가 더 심하였다 (Fig.
400 μM 이상의 농도에서는 모든 개체에서 심장탈색을 보였다. 또한 신체의 탈색과 눈의 수정체 헤르니아, 그리고 느슨한 소화관은 100 μM 이상의 아연처리에서 매우 빈번히 나타났다. 아연처리 된 유생의 파라핀 조직절편에서는 망막의 광수용기의 파괴, 눈의 초자체방 축소, 심장적혈구수의 감소, 비정상적 간조직, 원신관 세포의 팽윤, 근육형성부전, 그리고 구전정의 유두종 형성 등의 이상을 보였다.
먼저 외형적으로는 확인이 되지 않는 조직학적 이상을 확인하기 위해 paraffin 절편을 하였으며 그 결과 구전정상피, 등쪽 체절 즉 근육의 분화정도, 안배 형성 및 광수용세포 (photoreceptor)의 형성, 신장, 심장 및 혈액에 이상이 나타난 것으로 확인되었다. 혀가 보이는 조직 절편에서 구강전정을 확인하여 정상개체의 구전정은 단층의 편평 상피 인 것을 관찰하였다 (Fig.
두더지에 아연을 처리하였을 때 아연이 축적되는 기관의 연구에서 신장이 포함되었으며(Komarnicki, 2000), Metallothionein null mouse에 대한 아연 실험에서 신장의 보오만낭이 부풀어오르는 것이 보고되었다 (Kelly et al, 1996). 본 실험에서도 Xenopus 중신의 초기 기관인 원신관의 구성세포가 부풀어올라 이와 동일한 결과가 나타났으며 paraffin section에서는 eosin 호성과립이 증가된 것이 특징이었다. 아연에 의한 근육의 발달부전에 대해서는 자세히 연구된 바 없으며본 연구에서 아연에 의해 근섬유 다발이 가늘어진 것이 확인되었고 Ca2+의 저장고인 근형질세망이 상대적으로빈번하게 분포하여 정상적인 근수축에도 영향을 미칠것으로 생각한다.
Xenopus는 발생부터 평생 물 속에서만 사는 양서류로서 초기에 아연 과량 처리에 의해 가장 영향을 많이 받고 있는 부분은 물의 접촉이 빈번한 피부, 구강, 인두 등이라 할 수 있다. 본 연구에서 구전정 상피는 그러한 생각에서 관찰되었으며 예상대로 심각한 Papilloma-like structure를 보여주었다.
수정체 헤르니아는 정상 배의 수정체가 맥락막으로 둘러싸인 안배 (optic cup)에 함몰되어 있는 반면, 초자방이 없어지면서 수정체가 안배 밖으로 돌출하고 있는 현상으로 400 μM 처리부터는 모든 개체에서 나타났다. 소화관은 3일 배 (st. 43)를 관찰한 경우에도 발달 및 회전이 잘 관찰됨에도 불구하고 아연처리개체에서는 1 주일 유생에서도 소화관의 회전이 잘 일어나지 않으며 직장이 길어지는 현상을 보였다. 이 현상은 100]M 농도에서 44%로 높게 나타났고 2001μM부터는 100%로 나타나 아연처리에 의해 매우 강하게 나타나는 이상이었다.
1, Plate 3), 눈의 맥락막 열구 (opened choroid), 외부에서 관찰이 되는 심장내의 붉은 색 저하, 안배의 색소상피 이상 등 10가지의 외형적 이상이 아연농도 의존적으로 나타났다. 아연 처리에 의해 복부가 부풀어 오르고 복수가 차는 현상은 아연농도에 따라 매우 민감하게 나타났으며 200 μM 이상의 농도에서는 100%로 나타났으며 , 농도가 높을수록 정도가 더 심하였다 (Fig. 1, Plate 2). 색소저하 현상은 정상 배의 멜라닌 색소가 등 쪽 중추신경계주변과 복막주변에 풍부하게 분포된 반면 색소 부족 현상으로 흰색으로 보이는 것을 말한다.
아연에 의한 근육의 발달부전에 대해서는 자세히 연구된 바 없으며본 연구에서 아연에 의해 근섬유 다발이 가늘어진 것이 확인되었고 Ca2+의 저장고인 근형질세망이 상대적으로빈번하게 분포하여 정상적인 근수축에도 영향을 미칠것으로 생각한다. 아연에 의해 심장 탈색을 일으킨 7일유생을 생리식 염수에서 다시 7일 키웠을 때 600 μM 이상의 고농도 전처리 개체에서는 적혈구의 수와 심장의상태에서 전혀 회복되지 않았으며 이는 지나친 고농도의 아연 전처리에 의해 혈구형성자체가 저해되어 혈구가 고갈되는 것으로 보인다. 이러한 현상은 세포 내 미토콘드리아의 파괴, Ca2+과 Zn2+의 치환에 의한 세포접착저해 등이 그 원인으로 생각된다.
그러나 아연 처리 시 색소의 불연속적 분포를 보이며 200 μM 이상에서는 2%로 나타나기 시작하여 700 μM 부터는 100%로 나타났다. 아연을 처리한 개체는 해부현미경하에서 생체 관찰을 했을 때 박동심장 및 새궁혈관의 붉은 색이 옅어져 고농도에서는 무색으로 바뀐다는 것을 알았다. 즉 100 μM 농도에서는 9%의 무색 심장이 관찰되었으며 이 때는 완전한 무색이 아니라 약간의 붉은 색이 도는, 그러나 정상심장과는 뚜렷이 구분되는 무색에 가까운 심장 및 혈관을 보여 주었다.
또한 신체의 탈색과 눈의 수정체 헤르니아, 그리고 느슨한 소화관은 100 μM 이상의 아연처리에서 매우 빈번히 나타났다. 아연처리 된 유생의 파라핀 조직절편에서는 망막의 광수용기의 파괴, 눈의 초자체방 축소, 심장적혈구수의 감소, 비정상적 간조직, 원신관 세포의 팽윤, 근육형성부전, 그리고 구전정의 유두종 형성 등의 이상을 보였다. 이러한 이상은 미토콘드리아의 파괴, Ca2+과 Zn2+의 치환에 의한 세포결합의 저해, 그리고 아연에 의한 적혈구내 leghemoglobin의 형성 등이 원인일 것이다 과량 아연에 의해 유생의 체장은 감소하였고, 통계분석 결과 체 장은 대 조군의 체 장과 비교했을 때 , 300 μM 아연처리 군부터 매우 유의미하게 체장의 감소가 나타났다.
고농도로 갈수록 심장탈색의 정도는 심하였고 이에 대한 조직학적 확인은 다른 신체기관과 함께 행하였다. 안배의 기부, 즉 망막의 외측에는 멜라닌색소 층이 두텁게 배열되어 있는 것이 정상적이나 아연처리시 색소층이 얇아졌으며 이 현상은 500 μM부터 낮은 비율로 나타나기 시 작하여 1000 μM에서는 44%로 나타나 인접하여 연속된 맥락막보다는 아연의 영향을 훨씬 덜 받는 것으로 나타났다 (Table 2).
아연처리 된 유생의 파라핀 조직절편에서는 망막의 광수용기의 파괴, 눈의 초자체방 축소, 심장적혈구수의 감소, 비정상적 간조직, 원신관 세포의 팽윤, 근육형성부전, 그리고 구전정의 유두종 형성 등의 이상을 보였다. 이러한 이상은 미토콘드리아의 파괴, Ca2+과 Zn2+의 치환에 의한 세포결합의 저해, 그리고 아연에 의한 적혈구내 leghemoglobin의 형성 등이 원인일 것이다 과량 아연에 의해 유생의 체장은 감소하였고, 통계분석 결과 체 장은 대 조군의 체 장과 비교했을 때 , 300 μM 아연처리 군부터 매우 유의미하게 체장의 감소가 나타났다. 현재 자연상태에서 양서류의 수적감소와 기형발생이 셰계적으로 보고되고 있으며, 본 연구의 결과로 고려했을 때, 과잉 아연은 수계를 오염시켜 양서류의 수적감소를 일으키는 중요한 원인물질로 생각되므로 이의 관리에 관심을 두어야 할 것이다.
초기 배에 대한 과량 아연의 기형발생 실험결과 생존한 개체를 대상으로 외형적 결함을 조사한 결과 복부가 부풀어 오르는 현상과 체장 (body length)이 아연농도 상승에 따라 짧아지는 현상이 뚜렷하였다 (Fig. 1, Plate 1). 또한 몸의 색소저하, 몸이 전체적으로 줄어들면서 지느러미는 더 커지고 주름이 지는 현상 (Fig.
후속연구
조직학적 이상을 밝히고자 하였다. 그리고 과량의 아연이 함유된 수환경이 양서류에게 초래하는 독성 및 이상을 밝힘으로써 최근 양서류의 격감원인을 규명하는데 도움을 줄 것으로 생각한다.
이러한 양서류의 발생이상은 내분비장애물질 등의 영향도 있을 수있으나 수계에 존재하는 중금속의 영향도 매우 크다고할 수 있다. 따라서 아연이 양서류에 대하여 나타내는 본 연구의 독성효과로 판단하여, 과잉 아연이 우리나라 양서류의 수적 감소의한 원인이 될 수 있다고 생각되며, 공업적 목적으로 사용된 아연이 수계로 유입되는 일이 없도록 더욱 철저한 관리가 필요하다고 사료된다. 외국에서는 수계의 과잉 아연을 제거하는 기술이 발표되는 등 (Abdel-Halim et al.
이러한 이상은 미토콘드리아의 파괴, Ca2+과 Zn2+의 치환에 의한 세포결합의 저해, 그리고 아연에 의한 적혈구내 leghemoglobin의 형성 등이 원인일 것이다 과량 아연에 의해 유생의 체장은 감소하였고, 통계분석 결과 체 장은 대 조군의 체 장과 비교했을 때 , 300 μM 아연처리 군부터 매우 유의미하게 체장의 감소가 나타났다. 현재 자연상태에서 양서류의 수적감소와 기형발생이 셰계적으로 보고되고 있으며, 본 연구의 결과로 고려했을 때, 과잉 아연은 수계를 오염시켜 양서류의 수적감소를 일으키는 중요한 원인물질로 생각되므로 이의 관리에 관심을 두어야 할 것이다.
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