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가설 설정
- Animal cap explants cultivated in a mixed solution of bFGF and HGF chloride for 3 days, paraffin embedded, sectioned and stained with hematoxylin-eosin. A: Atypical epithelia (at) were differentiated in Steinberg's solution. B; With the single dose of 10 ng/ntl of HGF, explants differentiated only atypical epithelium (at), as in the control soluiion.
- The induction competence of animal cap explants to bFGF and HGF. A: Control explants differentiate atypical epithelium after 3 days of culture in Steinberg s solution. B: Explants cultured in 10 ng/ml of bFGF for 3 days.
제안 방법
- 처리구는 0. 0.5, 1, 10, 50 ng/ml 농도의 bFGF (in 0.1% BSA in Steinberg's solution)와 0, 1, 10, 50, 100 ng/ml 농도의 HGF를 농도별로 조합하여 동물극분리편에 처리한 뒤 역시 정상배가 stage 43에 이를 때까지 배양하였다. 배양용기는 표면처리 안 된 멸균제 96-well plate를 사용하였고, 분리편은 농도 조합 당 20개 정도씩 하였으며 1 well당 1개씩, 대조구 및처리배양액은 120 μl씩 분주하였다[16].
- Stage 43에 이른 정상배와 대조구 및 처리구의 배양조직은 Bouin's solution에 3시간 고정 후 70%, 90%, 100% eth-anol로 탈수하고 파라핀에 포매하여 6~8 Jim로 절편한 후 xylene으로 파라핀을 제거하고 100%, 90%, 70%, 50% eth-anol로 탈수한 다음, hematoxylin-eosin으로 염색하였다. 다시 50%, 70%, 90%, 100% ethanol 탈수과정을 거친 후 봉입하여 관찰하였다.
- Stage 43에 이른 정상배와 대조구 및 처리구의 배양조직을 PLP(poly-lysin-paraformaldehyde) 고정액으로 2시간 고정한 후 PBS로 세척하고, 10%, 20%, 30% sucrose에 각 30분씩 치환하였다. 그리고 OCT compound 로 포매하여 10 pm 두께로 동결절편한 후 실온에서 건조시킨 다시 4% formaldehyde solution으로 5분간 조직을 고정하고 PBS로 세척하였다.
- Xenopus의 동물극분리편에 activin A와 HGF를 복합 처리한 기관분화 경향에 대한 실험은 본 연구진에 의해 이루어진 바있으며 activin A 단독처리시 보다 시멘트선, 뇌, 눈, 청낭등 두부기관의 발생이 높은 비율로 분화하였다. 뿐만 아니라 activin A에 HGF가 고농도로 복합처리 되 었을 때 배 양 분리 편에서는 특히 신관이 잘 분화하였다.
- 뿐만 아니라 activin A에 HGF가 고농도로 복합처리 되 었을 때 배 양 분리 편에서는 특히 신관이 잘 분화하였다. 그러나 HGF와 중배 엽 유도활성이 강한 bFGF의 복합처 리에 의한 기관분화에 대한연구는 이루어진 바 없어 본 연구에서는 HGF를 bFGF와 함께 처리하여 분리편내 기관분화 및 유도(induction)경향을관찰하였다. HGF와 bFGF의 복합처리에 의한 기관분화의 경향은 HGF와 activin A 복합처리 시 보다 대부분의 기관 분화율이 높았으며, 반면 신관의 분화경향은 보다 저하되었다.
- 그러나 또 하나의 강력한 중배엽 유도인자인 bFGF에 대해서는 단독처리에 대한 연구만 이루어지고, 복합처리에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았으며, HGF 또한 복합처리에 의한기관 분화에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았다. 그러므로본 연구에서는 bFGF가 중배엽과 중배엽에 의해 유도된 신경조직, 특히 눈의 분화에 관여하며 HGF가 중배엽 유래의 신장 및 내배엽 유래의 간세포 증식에 관여하는 것으로 알려진것을 토대로 bFGF와 HGF를 복합처리하여 농도조합별 기관분화 경향을 bFGF 단독처리 효과와 비교하였고 두부감각기의 분화경향 특히 눈의 분화경향을 중점적으로 관찰하였다. 이를 위해 정상배와 분리배양편의 조직절편에 의한 조직학적 연구를 하였으며, 정상적인 배의 눈과 동물극 분리편에서 유도된 눈의 확인을 위해 면역조직화학법을 행하였다.
- 다시 50%, 70%, 90%, 100% ethanol 탈수과정을 거친 후 봉입하여 관찰하였다.
- ) 된 것을 사용하여 4 ℃ 에서 overnight 하였다. 다음날 PBS로 세척한 다음 AP reaction kit를 이용하여 발색하였으몌22], PBS로 세척하고 50%, 70%, 90%, 100% ethanol과 xylene 탈수과정을 거친 후 봉입하여 현미경 관찰하였다.
- 4)로 세척하였다. 멸균된 3% agar plate 위에서 발생단계상 stage 9의 난만을 선별하여 난막을 제거하고 텅스텐 니들로 동물극을 절단하여 분리한 후 Steinberg 생리식 염수에서 정상배가 stage 43에 도달할 때까지 20℃에서 배양하고 이를 대조구로 하였다. 처리구는 0.
- 위의 결과에서처럼 bFGF에 HGF를 혼합처리 했을 때 뚜렷하게 영향을 받는 조직은 신경조직, 눈, 청낭, 근육 등이 대표적이므로 이들의 분화율에 대하여 별도로 고려하여 보았다. 그 결과 신경조직은 bFGF 단독처리에서는 농도가 높을수록 분화율이 증가하였다.
- 그러므로본 연구에서는 bFGF가 중배엽과 중배엽에 의해 유도된 신경조직, 특히 눈의 분화에 관여하며 HGF가 중배엽 유래의 신장 및 내배엽 유래의 간세포 증식에 관여하는 것으로 알려진것을 토대로 bFGF와 HGF를 복합처리하여 농도조합별 기관분화 경향을 bFGF 단독처리 효과와 비교하였고 두부감각기의 분화경향 특히 눈의 분화경향을 중점적으로 관찰하였다. 이를 위해 정상배와 분리배양편의 조직절편에 의한 조직학적 연구를 하였으며, 정상적인 배의 눈과 동물극 분리편에서 유도된 눈의 확인을 위해 면역조직화학법을 행하였다.
- 2). 청낭은 bFGF 단독처리에서 농도가 높아질수록 분화율이 증가하다가 50 ng/ml의 bFGF에서는 저하되 었으며, 1과 10 ng/ml의 bFGF에 1과 10 ng/ml HGF를 첨가하여 가장 높은 분화율을 관찰하였다(Fig. 3). 근육은 bFGF 단독처리 에서 그 농도가 높아질수록 분화율이 증가하였고, 0.
대상 데이터
- Xenopus Mevis는 성적으로 성숙된 암수개 체를 사용하였으며, 산란을 위해 암수 공히 500-800 IU씩 HCG (Human Chorionic Gonadotrophin)를 주사하여 수정란을 얻고 3% cystein hydrochloride (pH 7.8)로 난의 젤리층을 제거한 뒤에 멸균된 Steinberg 생리식염수(pH 7.4)로 세척하였다. 멸균된 3% agar plate 위에서 발생단계상 stage 9의 난만을 선별하여 난막을 제거하고 텅스텐 니들로 동물극을 절단하여 분리한 후 Steinberg 생리식 염수에서 정상배가 stage 43에 도달할 때까지 20℃에서 배양하고 이를 대조구로 하였다.
이론/모형
- HGF와 bFGF의 혼합처리에 의해 유도된 시각기관에서 시각계 특이적인 분자들의 발현을 확인하기 위해 monoclonal antibody 40A11과 25F5를 사용하여 조직면역화학법을 행하였다. 40A114 25F5는 눈의 색소 상피층에 존재하는 분자량 65KDa 정도의 RPE65 (Retinal Pigment Epithelium 65)를 인식하는 것으로 밝혀진 단일 클론 항체이다.
- 배양용기는 표면처리 안 된 멸균제 96-well plate를 사용하였고, 분리편은 농도 조합 당 20개 정도씩 하였으며 1 well당 1개씩, 대조구 및처리배양액은 120 μl씩 분주하였다[16]. 발생단계는 Nieuw-koop과 Faber[28]를 따랐다.
성능/효과
- 그러나 bFGF 단독처리에서는 분화하지 않았던 청낭이 복합처리에 의해서 분화하기 시작하였으며 근육분화율의 증가를보여주었다. 0.5 ng/ml의 bFGF는 10 ng/ml의 HGF와 복합처리를 했을 때 가장 다양한 기관분화율을 보여주었다. bFGF 는 1 ng/ml 농도에서 0.
- 5 ng/ml 농도와 비슷한 기관분화율을 보여주지만 이 농도에서부터 청낭이 분화하기 시작하고근육의 분화율이 증가하였다. 10 ng/ml 농도와 50 ng/ml에서는 0.5 ng/ml와 1 ng/ml의 저농도의 결과보다 매우 높은 기관분화율을 보여주었다. 특히 눈, 근육 그리고 신경조직은 bFGF의 농도가 높을수록 분화율이 증가하였다.
- 그러나 HGF와 중배 엽 유도활성이 강한 bFGF의 복합처 리에 의한 기관분화에 대한연구는 이루어진 바 없어 본 연구에서는 HGF를 bFGF와 함께 처리하여 분리편내 기관분화 및 유도(induction)경향을관찰하였다. HGF와 bFGF의 복합처리에 의한 기관분화의 경향은 HGF와 activin A 복합처리 시 보다 대부분의 기관 분화율이 높았으며, 반면 신관의 분화경향은 보다 저하되었다. 이러한 현상은 HGF mRNA의 발현이 포배기 동물극세포에서 bFGF나 activin A와 반응하여 이루어지며 activin A보다는 bFGF와의 반응에서 더 강한 활성이 있다[26]는 보고와 관텬이 있는 것으로 생각된다.
- 5 ng/ml의 bFGF는 10 ng/ml의 HGF와 복합처리를 했을 때 가장 다양한 기관분화율을 보여주었다. bFGF 는 1 ng/ml 농도에서 0.5 ng/ml의 농도보다 전체적으로 높은 기관분화율을 나타내었으며, bFGF 단독처리보다 HGF의 첨가에 의해 전체적인 기관의 분화율이 더 높게 나타났다. 그리고 1 ng/ml의 bFGF와 10 ng/ml의 HGF에서 다양한 기관분화 효과가 나타났으며 눈, 귀, 신경조직, 척색, 근육, 시멘트 선이 HGF의 첨가에 의해 분화율이 증가하였다.
- 대조구의 분리편에서는 비정형표피조직만이 분화하였고, bFGF를 가하지 않은 상태에서 10 ng/ml의 HGF 단독처리에서도 특별한 조직이나 기관의 분화효과를 나타내지 못하였으며 대조구의 결과처 럼 비정형표피조직만 관찰되었다. bFGF 단독처리에 의한 기관분화 경향을 보면 0.5 ng/ml에서는 표피조직, 난황, 간충조직, 혈구양세포, 체강내상피가 각각 배양된 분리편 수의 90%, 72%, 55%, 55%, 52%로 대부분을 차지하고 있으며, 그 다음으로신경조직과 시멘트선 등이 분화하였으며 근육과 척색, 눈, 전신은 9%, 7% 3%, 3%로 약하게 분화하였다. 이 농도에서는 신경관(neural tube)과 청낭(otic vesicle)은 분화하지 않았다.
- 결론적으로, Xenopus 동물극분리편을 HGF와 bFGF의 복합처리 배양했을 때 HGF와 bFGF 각각의 단독처 리시 보다 신경조직과 눈, 그리고 근육 등의 기관 분화율이 더 높은 것으로 나타났으며 이는 bFGF의 강한 신경유도능과 HGF의 강한 세포증식 및 분화능에 대한 상승작용의 결과로 생각된다.
- 그 결과 신경조직은 bFGF 단독처리에서는 농도가 높을수록 분화율이 증가하였다. 그러나 HGF 첨가 시 bFGF가 1 ng/ml과 10 ng/ml의 농도일 때 HGF의 농도가 증가할수록신경조직의 분화율이 다소 증가하였지만, bFGF가 0.
- 5 ng/ml의 농도보다 전체적으로 높은 기관분화율을 나타내었으며, bFGF 단독처리보다 HGF의 첨가에 의해 전체적인 기관의 분화율이 더 높게 나타났다. 그리고 1 ng/ml의 bFGF와 10 ng/ml의 HGF에서 다양한 기관분화 효과가 나타났으며 눈, 귀, 신경조직, 척색, 근육, 시멘트 선이 HGF의 첨가에 의해 분화율이 증가하였다. 10 ng/ml의 bFGF도 단독처리시 보다 HGF의 첨가에 의해 기관의 분화율이 더 높게 나타났다.
- 3). 근육은 bFGF 단독처리 에서 그 농도가 높아질수록 분화율이 증가하였고, 0.5와 1 ng/ml의 bFGF에 HGF의 첨가에 의해 분화율이 약간 상승하였으며, 10 ng/ml의 bFGF 와 1 ng/ml의 HGF 혼합처리 시 가장 높은 근육 분화율을 보여 주었으나 bFGF 50 ng/ml 농도에서는 HGF 첨가에 의해 근육의 분화율이 오히려 저하되었다(Fig. 4).
- 5 ng/ml과 50 ng/ml의 농도일때는 신경조직과 마찬가지로 눈의 분화효과가 저하되었다. 눈의 가장 높은 분화율을 보여주는 농도는 bFGF 10 ng/ml 와 HGF 1 ng/ml의 농도조합, 그리고 bFGF가 10 ng/ml일때는 대체로 분화율이 높으며 HGF를 1과 10 ng/ml를 각 각첨가하여 가장 높은 분화율을 얻었다(Fig. 2). 청낭은 bFGF 단독처리에서 농도가 높아질수록 분화율이 증가하다가 50 ng/ml의 bFGF에서는 저하되 었으며, 1과 10 ng/ml의 bFGF에 1과 10 ng/ml HGF를 첨가하여 가장 높은 분화율을 관찰하였다(Fig.
- 다음으로 bFGF와 HGF의 혼합처리에 의한 결과를 보면 0.5 ng/ml의 bFGF 처리시 HGF 첨가에 의해서는 특별한 변화가 나타나지 않았으며 전체적인 기관분화율도 낮았다. 그러나 bFGF 단독처리에서는 분화하지 않았던 청낭이 복합처리에 의해서 분화하기 시작하였으며 근육분화율의 증가를보여주었다.
- bFGF 농도별로 HGF의 혼합처리 농도에 따라 여러가지 기관이 다양한 비율로 분화되었다(Table 1). 대조구의 분리편에서는 비정형표피조직만이 분화하였고, bFGF를 가하지 않은 상태에서 10 ng/ml의 HGF 단독처리에서도 특별한 조직이나 기관의 분화효과를 나타내지 못하였으며 대조구의 결과처 럼 비정형표피조직만 관찰되었다. bFGF 단독처리에 의한 기관분화 경향을 보면 0.
- 망막색소상피는 AP 반응이 뚜렷하며 RPE65의 국재를 확인할 수 있었다(Fig 7 C and D). 또한 monoclonal antibody 40A11 를 사용한 정상배와 혼합처리한 분리편에서도 렌즈층은 약하게 반응하였고 망막색소상피에는 강하게 염색된 것을 관찰하였다(Fig. 7 E and F).
- Monoclonal antibody 25F5를 사용한 정상배와 혼합처리한 분리편에서는 렌즈층이 다소 약하게 반응하였지만. 망막색소상피는 AP 반응이 뚜렷하며 RPE65의 국재를 확인할 수 있었다(Fig 7 C and D). 또한 monoclonal antibody 40A11 를 사용한 정상배와 혼합처리한 분리편에서도 렌즈층은 약하게 반응하였고 망막색소상피에는 강하게 염색된 것을 관찰하였다(Fig.
- 그리고 Del Rio-Tsonis등[9]은 도롱뇽의 눈에서도 bFGF가 렌즈재생과 발생에 관여한다고 하였다. 본 연구에서 분리편으로부터 눈의 분화는 bFGF 단독처리시의 최고 19% 분화율보다 HGF의 첨가에 의해 분리편에서 최고 46%까지 눈이 분화하였다. 이는 activin A와의 복합처리시 보다 높은 비율로서 눈의 유도에 관한 한, HGF는 activin A보다는 bFGF 와의 반응에서 더욱 강한 유도 활성을 가진다고 할 수 있겠다.
- 성장인자의 처리 없이 Steinbeg's solution에서 배양한 분리편에서는 비정형표피 조직만이 분화하였고, 10 ng/ml의 bFGF에서 3일 배양한 분리편은 길이증가와 더불어 눈이 고빈도로 분화하였으며, 10 ng/ml의 bFGF 단독처리시 보다 3 ng/ml의 HGF와 혼합처리에 의해 분리편에서 눈의 분화율이 더 높게 나타났다(Table 1 and Fig. 5). bFGF 농도별로 HGF의 혼합처리 농도에 따라 여러가지 기관이 다양한 비율로 분화되었다(Table 1).
- 단백질성 성장인자 중 FGF와 TGF-β (transformin응 growth factor)가 Xenopus 포배기에서 중배엽 유도 활성을 가지며, 이러한 세포증식인자들이 동물의 초기 발생에서 세포증식과 기관분화를 유도하는데 관련된 다양한 기능을 가지는 것으로 알려져 왔다[3, 20, 30, 35・37, 39]. 이들 단백질성 성장인자 중 강력한 중배엽 유도인자인 activine activin A, activin AB, activin B의 3종이 있으며 이 3종이 각각 가지는 세포에 대한 효과의 차이는 거의 없는 것으로 나타났다. 그 중 activin A는 동물극분리편으로부터 복측중배엽과 배측중배엽을 모두 유도하는 강력한 유도인자로 알려져 있으며 그 처리시간과 농도에 따른 연구는 Asashima 연구팀에서 Xenopus에 대해 매우 자세히 연구하였다[3].
- Xenopus receptor-type tyrosine kinase는 초기의 세포운명을 결정하는 중요한 역할을 한다. 즉 외배엽 세포로부터 신경계통의 조직을 유도하거나 표피를 분화시키는데[1], 본 연구의 결과와 관련해 볼 때 0.5 ng/ml의 bFGF 에서는 HGF의 첨가에 의해 신경조직의 분화 상승효과가 거의 없었고, 1 ng/ml와 10 ng/ml의 bFGF에 HGF를 각각 첨가한 경우는 신경조직의 높은 분화효과를 나타내다가 50 ng/ml 의 고농도bFGF처리부터는 오히려 신경조직의 분화감소가 일어났다. Xenopus에서 알려진 신경유도체로는 6가지의 protein이 있는데[42] noggin[23], FGF[17], folliostatin[14], chordin[33], Xnr3[13], cerberus[4]가 그것이며, 그 중 noggin, chordin, cerberus는 BMP4에 직접 결합하여 표피세포를 유도하고 신경조직 형성은 억제한다고 알려져 있다[41, 42], 신경조직은 몸의 앞쪽 특성을 가지는 외배엽으로부터 위의 나머지 단백질들에 의해 유도되며, 특히 FGF는 몸의 앞쪽과 뒤쪽부분 모두의 신경조직을 발현한다.
- 5 ng/ml와 1 ng/ml의 저농도의 결과보다 매우 높은 기관분화율을 보여주었다. 특히 눈, 근육 그리고 신경조직은 bFGF의 농도가 높을수록 분화율이 증가하였다.
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