[논문]고성능 액체크로마토크래피를 이용한 Biotin의 정량

김동수; 이영자; 정동윤; 이동엽; 안문규

문제 정의

Wolf 및 Korf 등은 이러한 유도화 시약의 단점을 보완하기 위해 촉매제 및 상 이동매체와 혼탁 된 시료 액과 유도화 시액을 별도로 주입, 혼화시킨 후 가열된 coil을 지나면서 유도화 반응이 일어나도록 자동 시료 주입기를 이용한 자동화를 시도하여 시료 전처리 시 시약의 변질 등의 부반응에 따른 재현성의 저하를 방지하려고 하였다. 본 연구에서는 공시험액을 50 ℃, 30분간 중탕한 후 냉장 보관을 하여도 MDMC-Biotin 의 피크와 동일한 시간에 나타나는 미지의 피크의 발생 원인을 살펴보기 위해, 중탕 후 흐르는 물로 냉각시킨 것을 즉각 주사기 필터를 사용하여 거른 것을 방치하여 보았다. 그 결과 7일간 경과되어도 미지의 피크가 형성되지 않았을 뿐만 아니라 거르지 않은 시료액의 경우 지속적인 변색과 함께 미지의 피크의 지속적인 상승이 일어나는 것으로 보아 K2CO₃ 등에 의한 부반응이 일어난 것으로 추정되었다.
Biotin의 분석은 Desbene 등이 BrMMC를 이용하여 처음 시도하였으며, 최근 Toyo'oka"는 BrMMC 계열 유도화 시약 중 4-bromomethyl-6, 7-methylenedioxycoumarin과 BrMDMC가 BrMMC보다 높은 감도를 보였다고 보고한 바 있다. 이에 본 연구에서는 BrMDMC를 biotin 정량에 응용하면서 유도화 반응에 대한 변수 등을 살펴, biotin 정량을 위한 최적 조건을 조사하여 기존의 연구결과와 상호비교, 검토하여 보고자 한다.

제안 방법

1. Biotin 제제로부터 biotin을 Sep-Pak Cm catridge 로써 처리하여 분리취하였다.
2. Biotin의 유도화는 BfMDMC와 촉매로써 18-crown -6 와 K2CO₃ 를 사용하고, 반응온도는 50 ℃ 에서 30 분간 중탕하였다.
Biotin 함유 시판 의약품을 분석하였다. Biotin으로서 30 - 60 ug 해당량을 50 mL 용량 플라스크에 넣고 포화 NaHCO₃ 용액 30 mL를 넣고 10분간 강진탕한후, 포화 NaHCO₃ 용액으로 표선까지 채웠다.
6에 따라 유도화를 한 후 HPLC 분석하여 재현성을 살펴보았다 (Table 2). 또한, 시료를 2.5의 방법으로 전처리하고, 유도화하여 HHC로 분석하여 회수율을 계산하였다 (Table 3).
그외 시 약들은 모두 시판 특급을 사용하였다. 본 실험에서 사용되는 모든 수용액은 탈염된 정제수를 사용하여 제조하였다.
시료중의 여러 성분으로부터 biotin을 효율적으로 분리 및 농축하기 위해 Sep-Pak Cl8 catridge를 사용하여 전처리하였다. 먼저 포화 NaHCO₃ 용액으로 시료를 녹인 후 5000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 그 상징액 5 mL를 취하여 미리 메탄올 및 물 5 mL 씩으로활성화시킨 Sep-Pak Cis catridge에 통과시켰다.
이동상으로서 물과 아세토니트릴을 사용하여 기울기 용리를 이용하여 Table 1과 같은 조성의 용리액으로 유속은 1.0 mL/min으로 하고, 시료 주입량은 10 ul 로 하였으며, 형광검출기의 최대 방출파장과 들뜸 파장을 각각 410 nm, 360 nm으로 하여 분석하였다.
Biotin으로서 30 - 60 ug 해당량을 50 mL 용량 플라스크에 넣고 포화 NaHCO₃ 용액 30 mL를 넣고 10분간 강진탕한후, 포화 NaHCO₃ 용액으로 표선까지 채웠다. 이를 2.5 시료전처리 과정을 밟아 농축한 후 MeOH에 녹인 것을 vial에 옮겨 2.6 유도화 반응 조작에 따라 유도화 한 후 HPLC로써 분석하였다(Table 3). Tablet 2를 제외한 모든 제제 중 함량은 모두 표시량 이상으로 나타났으며, 제제마다 다르지만 낮은 상대표준편차를 보였다.
표준액 일정량을 여러 vial에 취하여 2.6에 따라 유도화를 한 후 HPLC 분석하여 재현성을 살펴보았다 (Table 2). 또한, 시료를 2.
표준용액 및 Sep-Pak Cm로 전처리된 시험액 일정량(0.5~ 1.0 mL)을 vial에 취하여 80 t 건조기에서증발건조시킨 다음 K2CO₃ 35 mg, 아세톤 800 ul 및 유도화 시액 200 ul를 넣고 capping, 50 ℃에서 30분간 중탕한 후 흐르는 물로 식히고, 이를 주사기 필터 (재질 : PTFE)로 여과한 것 10 ul를 column에 주입하여 HPLC로서 분석'3하였다.

대상 데이터

BrMDMC 120 mg, 18-crown-6 100 mg을 25 mL 아세톤에 녹여 유도체화 용액으로 사용하였다.
BrMDMC, K2CO₃ 등은 Aldrich 사제, 18-crown-6 (1, 4, 7, 10, 13, 16-hexaoxacyclooctadecane), biotin 등은 Fluka 사제, 아세톤, 아세토니트릴및 메탄올 등은 Merck 사제 (HPLC급)를 사용하였다. 그외 시 약들은 모두 시판 특급을 사용하였다.
HPLC system 은 Jasco 사제의 Jasco FP-1580 intelligent HPLC jump, Jasco FP-1520 intelligent fluorescence detector, Jasco DG-1580-54 4-Line degasser, Jasco LG-1580-04 quaternary gradient unit 를사용하였고, column은 Waters 사의 Waters Cosmosil packed C18 (4.6x150 mm)를 사용하였다.

성능/효과

Biotin 표준용액과 이를 10배 희석한 용액 일정량을 vial에 취하여 80 "C에서 증발건조시킨 후 2.6의 방법에 따라 유도화한 것을 HPLC로 분석한 결과, 5-400 ng까지의 농도에서 기울기 3673.0, Y 절편 7162.2, 상관계수 0.999로 나타나 매우 양호한 직선을 얻었다. S/N=3을 기준으로 할 때 검출한계는 2 ng이었다.
4. 검정선의 직선범위는 5 ng~400 ng이었으며, 상관계수는 0.999이었다.
5. Biotin 순품에 대하여 실험한 결과 회수율 98.75%, 변동계수 1.1% 이었다.
6. 시판제제 중 정제 (tablet)와 주사제 (injection)를분석한 결과 97.63%, 106.4%의 함량과 3.9%, 1.7%의 변동계수를 각각 나타내었다.
Biotin을 80 ℃ 에서 증발건조시킨 후 유도화 반응을 거칠 때, 각 온도에서 중탕시간에 따른 MDMC-biotin 피크의 면적 변화를 살펴보았다(Fig. 2), 50 ℃에서는 1시간까지는 거의 일정하였으나 그 이후 서서히 피크 면적이 증가하는 양상을 보였으며, 70 ℃에서는 일정한 결과치를 보이지 않고 50 ℃ 에 비해 높은 결과치를 보였디. 30 ℃에서는 완만하게 상승하고 50 ℃에비해 낮은 면적을 나타냈다.
Biotin을 메탄올에 녹여 200 “g/mL 농도로 한 후, 200 ul를 vial에 취하여 80 ℃ 에서 증발건조 시킨 것을 유도화반웅을 거친 용액과, biotin 용액을 넣지 않고 동일하게 전처리한 바탕시험액의 크로마토그램을 구한 결과, BrMDMC 피크 바로 뒤에 MDMC-Biotin 피크가 검출되었다(Fig. 1).
본 연구에서는 공시험액을 50 ℃, 30분간 중탕한 후 냉장 보관을 하여도 MDMC-Biotin 의 피크와 동일한 시간에 나타나는 미지의 피크의 발생 원인을 살펴보기 위해, 중탕 후 흐르는 물로 냉각시킨 것을 즉각 주사기 필터를 사용하여 거른 것을 방치하여 보았다. 그 결과 7일간 경과되어도 미지의 피크가 형성되지 않았을 뿐만 아니라 거르지 않은 시료액의 경우 지속적인 변색과 함께 미지의 피크의 지속적인 상승이 일어나는 것으로 보아 K2CO₃ 등에 의한 부반응이 일어난 것으로 추정되었다. 이에 Hahn 등이 시도한 triethylamine 혹은 tetrabuty lammoni um hydroxide를 사용한 방법은 수분 및 느린 반응속도 문제 이외에, 부반응을 방지하기 위한 거름과정을 거칠 수 없어 Wolf 등의 자동화 방법이 아닌 경우, 부적절한 것으로 사료된다.
그림2에서 50 C에서 중탕 시 1시간까지는 일정한 수치를 보였으나 그 이후 증가추세를 보였으므로, BrMDMC의 안정성을 살펴보기 위하여 바탕시험액을 30분간 중탕한 것을 상온으로 내리고 방치 시간별로 분석한 결과 1시간 이후 증가하는 추세를 보였다. 중탕한 것을 4 ℃로 유지하면서 시간별로 분석한 결과 2시간 이후부터 피크면적이 지속적으로 증가하는 양상을 보였다.
중탕한 것을 4 ℃로 유지하면서 시간별로 분석한 결과 2시간 이후부터 피크면적이 지속적으로 증가하는 양상을 보였다. 이때 2시간, 4시간, 6시간 및 8시간 경과 한바탕 시험액에서 검출된 피크에 대하여 검정선으로 부 터 산출한 값은 각각 1.4, 8.3, 13.4 및 19.5 ng 등으로 나타나 유도화 반응 후 즉시 분석 해야함을 알았다.
중탕한 것을 4 ℃로 유지하면서 시간별로 분석한 결과 2시간 이후부터 피크면적이 지속적으로 증가하는 양상을 보였다. 이때 2시간, 4시간, 6시간 및 8시간 경과 한바탕 시험액에서 검출된 피크에 대하여 검정선으로 부 터 산출한 값은 각각 1.

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