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문제 정의
- 본 연구에서는 어류 혈구세포에 있어서 DNA 손상유무를 오염지역의 생물학적 환경 모니터링의 도구로서의 이용가능성을 조사하기 위한 연구의 일환으로 미국 조지아주 연안지역 의 3종 어류를 가지고 comet assay를 실행하여 최적의 실험 조건과 적합한 표적세포를 제시하였다.
- 본 연구에서도 alkali-labile site가 절단되기 시작하는 pH를 알아보기 위하여 세분화된 pH 조건에서 comet assay를 실시하였다. Fig.
제안 방법
- 마지막 tris 용액에서 꺼낸 슬라이드를 찬 에탄올이 담긴 coplin jar에 5분간 남궈둔 후 실온에서 건조시켰다. 건조된 슬라이드는 Ethidium Bromide 용액 (20/%/mL)으로 염색시켜 형광현미경 (Nikon Eclipse E200)으로 200배 배율에서 관찰하였다. 염색되어진 DNA의 영상을 CCD카메라를 통해 컴퓨터로 불러들인 후, 이미지자동분석 소프트웨어 (Komet version 5, Kinet Imaging Ltd)로 DNA tail moment (부서 진 DNA 꼬리 의 길이 (“m)x 꼬리부분에 있는 DNA (%))를 계산하였다.
- 300 “L Histo- paque을 HBSS의 아래층으로 천천히 흘려 넣은 후 15,000 rpm 에서 3분간 원심분리하였다. 두 층의 경계면에서 100를 취하여 새로운 원심분리용 튜브에 옮겨 담고 HBSS를 첨가하였다. 4, 500 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 버리고, 이 과정을 한번 더 반복하여 백혈구를 혈액으로부터 분리하였다.
- 등과 같이 적혈구의 수가 백혈구의 수에 비해 훨씬 많으므 로, 적혈구를 가지고 하는 실험은 별도로 혈액으로부터 적혈 구를 분리하지 않고 혈액 속에 있는 혈구세포 모두를 적혈 구로 간주하여 노출실험을 시행하였다. 송어의 경우 앞의 결과 (Figs.
- 생물환경 모니터링에 적합한 혈구세포의 종류를 알아보기 위하여 백혈구와 적혈구로 나누어 in vitro 노출실험을 실시하였다. 곱상어 (백혈구의 수 : 적혈구의 수 = 1:5)와 같은 연골어류를 제외한 대부분의 어류는 넙치 (1:130), 잉어 (1:300)
- 등과 같이 적혈구의 수가 백혈구의 수에 비해 훨씬 많으므 로, 적혈구를 가지고 하는 실험은 별도로 혈액으로부터 적혈 구를 분리하지 않고 혈액 속에 있는 혈구세포 모두를 적혈 구로 간주하여 노출실험을 시행하였다. 송어의 경우 앞의 결과 (Figs. 2, 3)에서 알려진 것처럼 alkali-labile site가 적으므 로 DNA unwinding buffer solution의 pH를 조절하지 않고 comet assay를 수행하였으며, mummichog의 경우 pH를 12.5 로 맞춘 후 실행하였다. 본 연구에 사용되어진 2-methyl-1, 4- naphthoquinone (MNQ)는 세포 내에서 semiquinone으로 환원 되어 직접 DNA。] 손상 (DNA adduct)을 일으키거나, semiquinone이 산소를 활성산소라디칼로 변화시켜 DNA에 손상 (thymine glycol과 같은 염기 변형)을 일으키기도 하는 것으로 알려져 있다.
- 실제 mummicho옹가 alkali-labile site를 많이 함유하고 있는지 를 확인하기 위하여 DNA unwinding buffer sokition의 pH 변화에 따른 DNA 손상정도의 변화를 알아보았다 (Fig. 3). 송어 혈액의 경우 DNA unwinding buffer solution의 pH 변화에 별다른 변화를 보이지 않았으나, mummichog의 경우 pH가 높아질 수록 훨씬 높은 DNA 손상을 보여주었다.
- 이때 DNA 이중가 닥은 단일가닥으로 풀어진다. 어종에 따라 DNA unwinding buffer solution의 pH를 조절하였으며, pH의 조절은 상기의 방법으로 만든 완충용액에 염산을 첨가하면서 실시하였다. 그 다음 슬라이드를 동일한 DNA unwinding buffer solution로 채워진 전기 영동기에 넣고 25분간 25V, 300mA에서 전기 영동을 실시하였다.
- 6 mM C6Hi2O6) 로 약 lOecells/mL가 되도록 희석한 후 100“L씩 원심분리용 튜브에 옮겨 담는다. 여기에 H2O2 (1-10/zM) 혹은 2-methyl-l, 4- naphthoquinone (MNQ, 을 적정 농도가 되도록 점가 한 후 HBSS로 최종부피가 1 mL가 되도록 하여 실온 (약 25℃) 에서 1시간 또는 2시간씩 노출하였다.
- 건조된 슬라이드는 Ethidium Bromide 용액 (20/%/mL)으로 염색시켜 형광현미경 (Nikon Eclipse E200)으로 200배 배율에서 관찰하였다. 염색되어진 DNA의 영상을 CCD카메라를 통해 컴퓨터로 불러들인 후, 이미지자동분석 소프트웨어 (Komet version 5, Kinet Imaging Ltd)로 DNA tail moment (부서 진 DNA 꼬리 의 길이 (“m)x 꼬리부분에 있는 DNA (%))를 계산하였다. 각 슬라이드 당 50개의 핵을 분석하였으며, 이들로부터 평균과 표준오차를 구하였다.
- 4(b)). 이 pH 값에서 대조시료는 DNA 손상이 거의 나타나지 않았고, 로 처리 된 시료는 높은 DNA 손상을 보여주었으며, pH가 12.5보다 약간 만 더 높아져도 alkali-labile site가 절단되기 시작하여 대조시료에서 높은 값을 보여주었다, pH 12.5가 가장 적절한 pH 값인지 확인하기 위하여 세 번째 실험을 수행하였다 (Fig. 4(c)).
- 미국 조지아주 사바나 인근 연해에서 송어 (Oncorhynchus masou masou), 농어 (Lateolabrax japonicus) 및 mummichog (Fundulus heteroclitus)7\ 낚시 혹은 어망으로 채취하였다. 혈액 의 채취는 항응고제인 EDTA로 처리된 25G 주사기를 항문 뒤쪽으로 주입하여 배주동맥으로부터 10-100 “L 정도를 채취 하였다.
대상 데이터
- 미국 조지아주 사바나 인근 연해에서 송어 (Oncorhynchus masou masou), 농어 (Lateolabrax japonicus) 및 mummichog (Fundulus heteroclitus)7\ 낚시 혹은 어망으로 채취하였다. 혈액 의 채취는 항응고제인 EDTA로 처리된 25G 주사기를 항문 뒤쪽으로 주입하여 배주동맥으로부터 10-100 “L 정도를 채취 하였다.
데이터처리
- 염색되어진 DNA의 영상을 CCD카메라를 통해 컴퓨터로 불러들인 후, 이미지자동분석 소프트웨어 (Komet version 5, Kinet Imaging Ltd)로 DNA tail moment (부서 진 DNA 꼬리 의 길이 (“m)x 꼬리부분에 있는 DNA (%))를 계산하였다. 각 슬라이드 당 50개의 핵을 분석하였으며, 이들로부터 평균과 표준오차를 구하였다. 대조구와 처리구와의 차이는 student /-test를 통하여 산출하였으며, 유의수준 (p)은。05를 기준으로 하였다.
이론/모형
- , 1984). 기존의 연구에서도 새우 알을 MNQ에 노출시켰을 때 농도 에 비례하는 DNA 손상이 comet assay를 통해 검줄되었기 때문에 (Kim and Lee, submitted) 본 실험에서도 이용되었다. Fig.
성능/효과
- 4(c)). 그 결과 pH 12.5에서 대조시료는 상당히 낮은 DNA 손상정도를 보였으며, 반면 10H2O2로 처리된 혈액은 상당히 높은 DNA 손상정도를 나타내었다. 앞의 결과와 똑같이 pH 12.
- 5에서 comet assay를 실행한 결과이다. 대조구에서는 예상대로 낮은 DNA 손상정도를 보였으며, 노 출된 玦6의 농도가 높아질수록 높은 DNA 손상을 일으키는 것으로 나타났다. UV와 X-ray와 같은 경우는 노출시간이 나 노출세기에 비례하는 DNA 손상이 관찰되었으나 (Koppen and Angelis, 1998; Kim et al.
- 대부분 적혈구로 생각되는 혈구세포는 농도 가 증가함에 따라 DNA 손상도 증가하였으나, 백혈구의 경우 그러한 경향이 나타나지 않았다. 본 연구로부터 송어의 경우 백혈구에 비해 적혈구 DNA가 MNQ에 훨씬 더 민감하 게 반응한다는 사실을 보여주었다. Mummichog의 경우 크기가 작아 충분한 혈액을 채취할 수 없어 백혈구 분리를 하지 않고 전체 혈액을 가지고 수행하였으며, 그 결과 송어와 비슷한 경향을 보여주었다 (Fig.
- 본 연구에 사용되어진 2가지의 화학물질 (玦6와 MNQ)에 의해 유도된 DNA 단일가닥 손상은 comet assay를 통해 측정할 수 있는 것으로 나타났다. 현재 오염원으로부터 해양생태계에 배출되고 있는 수많은 유해화학물질들 중에서 다핵성 방향족
- 간접 적으로 절단되어진 손상이지만, alkali-labile si坨의 경우 세포 핵내에서는 연결된 상태로 존재하나 높은 pH을 유지하는 comet assay 실험과정에서 절단되어 나타나는 것으로 DNA 단일가닥 손상과 동일하게 검출되어질 수 있다. 본 연구에 사용되어진 어류들의 채취지역이 DNA 단일가닥 손상을 일 으킬만한 오염원이 특별히 없는 곳으로 알려져 있으므로, mummichog에서 관찰된 높은 DNA tail moment 값은 다른 2종의 어류에 비해 mummicho흥가 상대적으로 많은 alkali- labile site를 가짐으로 말미암아 comet assay의 실험과정에 생 긴 것으로 사료된다.
- 가(a, b , c)에 10〃M 니2O2를 mummichog의 혈액에 노줄한 후 여러 수준의 pH에서 comet assay를 수행한 결과를 나타내었다. 첫 번째 실험으로부터 대조시료에서 DNA가 부서 지기 시작하는, 즉 alkali-labile site가 절단되는 pH값이 12.6인 것으로 나타났다 (Fig. 4(a)).
- 한편 10 “M MNQ에 노출되었을 때 mummichog는 낮은 pH 에서 comet assay가 시행되었음에도 불구하고 송어 (>pH 13)에 비해 약 4배 가량 높은 DNA 손상을 보여 mummichog의 혈구세 포가 상대적으로 DNA에 손상을 유도하는 화학물질에 더 민감 하게 반응하는 것으로 나타났다. 이는 동일지역에 여러 종의 어류가 존재한다면 노출된 화학물질에 특별히 민감하게 반응 하는 어종을 선택하는 예비실험이 생물환경모니터링을 하는데 있어서 필요하다는 것을 보여준다.
후속연구
- 본 실험을 통해 mummichog 와 같이 DNA/구조 속에 alkali- labile site를 많이 가지는 어종에 대해 comet assay를 수행하고 자 할 경우 기존의 실험법 (DNA unwinding buffer solution의 pH>13)으로는 오염물질에 노출되지 않은 생물 (대조시료)에 서의 DNA tail moment의 수치가 높아 독성물질에 의해 유도된 생물 (처리시료)에서의 DNA 손상정도를 정확히 파악할 수가 없으므로 comet assay에 의한 DNA 손상정도가 환경모니터 링 을 하는데 있어서 생물지시자 (biomarker)로서 사용되어질 수가 없다. 그러므로 각 어종에 대해 comet assay를 생물환경모니 터링의 도구로 사용하기 위해서는 각 어종의 혈구세포에 있어서 DNA unwinding buffer solution의 적절한 pH가 우선적으로 연구되어져야 할 것이다.
- 탄화수소 화합물 (polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)과 같은 물질은 해수, 퇴적물 및 해양생물체내에서 검출되며, 이 또한 DNA손상을 유도하는 물질로 알려져 있다. 실험실내에서 DNA 손상을 유도하는 화학물질뿐만 아니라, 해양환경에 유출된 여러 오염물질에 의한 DNA 손상여부를 알아내기 위하여 comet assay를 이용한 폭 넓은 연구가 필요하리라 사료된다.
- 혈액을 이용하는 in vitro 연구에서는 외부에서 침입한 병원생물 혹은 외래물질을 세 포 내로 끌어들여 살균 소화하는 기능을 가진 백혈구가 주로 표적세포로 이용되어졌으나, 본 연구로부터 앞으로 환경 모니터링의 도구로써 comet assay가 적용된다면 어류의 경우 표적세포로서는 적혈구가 적절할 것으로 판단된다. 하지 만, 본 연구와는 다르게 잉어 (Kammann et al., 2000)나 사람 (Zhu and Loft, 2001)의 백혈구가 H2O2의 노출농도에 따라 DNA 손상정도가 증가하는 경향을 보여 주기도 하였으며, 이렇게 대립되는 결과에 대해서는 보다 면밀한 연구가 필요 할 것으로 생각된다.
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