[논문]교차 전기영동법을 이용한 극소형 DNA 추출기

이소연; 서경선; 조영호

doi:10.3795/ksme-a.2004.28.8.1135

문제 정의

Lab-on-a-chip 의 주요 구성 요소로는 시료 저장 및 배출구, 분리기, 증폭기(PCR), 그리고 판독기 등이 있으며, 본 논문은 이들 주요 구성요소 들 중 분리기에 관한 것으로 MEMS 기술로 제작된 극미세 기둥구조물 영역 내에서 교차 전기 영동법을 이용한 극소형 DNA 추출기를 제안하였다.
본 논문은 DNA 미소분석기의 핵심 요소인 DNA 추출기의 개발에 관한 것이다. 본 DNA 미소 추출기는 특정크기의 DNA 분자의 분리 추출을 위해 기존의 다공성 매체인 겔 대신 높이, 직경 및 간격이 모두 2 ㎛인 원형 미소기등을 60° 각도로 배열한 미소기둥구조물을 사용하였다.
노력이 필요하다. 이에 본 논문에서는 DNA 혼합물에서 원하는 크기의 DNA 분자를 분리.추출함에 있어서 특정 크기 이상의 DNA 의 진행을 억제하고 나머지 시료는 극미세 기둥구조물 영역을 지나도록 하여, 시간에 따른 분리과정의 지속적 관측과 초기 시료의 정렬이 필요 없는 미소 DNA 추출기에 관한 연구를 수행하였다.

제안 방법

[Fig. 8] 과 같은 장치를 이용하여 형광현미경과 CCD 영 상을 통해 각 DNA 별 진행 속도를 관측하고, 일정 시간 간격으로 촬영한 사진([Fig. 9])을 분석 하여 이 동거리 와 속도를 측정 한다. [Fig.
기존의 미소 분리기는 전기장 내에서 DNA 분자의 크기에 따른 진행 속도차를 이용한 것이었으나, 본 연구에서 제안한 DNA 추출기는 극미세 기둥 구조물 내에서 전기장의 방향을 변화시켜 DNA 크기에 따라 재정렬 시간의 차이가 발생하게 한 것이 특징이다. 따라서 제안된 DNA 추출기는 외부에서 인가되는 교차 전기장의 크기 또는 주기를 변화시킴으로써 추출하고자 하는 DNA 의 크기를 조절할 수 있을 뿐 아니라, 전기영동법을 이용한 기존의 DNA 분리기에서 요구되는 추출 분리 과정의 지속적인 관측이나 초기 시료의 정렬 문제를 해결할 수 있다.
본 DNA 미소 추출기는 특정크기의 DNA 분자의 분리 추출을 위해 기존의 다공성 매체인 겔 대신 높이, 직경 및 간격이 모두 2 ㎛인 원형 미소기등을 60° 각도로 배열한 미소기둥구조물을 사용하였다. 또한 미소 기둥 구조물에 120° 각도의 교차 전기장을 인가하여 DNA 크기에 따른 재정렬 시간차를 유발하였으며 이를 이용하여 특정크기의 DNA 빠른 속도로 분리 추출하였다.
5](e)에서 전체 실리콘 기판의 산화막을 제거하면 엔트로픽 방벽이 정의된 위치에 약lOOnm 의 단차가 발생하게 되며, 이후 ①와 (g)에 도시한 바와 같이 실리콘 RIE (Reactive Ion Etching) 공정으로 미소기둥 구조물과 미소유로를 동시에 형성하고, (h)와 (i)에서 실리콘 질화 막을 마스크로 사용한 실리콘 기판의 KOH 식각 공정을 통해 시료의 주입, 배출과 전극의 주입을 위한 창을 형성하였다. 이후 실리콘 질화 막을 제거하고, 친수성 미소유로의 형성을 위해 실리콘기 판 표면 에 300nm 두께 의 산화막을 형 성 하였다.
제안된 DNA 추출기는 [Fig. 1]과 같이 중심부의 극미세 기둥구조물 영역과 방사선 형태로 배열된 세 쌍의 미소 유로, 전극창, 시료 주입구, 그리고 나노 엔트로픽 방벽(6)이 부착된 시료 추출 구들로 이루어져 있다.
2] 의 (b)에서 와같이, 극미세 기둥구조물을 정삼각형 구도로 배치하였을 때, DNA 가 이동할 경로를 따라 일정한 전 기장값을 가지는 통로가 형성되는 것을 알 수 있다. 따라서 교차 전기장의 각도를 고려한 미소 유로 또한 60。주기로 배치되었고, 전체 극미세 기둥 구조물 영역은 미소 유로와의 연계를 고려하여 정육각형 형태를 갖도록 설계하였다. 재정렬 시간 최소화를 위하여 인가되는 전기장의 교차각도를 [Fig.
이에 본 논문에서는 DNA 혼합물에서 원하는 크기의 DNA 분자를 분리.추출함에 있어서 특정 크기 이상의 DNA 의 진행을 억제하고 나머지 시료는 극미세 기둥구조물 영역을 지나도록 하여, 시간에 따른 분리과정의 지속적 관측과 초기 시료의 정렬이 필요 없는 미소 DNA 추출기에 관한 연구를 수행하였다.

대상 데이터

9])을 분석 하여 이 동거리 와 속도를 측정 한다. [Fig.9] 의 실험에서는 형광 염료 Y0Y0-1 을 사용하였으며, 교차 전기장의 크기는 5V/0.8cm, 주기는 12초이었다. Table 2의 DNA 분자의 재정 렬 시간은 식 (3) 을 통해 계산할 수 있으며, 이렇게 얻어진 DNA 분자의 크기에 따른 재정렬 시간을 [Table 3] 에 정리하였다.
추출기의 개발에 관한 것이다. 본 DNA 미소 추출기는 특정크기의 DNA 분자의 분리 추출을 위해 기존의 다공성 매체인 겔 대신 높이, 직경 및 간격이 모두 2 ㎛인 원형 미소기등을 60° 각도로 배열한 미소기둥구조물을 사용하였다. 또한 미소 기둥 구조물에 120° 각도의 교차 전기장을 인가하여 DNA 크기에 따른 재정렬 시간차를 유발하였으며 이를 이용하여 특정크기의 DNA 빠른 속도로 분리 추출하였다.
설계된 DNA 추출기는 [Fig. 5]와 같이 세장의 마스크를 이용한 미소가공공정에 의해 제작되었다. 먼저 [Fig.
제 작된 DNA 추출기의 성능을 시험 하기 위 해 [Table 2] 에 설명된 바와 같은 3 종의 DNA 를 이용하였다. Fig.

성능/효과

8cm 의 교차 전기장을 인가했을 때, 관측하는 30 분 동안 거의 진행하지 않고 제자리에 정지되어 있음을 확인할 수 있었으며, 이때 T4 DNA 보다 작은 DNA 분자의 경우 극미세 기둥 구조물 영역 밖으로 이동하여 작은 DNA 분자들과 섞여 있는 시료 내에서 T4DNA 만을 분리 추출하였다. 기존의 방법으로는 수십 kb 급 DNA 분리에 수 ~수십시간의 시간이 소요됨을 고려할 때, 본 추출기에서는 수백 kb 급 T4 DNA 를 30 분에 분리해낼 수 있었기에, 본 추출기의 분리 추출 성능의 우수성을 확인할 수 있었다.
8cm, 교차 주기 10초의 교차전기 영동을 실시하여 상기 3 종의 DNA 중 T4 DNA 만 진행이 억제되어 일정 시간 후에도 극미세 기둥구조물 내부에 잔류함을 실험적으로 확인하였다. 따라서 극미세 영역 내에서 교차 전기장의 크기와 주기를 변화시킴으로써 추출하고자 하는 DNA 분자의 크기를 조절 할 수 있으며, 이때 결정된 값보다 작은 DNA 분자는 미소기둥구조물 영역을 빠져나가고 원하는 크기의 DNA 분자를 선택적으로 추출 할 수 있음을 실험적으로 확인하였다.
특징이다. 따라서 제안된 DNA 추출기는 외부에서 인가되는 교차 전기장의 크기 또는 주기를 변화시킴으로써 추출하고자 하는 DNA 의 크기를 조절할 수 있을 뿐 아니라, 전기영동법을 이용한 기존의 DNA 분리기에서 요구되는 추출 분리 과정의 지속적인 관측이나 초기 시료의 정렬 문제를 해결할 수 있다.
Table 2의 DNA 분자의 재정 렬 시간은 식 (3) 을 통해 계산할 수 있으며, 이렇게 얻어진 DNA 분자의 크기에 따른 재정렬 시간을 [Table 3] 에 정리하였다. 실험을 통하여 T4 DNA 의 경우 주기가 10 초, 5V/0.8cm 의 교차 전기장을 인가했을 때, 관측하는 30 분 동안 거의 진행하지 않고 제자리에 정지되어 있음을 확인할 수 있었으며, 이때 T4 DNA 보다 작은 DNA 분자의 경우 극미세 기둥 구조물 영역 밖으로 이동하여 작은 DNA 분자들과 섞여 있는 시료 내에서 T4DNA 만을 분리 추출하였다. 기존의 방법으로는 수십 kb 급 DNA 분리에 수 ~수십시간의 시간이 소요됨을 고려할 때, 본 추출기에서는 수백 kb 급 T4 DNA 를 30 분에 분리해낼 수 있었기에, 본 추출기의 분리 추출 성능의 우수성을 확인할 수 있었다.
제작된 DNA 미소분리기에 5V/0.8cm 크기의 교차 전기장을 인가한 경우 크기가 서로 다른 3 종의DNA 시료, X DNA(48.5kbp), micrococcus DNA(115kbp), T4 DNA(169.8kbp)의 先정렬시간은 4.80±0.44sec, 7.12±0.75sec, 9.88±0.30sec 로 측정하였으며, 전기장 크기 5V/0.8cm, 교차 주기 10초의 교차전기 영동을 실시하여 상기 3 종의 DNA 중 T4 DNA 만 진행이 억제되어 일정 시간 후에도 극미세 기둥구조물 내부에 잔류함을 실험적으로 확인하였다. 따라서 극미세 영역 내에서 교차 전기장의 크기와 주기를 변화시킴으로써 추출하고자 하는 DNA 분자의 크기를 조절 할 수 있으며, 이때 결정된 값보다 작은 DNA 분자는 미소기둥구조물 영역을 빠져나가고 원하는 크기의 DNA 분자를 선택적으로 추출 할 수 있음을 실험적으로 확인하였다.

후속연구

또한 제안된 미소 DNA 추출기는 유전자 분석을 위한 BAC(Bacterial Artificial Chromosome) 유전자 도서관의 형성에 기여할 것으로 예상되며, (이 수백 kbp 급 대용량 DNA 활용 분야에 쉽게 접근 할 수 있는 도구로 사용될 수 있다.
제안된 극미세 DNA 추출기는 DNA 분석의 전 처리 과정에서 특정 크기 이상 또는 이하의 DNA 를 거르는 여과기로도 응용할 수 있으며, DNA 혼합물 내에서 특정 크기의 DNA 를 고속 추출할 수 있어 DNA 미소분석기와 초고속 분석공정의 자동화 및 소형화에 기여할 것으로 예상된다.

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