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문제 정의
- calcitrans 생육저해 활성은 대사산물 (배양여액)보다 세균이 공존 하는 경우 그 활성이 훨씬 강하여 세균이 생성하는 저해물질 뿐만 아니라 다른 미지의 기구가 관여하고 있을 가능성을 시사한 바 있다. 본 연구에서는 그 가능성의 하나로 지방산의 역할을 알아보 고자 세균과 미세조류를 혼합배양하였을 때 지방산 조성의 변화를 측정하였다. 그 결과 조류 생육저해활성이 없었던 V.
제안 방법
- 생육 저해 활성을 가지는 해양 세균, Shewanella sp. SR24와 그저 해 활성이 없는 V. alginolyticus의 지방산 조성을 분석하고 이들 해 양 세균과 규조류를, 각각 혼합배양하였을 때 규조류의 지 방산 조성변화를 측정하였다.
- 세균과 혼합배양한 경우의 지방산 분석을 위한 미세조류는 Shewanella sp. SRT4가 접종된 C. calcitrans 세포를 현미경으로 관찰하여 전체 조류 세포 수의 약 50%에서 세포 내용물이 소실되기 시작할 때(24시간 후) 각 시험구 및 대조 구의 조류를 여과 회수하였다. 즉, 미세조류 배양액은 450t, 4시간 처리한 GF/D glass microfibre filter (Whatman)로 여과하여 조류 세포를 회수하고, pore size 0.
- SRT4와 생육 저해 활성이 없었던 Vibrio alginoly- ficus의 지방산 조성을 측정하고 이들 균과 규조류를 혼합배양하였을 때 Shewanella sp. SRT4에 감수성인 C. calcitrans와 비감수성인 Skeletonema costaZum 의 지방산 조성의 변화를 시험하였다.
- 순 수배 양한 시 험균의 지방산 조성분석을 위하여 Shewanella sp. SRT4와 V. algino/yticus는 peptone broth에서 2代로 3일간 정치 배양한 후 일부는 미세조류에 배양액에 접종하여 혼합배양하고, 나머지 세균 배양액은 오염되지 않게 하여 에서 8, 000rpm으로 40분간 원심분리 (Kontron Inst., Model Centrikon「324, Italy) 하여 집균하였다. 집균한 균체는 멸균 생리식염수로 3회 세정한 후 일부는 peptone broth 배양 균체의 지방산 분석 시료로 하고, 나 머지는 Conwy 배지에 다시 접종하여 미세조류 배양조건에서 24시간 배양한 후 동일 원심분리 조건으로 집균하여 Conwy 배지 배양 균체의 지방산 분석용 시료로 하였다 (Fig.
- 본 연구에서는 먼저 미세조류 생육저해활성이 있는 세균과 그 렇지 않은 세균, 그리고 이들 세균을 미세조류 생육저해가 나타나는 조건으로 배양하였을 때 지방산 조성이 어떻게 변하는지를 시 험하였다. 시험균을 peptone broth에서 배양하였을 때 지방산 조 성은 C.
- SRT4에 의한 Chaetoceros spp. 생 육 저해에 대한 지방산의 영향을 알아보기 위한 연구의 일환으로 전보 (Kim et al., 1999a; 2001b)에서 분리한 미세조류 생육저해균 대 수기 (OD750= 약 0.10)까지 전 배양한 후 오염 되지 않게 원심 분리(8, 000rpm, 30분, 20切로 조체를 모은 후 각각 대조 구와 두 개의 시험 구로 구분한 새로운 Conwy 배지에 접종하였다. 두 개의 시험구에는 Shewanella sp.
- 시험 균과 미세조류의 지질은 Folch et al. (1957) 및 藤野 (1980) 의 방법을 개량하여 각 시료 (약 lg)에 chloroform:methanol (2:1)을 10mL 첨가하여 추출하였다. 추출된 지질은 H2SO4:toluene: methanol (1:10:20) 용매를 첨가하고 100t에서 4시간 가열하여 methylation한 다음, hexane층으로 이행시키고, hexane 충은 분 취하여 증류수로 3회 세정한 다음 수분을 제거하고 농축하여 Table 1과 같은 조건으로 gas chromatography에 의해 지방산을 분석하였다.
- calcitrans 세포를 현미경으로 관찰하여 전체 조류 세포 수의 약 50%에서 세포 내용물이 소실되기 시작할 때(24시간 후) 각 시험구 및 대조 구의 조류를 여과 회수하였다. 즉, 미세조류 배양액은 450t, 4시간 처리한 GF/D glass microfibre filter (Whatman)로 여과하여 조류 세포를 회수하고, pore size 0.2 呻의 membrane filter로 여과한 후 멸균한 해수 300mL로 세정하여 분석 시료로 하여 동일 조건으로 배양 회수한 대조구 조류의 지방산 조성과 비교하였다 (Fig. 1).
- , Model Centrikon「324, Italy) 하여 집균하였다. 집균한 균체는 멸균 생리식염수로 3회 세정한 후 일부는 peptone broth 배양 균체의 지방산 분석 시료로 하고, 나 머지는 Conwy 배지에 다시 접종하여 미세조류 배양조건에서 24시간 배양한 후 동일 원심분리 조건으로 집균하여 Conwy 배지 배양 균체의 지방산 분석용 시료로 하였다 (Fig. 1).
- (1957) 및 藤野 (1980) 의 방법을 개량하여 각 시료 (약 lg)에 chloroform:methanol (2:1)을 10mL 첨가하여 추출하였다. 추출된 지질은 H2SO4:toluene: methanol (1:10:20) 용매를 첨가하고 100t에서 4시간 가열하여 methylation한 다음, hexane층으로 이행시키고, hexane 충은 분 취하여 증류수로 3회 세정한 다음 수분을 제거하고 농축하여 Table 1과 같은 조건으로 gas chromatography에 의해 지방산을 분석하였다. 시료의 지방산 조성은 지방산 표 품 (Sigma)을 시험 미세조류 C.
대상 데이터
- 시험 균주 Shewanella sp. SR-142}' V. alginolyticus, 그리고 규조류 C. calcitrans CCMP 1315와 S. costa turn CCMP 775는 전보 (Kim et al., 1999a; 2001b)와 같은 것을 사용하였다. 그리고 세균과 규조류 배 양에 사용된 배지는 세균의 경우 peptone broth (Kim et al.
성능/효과
- 33.4%, 1가 불포화지방산이 47.8%, 다가 불포화지방산이 12.4%로 순수배양한 조체에 비하여 포화지방산의 비율은 감소하였으나 불 포화지방산의 비율은 중가하였다. 이때 포화지방산에 대한 불포화지방산의 비율이 순수배양한 조체에서는 128이었으나 혼합배양한 것에서는 1, 81로 1.
- 세균과 혼합배양한 규조류의 지방산 조성은 Shewanella sp. SR- 14와 혼합배양한 경우 순수배양한 조체에 비하여 포화지방산의 비율은 감소하였으나 불포화지방산의 비율은 증가하였으며, 그 변 동율은 C. ca/citrans의 경우가 S. costatum보다 높았다. 그러나 V.
- 전 체적으로 보았을 때 두 시험 균에서 지방산 조성의 차이는 Shewanella sp. SR-14?} V. algino/yticus보다 1가 불포화지방산의 비율은 약간 낮았으나 다가 불포화지방산의 비율은 역으로 약간 높게 나타났다.
- SRT4는 조류생육 저해활성이 없는 V alginolyticus0^ 비하여 18:3, 22:3 등 고도불 포화지방산의 비율이 다소 높았다. 그러나 이들 시험균을 Conwy 배지로 미세조류 배양조건에서 재배양하였을 때 이 지방산의 비 율은 거의 비슷하게 되었고, 1가 불포화지방산의 비율은 오히려 V: alginolyticus가 더 높았다 (Table 2). 이러한 결과에서 세균 균체 의 지방산 조성과 미세조류의 생육저해와는 뚜렷한 관련이 없는 것으로 사료된다.
- 순수배양한 미세조류의 지방산 조성은 C. calcitrans의 경우 포 및 14:0 (12.1%)이었고, S. Gostatume 16:ln-7(289%), 16:0 (21.6%) 및 20:5 (19, 8%)로 나타나 규조류에 있어서도 종에 따라 지방산 조성에 뚜렷한 차이가 있었다.
- 한편, 시험 규조류를 V. alginolytici応와 흔합배양하였을 때의 지방산 조성은 C. calcitrans의 경우 포화지방산이 455%, 1가 불 포화지방산이 42.2%, 다가 불포화지방산이 9.9 %를 차지하여 순수 배양한 조체와 약간의 차이를 나타내었으며, 포화지방산은 증가한 반면 불포화지방산은 감소하는 경향을 나타내었다. 그리고 S.
- 화지 방산이 42.7%, 1가 불포화지방산이 44.6% 그리고 다가 불포화지방산이 100%이었으며, S. cosfatume 각각 27.0%, 39.6% 그리고 25.0%로 S. costatum이 C. cal前ram에 비하여 다가 불포화 지방산의 비율이 훨씬 높았다. 10% 이상을 차지하는 주요 지방산의 종류는 C calamus의 경우 16:ln-7(33.
후속연구
- ca/citrans의 지방산 조성에서 불포화지방산이 차지하는 비율이 높아지고, 그 일부는 위에서 나타낸 바와 같이 사멸하면서 조체에서 유리되어 자동산화 등에 의하여 생성된 free radical이 세균이 생성하는 생육저해물질에 의한 조류의 생육저해와 더불어 상승효과를 나타낸 것으로 추정된다. 이때 배양온도가 낮을수록 규조류에서 불포화지방산 비율이 높아져 생육저해가 더욱 촉진되는 것으로 추정할 수 있었는데 자세한 기구에 대해서는 보다 더 연구가 있어야 할 것으로 사료된다.
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