[논문]Ceriporia lacerata 배양액과 고정화 Lactobacillus plantarum K154를 이용한 감마아미노뷰티르산 생산 최적화

이은지; 이삼빈

doi:10.9721/kjfst.2015.47.4.438

Ceriporia lacerata 배양액과 고정화 Lactobacillus plantarum K154를 이용한 감마아미노뷰티르산 생산 최적화
Optimization of γ-Aminobutyric Acid (GABA) Production Using Immobilized Lactobacillus plantarum K154 in Submerged Culture of Ceriporia lacerata 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.47 no.4, 2015년, pp.438 - 445

초록
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L. plantarum K154 고정화와 C. lacerata 균사체 배양물을 이용한 혼합발효를 통해서 다당류, ${\beta}$-glucan과 같은 생리활성물질과 기능성 GABA 생산을 최적화 하고자 하였다. C. lacerata 균사체의 최적 배양 조건으로 glucose 3%, soybean flour 3%, $MgSO_4$ 0.15%를 혼합하여 배지로 사용하였고, 5 L jar fermentor를 이용하여 $25^{\circ}C$에서 7일간 진탕 배양하였다. 배양물은 균사체 함량 29.7 g/L, 다당류 함량 3.1 g/L, ${\beta}$-glucan 2% (w/w), protease 활성 68.96 unit/mL, ${\alpha}$-amylase 활성 10.37 unit/mL로 매우 높게 나타났다. C. lacerata 균사체 배양물을 이용하여 젖산세균 고정화에 의한 혼합발효물의 생균수를 측정한 결과, 배양 1일 째 비드 내에서 젖산세균의 수는 $3.13{\time}10^9CFU/mL$로 높게 나타났고, 배지에 유리된 젖산세균의 수는 배양기간 동안 $1.48{\time}10^8CFU/mL$로 유지하였다. 알지네이트 1.5%를 사용하여 비드를 제조하였을 때, GABA 함량을 측정한 결과 배양 7일 째 비드 내에서 6.30 mg/mL, 배지에서 9.96 mg/mL로 높게 나타났다. 젖산세균 고정화의 재사용 가능성을 확인하기 위해 고정화 비드를 5회간 재사용하여 $30^{\circ}C$에서 15일간 혼합발효한 결과, GABA 생산이 급격히 증가하여 배양 기간 동안 유지하였다. 결론적으로 C. lacerata 균사체 배양물로부터 고정화된 젖산세균을 이용한 혼합발효는 고농도 GABA를 포함된 기능성 소재를 생산할 수 있었으며, 이는 식품 및 생물 산업의 원료로 활용이 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The production of GABA was optimized by co-cultivation of immobilized Lactobacillus plantarum K154 (ILK) with Ceriporia lacerata cultures. The mycelial culture of C. lacerata was performed in a defined medium containing 3% glucose, 3% soybean flour, and 0.15% $MgSO_4$ in a submerged condition for 7 days at $25^{\circ}C$, resulting in the production of 29.7 g/L mycelia, 3.1 g/L exopolysaccharides, 2% (w/w) ${\beta}$-glucan, 68.96 unit/mL protease, and 10.37 unit/mL ${\alpha}$-amylase. ILK in C. lacerata culture showed viable cell counts of $3.13{\time}10^9CFU/mL$ for immobilized cells and $1.48{\time}10^8CFU/mL$ for free cells after 1 day. GABA production in the free and immobilized cells was 9.96 mg/mL and 6.30 mg/mL, respectively, after 7 days. A recycling test of ILK in the co-fermentation was consequently performed five times at $30^{\circ}C$ for 15 days, resulting in the highest production of GABA. GABA could also be efficiently overproduced by co-cultivation with the produced polysaccharides, ${\beta}$-glucan, peptides, and probiotics.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

L. plantarum K154 고정화와 C. lacerata 균사체 배양물을 이용한 혼합발효를 통해서 다당류, β-glucan과 같은 생리활성물질과 기능성 GABA 생산을 최적화 하고자 하였다.
따라서 본 연구는 버섯 배양물을 이용하여 GABA생산 젖산세균의 혼합배양을 통해서 다양한 생리활성물질과 GABA 생산을 최적화하고자 하였으며, 이를 위해서 1차적으로 C. lacerata 버섯 종균의 액체배양을 통해서 생리활성물질을 포함한 균사체 배양을 최적화하였으며, 2차적으로 고정화된 젖산세균의 혼합배양 기술을 통해서 GABA물질이 강화된 버섯배양물 소재의 생산을 최적화하고자 하였다.

제안 방법

C. lacerata 균사체 배양물에 함유된 균사체와 세포외 다당류 함량은 Lee 등(23)의 방법을 변형하여 측정하였다. 배양액 200mL씩 취하여 원심 분리(1,500×g, 20 min)하여 침전물과 상층액으로 분리하였다.
C. lacerata 균사체 배양물의 냉동건조 분말 100 mg을 정량 하여 Megazyme kit (K-BGLU, Megazyme International Ireland, Co. Wicklow, Ireland)를 이용하여 베타 글루칸 함량을 측정하였다(24). 반응액의 흡광도를 510 nm에서 측정하였으며, 총 글루칸과 알파 글루칸 함량의 차이를 베타 글루칸 함량으로 계산하였다.
2% ninhydrin을 사용하여 GABA spot을 확인하였다. C. lacerata 균사체 배양물의 젖산발효 기간에 따른 glutamic acid 잔존량과 생성된 GABA 함량을 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 통해 측정하였다(31). 건조시킨 시료를 상온에서 30분간 phenyl isothiocynate (PITC), 메탄올(MeOH):H₂O:TEA:PITC=7:1:1:1)를 가하여 유도체화한 다음, 100% 용매 A (140 mM NaOAc, 0.
C. lacerata 균사체 액체 배양의 최적배양 조건으로 glucose 3%, 콩가루 3%, 황산마그네슘(MgSO₄) 0.15%를 혼합한 배지 조성을 이용하여 5 L jar fermentor에서 7일 동안 진탕 배양한 C. lacerata 균사체 액체 배양물의 이화학적 특성을 분석하였다(Table 1). pH 는 배양 전 pH 6.
lacerata 균사체 배양물을 이용한 혼합발효를 통해서 다당류, β-glucan과 같은 생리활성물질과 기능성 GABA 생산을 최적화 하고자 하였다. C. lacerata 균사체의 최적 배양 조건으로 glucose 3%, soybean flour 3%, MgSO₄ 0.15%를 혼합하여 배지로 사용하였고, 5 L jar fermentor를 이용하여 25℃에서 7일간 진탕 배양하였다. 배양물은 균사체 함량 29.
C. lacerata 버섯에서 유래되는 단백질 가수분해효소와 녹말 분해효소활성을 측정하기 위해 Protease의 활성도는 Kim 등의 방법(26)을 변형하여 측정하였다. 기질은 0.
, Cheongwon, Korea)에서 진탕 배양하였다. PDA 배지에서 배양된 C. lacerata 버섯 종균을 펀치(punch)를 이용하여 지름 1.5cm로 절개한 다음 potato dextrose broth 100 mL에 첨가한 후 균질기(homogenizer) (10,000 rpm, 3 min)로 균질화 하여 첨가하였다. 배양 조건으로 온도 25℃, 공기주입량 1 vvm, 회전속도 300 rpm으로 하여 7일간 진탕 배양한 후 화학적 특성을 평가하였다.
lacerata 균사체 배양물의 젖산발효 기간에 따른 glutamic acid 잔존량과 생성된 GABA 함량을 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 통해 측정하였다(31). 건조시킨 시료를 상온에서 30분간 phenyl isothiocynate (PITC), 메탄올(MeOH):H₂O:TEA:PITC=7:1:1:1)를 가하여 유도체화한 다음, 100% 용매 A (140 mM NaOAc, 0.1% TEA, 6% CH₃CN, pH 6.1)와 100% solvent B (60% CH3CN)로 25분간 녹인 후, 원심 분리한 상층액을 HPLC (Hewlett packard 1100 series, Palo Alto, CA, USA)로 분석하였다. Column은 Waters Nova-Pak C18 4 µm (Waters, Milford, DE, USA)를 사용하였으며, flow rate는 1.
알긴산칼슘을 이용한 젖산세균 고정화는 높은 밀도의 고정화 미생물에 의해 발효 생산성을 높이며(34), 균체 회수와 재사용이 가능하여 높은 세포 농도로 발효가 가능한 장점이 있다(35). 고정화된 젖산세균을 이용하여 C. lacerata 버섯 균사체 배양물로부터 GABA 생산을 위해 혼합발효를 하였으며, 7일간 젖산발효 후 sodium alginate 1.5%와 3%에 따라서 pH와 산도를 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 알지네이트 농도에 따른 젖산세균을 고정화한 비드의 직경을 측정한 결과, 비드 크기는 알지네이트 1.
lacerata 버섯에서 유래되는 단백질 가수분해효소와 녹말 분해효소활성을 측정하기 위해 Protease의 활성도는 Kim 등의 방법(26)을 변형하여 측정하였다. 기질은 0.6% 카세인을 사용하였고, 시료 상층액을 0.02 M 인산완충용액(phosphate buffer, pH 7.0)로 희석하여 조효소액을 조제하여 단백질 가수분해 효소 활성을 측정하였다. α-Amylase 활성은 아이오딘 전분반응으로 측정되었다(27).
Wicklow, Ireland)를 이용하여 베타 글루칸 함량을 측정하였다(24). 반응액의 흡광도를 510 nm에서 측정하였으며, 총 글루칸과 알파 글루칸 함량의 차이를 베타 글루칸 함량으로 계산하였다. 버섯 배양물에서 생산된 펩타이드(peptide) 함량을 측정하기 위하여 folin 시약을 이용하여 tyrosine 함량을 측정하였다(25).
5cm로 절개한 다음 potato dextrose broth 100 mL에 첨가한 후 균질기(homogenizer) (10,000 rpm, 3 min)로 균질화 하여 첨가하였다. 배양 조건으로 온도 25℃, 공기주입량 1 vvm, 회전속도 300 rpm으로 하여 7일간 진탕 배양한 후 화학적 특성을 평가하였다.
반응액의 흡광도를 510 nm에서 측정하였으며, 총 글루칸과 알파 글루칸 함량의 차이를 베타 글루칸 함량으로 계산하였다. 버섯 배양물에서 생산된 펩타이드(peptide) 함량을 측정하기 위하여 folin 시약을 이용하여 tyrosine 함량을 측정하였다(25).
2와 같다. 생균수 측정은 비드 내에 고정화된 젖산세균 생균수와 배지에 유리된 젖산세균 생균수를 측정하여 비교하였다. 알지네이트 1.
생균수는 비드 내에 고정화된 젖산세균수와 배지에 유리된 젖산세균수를 각각 측정하여 비교하였다. 비드 내의 젖산세균수는 고정화된 비드의 피복물질을 1 M phosphate buffer (pH 7.
아이소프로필 알코올에 침전된 다당류는 원심 분리(1,500×g, 20 min)하여 회수한 후, 냉동건조하여 무게를 측정하였다.
알긴산소듐 1.5%와 3%에 MRS 배지에서 배양한 젖산세균을 5% 첨가한 후 혼합하여 cell suspension 용액을 얻은 후, 0.1 M CaCl₂에 적하하여 알긴산칼슘 비드를 제조하였다. 제조된 비드는 멸균 증류수로 2회 세척한 다음 배지에 첨가하였다.
lacerata 균사체 배양물의 글루탐산(glutamic acid)의 전환에 따른 GABA 생산을 thinlayer chromatography (TLC) 분석으로 확인하였다(30). 전개용매는 노말 뷰틸알코올(nbutyl alcohol):빙초산:증류수(3:1:1-v/v/v)를 혼합하였고, 발색시약으로 0.2% ninhydrin을 사용하여 GABA spot을 확인하였다. C.
, Pocheon, Korea)를 이용하여 30℃에서 7일간 정치 배양하였다. 젖산세균 고정화의 재사용에 의한 GABA 생산 과정은 비드는 지속적으로 사용하면서 3일간 배양 후 기존의 배지는 제거하고, 새로운 배지를 첨가하여 3일 간격으로 5회 간 배지를 교체하면서 혼합발효를 하였다.
고정화 젖산세균의 표면 및 단면 형태의 자세한 관찰을 위하여 전계방사형 주사전자현미경(FESEM, CFE, S-4800, Hitachi, Tokyo, Japan)을 이용하였다. 젖산세균 비드를 냉동건조한 후 표면을 오스뮴(osmium, Os)으로 코팅시켜 전도성을 갖게 하였으며, 가속전압(3 kV, SE Image)모드로 40배에서 100배로 하여 관찰하였다.
실온의 암소에서 40분간 냉각 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총당 및 환원당 함량은 포도당(glucose)을 표준물질로 하여 표준곡선을 작성한 후 산출하였다.
제조된 비드는 멸균 증류수로 2회 세척한 다음 배지에 첨가하였다. 혼합배양에 사용한 배지 조성으로 C. lacerata 버섯 배양물에 skim milk 5% (v/v), 글루탐산소듐 2% (w/v)를 첨가한 후 세포배양플라스크(cell culture flask) (SPL Co., Pocheon, Korea)를 이용하여 30℃에서 7일간 정치 배양하였다. 젖산세균 고정화의 재사용에 의한 GABA 생산 과정은 비드는 지속적으로 사용하면서 3일간 배양 후 기존의 배지는 제거하고, 새로운 배지를 첨가하여 3일 간격으로 5회 간 배지를 교체하면서 혼합발효를 하였다.

대상 데이터

C. laceara 버섯을 액체배양의 균사체 생산을 최적화하기 위해 성립된 배지 조성으로 glucose 3% (w/v), soybean flour 3% (w/v), 황산마그네슘(MgSO₄) 0.15% (w/v)를 혼합하여 구성된 GSM (glucose, soybean flour, MgSO₄)을 기본 배지로 사용하였다. GSM 배지를 121℃에서 15분간 멸균하여 5L자 발효기(Fermentec Co.
GABA를 생산하는 젖산세균은 김치에서 분리한 것으로, L. plantarum K154 (KACC 91727)를 Lactobacilli MRS broth agar (Difco. Co.) 배지에 접종하여 30oC, pH 6.5±0.2, 24시간 배양하여 사용하였다.
α-Amylase 활성은 아이오딘 전분반응으로 측정되었다(27). 기질로는 1% 가용성 전분을 사용하였으며, 요오드화 용액(0.005% I₂, 0.05% KI)으로 발색시켜 구하였다.
본 시험에 사용한 버섯 균주는 (주)월드바이오텍(Gimcheon, Korea)에서 분양 받은 C. lacerata로 potato dextrose agar (PDA, Difco. Co. Maryland, NY, USA) 배지에 접종하여 25oC, pH 5.1±0.2, 암소 조건에서 10일간 배양하여 사용하였다.
는 덕산 화학(Ansan, Korea)제품을 구입하였고, 글루탐산소듐(sodium L-glutamate)은 Yakuri Pure Chemicals (Kyoto, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 탈지 콩가루는 유성식품(Gwangju, Korea)에서 구입하여 밀봉한 후 암소에서 보관하여 사용하였다. 탈지우유 분말은 서울우유(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 균체 고정화 제조에 사용한 알긴산은 SigmaAldrich사(St.
탈지 콩가루는 유성식품(Gwangju, Korea)에서 구입하여 밀봉한 후 암소에서 보관하여 사용하였다. 탈지우유 분말은 서울우유(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 균체 고정화 제조에 사용한 알긴산은 SigmaAldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
포도당(glucose), 에틸알코올(ethyl alcohol), 황산마그네슘(7수염) (MgSO4·7H2O), CaCl2는 덕산 화학(Ansan, Korea)제품을 구입하였고, 글루탐산소듐(sodium L-glutamate)은 Yakuri Pure Chemicals (Kyoto, Japan)에서 구입하여 사용하였다.

데이터처리

Each value is a mean±SE (n≥3); a-cMeans in a same row with different alphabets are significantly different by Duncan’s multiple range test (p<0.05).
Each value is a mean±SE (n≥3); a-dMeans in a same row with different alphabets are significantly different by Duncan’s multiple range test (p<0.05).
a-dMeans in a same row with different alphabets are significantly different by Duncan’s multiple range test (p<0.05).
a-eMeans in a same row with different alphabets are significantly different by Duncan’s multiple range test (p<0.05).
a-nMeans in a same row with different alphabets are significantly different by Duncan’s multiple range test (p<0.05).
실험 결과는 평균값과 표준오차(mean±SE)로 나타내었으며, 통계처리는 SPSS (statistical package for social science, ver. 21.05, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 일원배치분실 분석을 실시한 후 Duncan’s multiple range test로 유의성을 p<0.05 수준에서 검증하였다.

이론/모형

고정화 젖산세균의 표면 및 단면 형태의 자세한 관찰을 위하여 전계방사형 주사전자현미경(FESEM, CFE, S-4800, Hitachi, Tokyo, Japan)을 이용하였다. 젖산세균 비드를 냉동건조한 후 표면을 오스뮴(osmium, Os)으로 코팅시켜 전도성을 갖게 하였으며, 가속전압(3 kV, SE Image)모드로 40배에서 100배로 하여 관찰하였다.
총 당 함량은 페놀-황산(phenol-H2SO4)법(21)에 따라 시료액 1 mL에 80% 페놀 용액 25 µL를 가한 뒤 황산 2.5 mL을 첨가하여 격렬히 반응 시킨 후 실온에서 30분간 정치시켜 485 nm에서 흡광도를 측정하였다.
5 mL을 첨가하여 격렬히 반응 시킨 후 실온에서 30분간 정치시켜 485 nm에서 흡광도를 측정하였다. 환원당 함량은 DNS (dinitrosalicylic acid)법에 의해 측정하였다(22). 희석한 시료 1 mL에 DNS 시약 3 mL을 가하고, 100℃에서 5분간 발색시킨다.

성능/효과

C. lacerata 균사체 배양물에 skim milk 5%와 MSG 2%를 첨가한 2차 젖산발효물의 초기 pH는 알지네이트 1.5%와 3%로 제조한 비드의 경우, 각각 pH 6.09, pH 6.11로 약산성으로 나타났다. 산도를 측정한 결과, 배양 전 0.
C. lacerata 균사체 배양물을 이용하여 젖산세균 고정화에 의한 혼합발효물의 생균수를 측정한 결과, 배양 1일 째 비드 내에서 젖산세균의 수는 3.13×109 CFU/mL로 높게 나타났고, 배지에 유리된 젖산세균의 수는 배양기간 동안 1.48×108 CFU/mL로 유지하였다.
C. lacerata 균사체 배양물의 α-amylase 활성을 측정한 결과에서 배양 3일 째는 4.85 unit/mL로 나타났고, 배양 기간 중 급격히 증가하여 배양 7일 째는 10.37 unit/mL로 효소 활성이 높게 나타났다.
C. lacerata 균사체 배양물의 단백질 가수분해 정도를 간접적으로 확인할 수 있는 tyrosine 함량을 측정한 결과, 배양 전에는 130.71 µg/mL에서 7일 배양하였을 때 580.84 µg/mL로 나타나 tyrosine 함량이 높은 경향을 보였다.
61%로 감소하여 배양기간 동안 유지하였다. C. lacerata 균사체 배양에 사용된 배지만을 이용하여 젖산세균 고정화에 의한 젖산발효를 하였을 때, 배양기간이 지속될수록 산도가 완만하게 증가하는 경향을 보였다(data not shown). 그러나 C.
60 mg/mL로 나타났으며, 배양기간이 지속될수록 소진되어 GABA로 전환되었다. GABA 함량은 배양 3일 후 4.52 mg/mL로 생성되었고, 혼합발효 2회 때 5.39 mg/mL로 증가하였으며, 새로운 배지를 첨가하여 발효 횟수가 많아질수록 GABA 함량이 지속적으로 증가하여, 혼합발효 5회 때 배지에서 생성된 GABA가 6.04 mg/mL로 나타났다.
11 mg/mL로 급격히 감소하여 배양기간 동안 유지하였다. GABA 함량은 배양 3일 후 4.97 mg/mL로 생성되었으며, 새로운 배지를 첨가할수록 GABA 함량이 증가하여 혼합발효 2회 때 6.24 mg/ mL로 나타났고, 혼합발효 5회 때 배지에서 6.41 mg/mL의 GABA 함량이 생성되었다. 알지네이트 3%를 사용하였을 때, glutamic acid 함량은 배양 전 9.
GAD활성을 위해 요구되는 세포 내에는 배양액에 의해 공급되는 것으로 생각되며, 산의 감소를 초래하는데, 이는 젖산발효 기간 동안 산도가 낮게 측정되는 결과에서 알 수 있다. L. plantarum K154 균주는 탈지분유가 강화된 C. lacerata 균사체 배양액을 이용하여 산생성능과 동시에 장기간의 젖산발효 동안 높은 생균수를 유지하면서 GABA 생산능이 월등히 높은 것으로 나타났다. 최종적인 혼합발효에 의한 젖산발효물은 GABA, 다당류, 젖산과 프로바이오틱 활성이 강화되었다.
3B). TLC를 측정할 때, 시료를 2배 희석하여 측정하였으며, 최종적으로 C. lacerata 균사체 배양물로부터 젖산 세균 고정화를 이용한 혼합발효물의 배양 7일 째 배지와 비드 내에서 GABA가 모두 1% 정도 생성된 것을 알 수 있었다.
5% 이상 GABA 함량이 유지되었다(data not shown). 고정화 균체를 장시간 사용하면서 3일간 발효 후 지속적으로 C. lacerata 균사체 배양물과 skim milk의 첨가로 젖산세균의 생육을 높이고, 고정화된 균체의 안정화와 GABA 생산에 도움을 준 것으로 생각된다.
27%로 감소하였다. 고정화 균체를 장시간 사용하면서 혼합발효 기간 동안 지속적으로 배지를 첨가하여 젖산세균의 생육에 영향을 주어 pH는 감소하고 산도가 증가하였다.
따라서 알긴산칼슘 비드는 알지네이트 농도 및 발효공정에 의해서 비드 입자 직경, 입자내부 밀도 등의 조절이 가능할 것으로 생각되었다. 비드의 물성은 알지네이트의 원료, 응고제의 조성에 따라 결정되며, 비드의 형태는 알지네이트의 점도에 상당히 의존하며(39), 알긴산칼슘 비드는 다공성임을 보고되었다(40).
이는 −80℃ 급속 냉동과 같은 시료 전처리 과정이 외부충격 요인으로 작용하였다는 보고가 있었다(10). 따라서 알지네이트 3%를 cell suspension 용액으로 제조한 젖산 세균 비드를 FESEM을 통해 형태를 관찰한 결과, 알지네이트 1.5%로 제조한 비드에 비해 비교적 손상 받지 않으면서 구형을 나타내었다. 비드를 칼로 절단 한 후 단면을 관찰한 결과 다공성 구조임을 확인하였고, 이러한 형태는 높은 농도의 알지네이트로 비드를 제조하여 비드 자체에 내구성이 부여된 것으로 보여진다.
93 mg/mL로 나타났다. 따라서 알지네이트 농도에 따른 고정화 젖산세균에 의한 GABA생산은 배지에 존재하는 글루탐산 소듐이 비고정화 젖산세균에 의해서 효과적으로 전환되며, 동시에 알지네이트 비드 내부로 유입된 글루탐산소듐이 고정화 젖산 세균에 의해서 GABA로 전환되었다. 이는 알지네이트로 고정화시킨 젖산세균을 이용한 GABA생산에서 기질인 글루탐산소듐이 비드 바깥쪽에서 생육하는 젖산세균에 의해서 효과적으로 GABA로 전환됨 알 수 있었다.
lacerata 균사체 배양물의 배양 기간에 따라서 단백질 가수분해에 의한 펩타이드 생산이 증가되는 것으로 생각된다. 또한 버섯 배양물의 protease 활성을 측정한 결과, 배양 7일 째 68.96 unit/mL로 나타나 높은 가수분해효소 활성을 보였다. Park (33)은 현미에서 배양한 장수버섯과 상황버섯 균사체 배양물의 protease 활성을 측정한 결과, 20일 배양 시 장수버섯 배양물에서 42.
반면에, 배지에서는 생균수는 낮았지만 배양기간 동안 1.48×108 CFU/mL으로생균수가 일정하게 유지하는 것으로 보아 균주의 안정성이 높은 것을 알 수 있었다.
17로 감소하였다. 발효 1회 이후에 2회 때부터 5회간 새로운 배지를 공급할때, 배양 전 pH 5.10으로 나타났으며, 새로운 배지를 공급한 후 각각의 배양 기간에 따라서 pH가 감소하였다. 알지네이트 3%를 이용하여 제조한 젖산세균 고정화의 pH를 측정한 결과, 배양 전 6.
5% 알지네이트를 사용하였을 때보다 GABA spot의 크기가 더 크게 나타났다. 배양 1일 째 GABA 함량이 급격히 증가하여 배양 기간이 지속될수록 0.5% 이상의 GABA 함량이 유지되었으며, 배양 3일 후 글루탐산소듐이 대부분 소진되었다(Fig. 3A). 배지에서 생성된 GABA 함량을 측정한 결과, 3% 알지네이트를 사용하였을 때 GABA 농도가 더 증가하였으며, 배양 1일 째 GABA가 0.
배양 7일 째, 균사체 함량은 29.70 g/L, 세포 외 수용성 다당류 함량은 3.10 g/L로 높게 나타났다. Lee와 Lee(32)은 쌀겨를 이용하여 C.
배양 7일 후, 알지네이트 3%로 제조한 젖산세균 비드의 표면을 관찰한 결과, 장기간 발효로 인해 젖산세균이 고정화하고 있는 담체와 조밀한 결합으로 비드 표면에 미세한 주름을 나타내는 것을 확인하였다. 단면을 관찰하였을 때, 배양 전 보다 비드 내의 다공성이 치밀하게 채워진 형태를 나타내었다.
25% 정도 생성되어 배양 3일 후 글루탐산소듐이 대부분 소진되면서 GABA spot이 급격히 커지는 것을 볼 수 있다. 배양 7일째, 3% 알지네이트를 사용하였을 때 GABA 함량이 0.5% 이상으로 나타났다(Fig. 3B). TLC를 측정할 때, 시료를 2배 희석하여 측정하였으며, 최종적으로 C.
3에 나타내었다. 배양기간 동안 비드 내에서 생성된 GABA 함량을 측정한 결과, 3% 알지네이트를 사용하였을 때 1.5% 알지네이트를 사용하였을 때보다 GABA spot의 크기가 더 크게 나타났다. 배양 1일 째 GABA 함량이 급격히 증가하여 배양 기간이 지속될수록 0.
배양물은 균사체 함량 29.7 g/L, 다당류 함량 3.1 g/L, β-glucan 2% (w/w), protease 활성 68.96 unit/mL, α-amylase 활성 10.37 unit/mL로 매우 높게 나타났다.
3A). 배지에서 생성된 GABA 함량을 측정한 결과, 3% 알지네이트를 사용하였을 때 GABA 농도가 더 증가하였으며, 배양 1일 째 GABA가 0.25% 정도 생성되어 배양 3일 후 글루탐산소듐이 대부분 소진되면서 GABA spot이 급격히 커지는 것을 볼 수 있다. 배양 7일째, 3% 알지네이트를 사용하였을 때 GABA 함량이 0.
분리된 다당류로부터 β-glucan 함량을 측정한 결과, 배양 7일 째 2.00% (w/w)로 나타났으며, fermentor를 이용한 액체 배양을 통해서 균사체, 다당류, β-glucan 생산이 우수하였다.
5%로 제조한 비드에 비해 비교적 손상 받지 않으면서 구형을 나타내었다. 비드를 칼로 절단 한 후 단면을 관찰한 결과 다공성 구조임을 확인하였고, 이러한 형태는 높은 농도의 알지네이트로 비드를 제조하여 비드 자체에 내구성이 부여된 것으로 보여진다.
52로 약산성을 나타내었다. 산도를 측정한 결과, 배양 전 0.05%에서 7일 배양 후 0.32%로 증가하였다. 당도에서 배양 초기 4.
48×10⁸ CFU/mL로 유지하였다. 알지네이트 1.5%를 사용하여 비드를 제조하였을 때, GABA 함량을 측정한 결과 배양 7일 째 비드 내에서 6.30 mg/ mL, 배지에서 9.96 mg/mL로 높게 나타났다. 젖산세균 고정화의 재사용 가능성을 확인하기 위해 고정화 비드를 5회간 재사용하여 30℃에서 15일간 혼합발효한 결과, GABA 생산이 급격히 증가하여 배양 기간 동안 유지하였다.
5와 같다. 알지네이트 1.5%를 이용하여 제조한 젖산세균 고정화의 pH를 측정한 결과, 배양 전 pH 6.16에서 3일 배양 후 pH 4.17로 감소하였다. 발효 1회 이후에 2회 때부터 5회간 새로운 배지를 공급할때, 배양 전 pH 5.
알지네이트 1.5%를 이용하였을 때, 배양 1일 째 비드 내에서 젖산세균 수가 3.13×109 CFU/mL으로 높게 나타났고, 배양기간이 지속될수록 약간 감소하였지만 높은 값을 보였다.
알지네이트 1.5%를 이용하였을 때, 산도를 측정한 결과, 배양 3일 째 발효 1회 후 1.4%로 높게 나타났으며, 발효 3회 후 1.66%로 증가하였으나, 발효 4, 5회 이후 1.33%로 감소하였다. 알지네이트 3%를 이용하였을 때, 배양 3일 째 발효 1회 후 0.
10으로 나타났으며, 새로운 배지를 공급한 후 각각의 배양 기간에 따라서 pH가 감소하였다. 알지네이트 3%를 이용하여 제조한 젖산세균 고정화의 pH를 측정한 결과, 배양 전 6.15로 나타났으며, 3일 배양 후 4.28로 감소하였다. 발효 2, 3회 때, 새로운 배지를 공급하는 배양 전 pH는 5.
알지네이트 3%를 이용하였을 때, 3일 배양 후 발효 1회에서 2.60×108 CFU/mL로 나타났으며, 발효 5회 후 2.95×108 CFU/mL로 높게 나타났다.
33%로 감소하였다. 알지네이트 3%를 이용하였을 때, 배양 3일 째 발효 1회 후 0.89%로 나타났고, 발효 3회 후 1.47%로 증가하였으나, 발효 4, 5회 후 1.27%로 감소하였다. 고정화 균체를 장시간 사용하면서 혼합발효 기간 동안 지속적으로 배지를 첨가하여 젖산세균의 생육에 영향을 주어 pH는 감소하고 산도가 증가하였다.
48×10⁸ CFU/mL으로생균수가 일정하게 유지하는 것으로 보아 균주의 안정성이 높은 것을 알 수 있었다. 알지네이트 농도에 따라서 배지와 비드 내에서 젖산세균의 생균수에서 차이가 없었으며, 젖산세균수가 배양 기간이 지속될수록 유지되는 것을 알 수 있었다. 혼합발효 시 skim milk의 첨가로 인해 젖산세균의 생육을 높일 수 있고, 이러한 L.
1과 같다. 알지네이트 농도에 따른 젖산세균을 고정화한 비드의 직경을 측정한 결과, 비드 크기는 알지네이트 1.5%, 3%로 제조하였을 때 평균적으로 각각 2.09 mm 및 2.63 mm로 나타났다. Jeon (17)의 연구에서 GABA 생산을 위해 젖산세균 고정화 비드의 직경을 평균 2.
젖산세균 고정화 비드를 이용하여 혼합발효를 통해 배지에서 생성된 GABA 함량을 분석한 결과, 발효 1회 이후 2회 때부터 GABA 생산이 급격히 증가하여 혼합발효 5회 동안 0.5% 이상 GABA 함량이 유지되었다(data not shown). 고정화 균체를 장시간 사용하면서 3일간 발효 후 지속적으로 C.
젖산세균 고정화 비드의 재사용 과정에서 배지에 유리된 생균 수를 측정한 결과, 알지네이트 1.5%를 이용하였을 때, 발효 5회 동안 3.52×108 CFU/mL으로 유지하였다(data not shown).
96 mg/mL로 높게 나타났다. 젖산세균 고정화의 재사용 가능성을 확인하기 위해 고정화 비드를 5회간 재사용하여 30℃에서 15일간 혼합발효한 결과, GABA 생산이 급격히 증가하여 배양 기간 동안 유지하였다. 결론적으로 C.
83^oBx로 발효가 진행될수록 감소하였다. 총당과 환원당 함량을 측정한 결과, 배양이 지속될 수록 감소하는 경향을 보였다. 환원당은 염기성 용액에서 알데하이드 또는 케톤을 형성하는 당의 일종으로 포도당, 과당, 엿당, 글리세르알데히드 및 아라비노오스 등이 여기에 속한다.
lacerata 균사체 배양액을 이용하여 산생성능과 동시에 장기간의 젖산발효 동안 높은 생균수를 유지하면서 GABA 생산능이 월등히 높은 것으로 나타났다. 최종적인 혼합발효에 의한 젖산발효물은 GABA, 다당류, 젖산과 프로바이오틱 활성이 강화되었다.

후속연구

젖산세균 고정화의 재사용 가능성을 확인하기 위해 고정화 비드를 5회간 재사용하여 30℃에서 15일간 혼합발효한 결과, GABA 생산이 급격히 증가하여 배양 기간 동안 유지하였다. 결론적으로 C. lacerata 균사체 배양물로부터 고정화된 젖산세균을 이용한 혼합발효는 고농도 GABA를 포함된 기능성 소재를 생산할 수 있었으며, 이는 식품 및 생물 산업의 원료로 활용이 기대된다.
비드의 물성은 알지네이트의 원료, 응고제의 조성에 따라 결정되며, 비드의 형태는 알지네이트의 점도에 상당히 의존하며(39), 알긴산칼슘 비드는 다공성임을 보고되었다(40). 이러한 알긴산칼슘의 형성 메카니즘을 통해 C. lacerata 균사체 배양물로부터 젖산세균 고정화를 이용한 GABA 생산과 같은 식품분야에서 활용이 가능하고, 내부 활성 물질의 지속적인 방출 및 외부환경으로부터의 보호 등의 목적으로 의약, 화장품, 식품 등 다양한 분야에서 활용이 기대된다(41,42).

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	미생물의 고정화 기술 중 균체고정화는 어떤 장점을 가지고 있는가?	미생물의 고정화 과정은 수용성 고분자 알긴 산소듐(sodium alginate) 분산액을 염화칼슘 용액에 소량씩 적하 하면 알긴산칼슘(Ca-alginate) 비드가 형성된다(16). 미생물 균체고정화 기술은 이러한 고정화 균체를 이용한 발효기술은 장기간 균체를 사용할 수 있으며, 연속 발효가 가능하여 생산성을 높일수 있고, 오염을 방지할 수 있는 장점이 있다(17). Tipayang과 Kozaki(18)은 Lactobacillus sp.
	감마아미노뷰티르산은 어떻게 사용되고 있는가?	감마아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid)은 신경전달 억제물질로서 일본에서는 건강 식품소재로 되면서, GABA를 첨가한 식품이나 음료가 개발되어 판매되고 있다. 최근에는 미생물의 발효를 통한 GABA의 생산이 연구되고 있으며(6), 김치에서 분리한 Lactobacillus brevis, L.
	버섯 균사체를 포함한 액체 배양물은 어떤 대사산물을 얻을 수 있는가?	담자균류에 속하는 백색 부후균으로 알려진 Ceriporia lacerata는 참나무나 적송에 부생하며, 목재 내 리그닌을 선택적으로 분해시켜 부후가 진행되면서 백색으로 변하는 형태학적 특징을 가지고 있다(2). 버섯 균사체를 포함한 액체 배양물은 배지의 영양성분 조성과 배양조건에 따라 항균, 항당뇨, 항암 및 산화방지(3) 활성을 가지는 다양한 대사산물을 얻을 수 있었다(4). 최근, Ceriporia lacerata 버섯의 액체배양물이 덱사메타손(dexamethasone) 스트레스에 의한 인슐린 분비 INS-1세포의 보호효과에 대한 연구결과를 보고된 바 있다(5).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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