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문제 정의
- 본 연구에서는 단백질 priming 반응에 관여하는 TP 영역을 특이하게 인지하는 scFv를 만들고자 한다. 현재까지 B형 간염 바이러스중합효소를 인지하는 단클론 항체가 보고된 것은 TP, spacer, RNaseH의 일부분을 인지하는 것이었다.
- Phage display에 있어 가장 중요한 두 가지의 과정에 있어, 본 실험에서는 library 크기가 작고, 항체를 선별하는 것도 용이하지 않았기 때문에 원하는 단클 론 항체를 얻기 위해서 panning이나 선별하는 방법에 대해 조정이 필요하였다. 본 연구에서는 한 번에 보다 많은 수의 클론을 선별하고, 완전한 형태를 지닌 scFv를 얻고자 하는 방법으로 colony lift assay를 시행하였다. 이 방법을 이용하면 100∼300개 정도의 집락들을 한 번에 선별하여 원하는 항체의 선별을 효과적으로 시행할 수 있는 장점이 있다(14).
제안 방법
- 본 연구는 기존의 TP 특이 단클론항체 생산과는 달리 항체를 선별할 때 항원으로 TP 전체 단백질대신에 TP의 65번째 타이로신 잔기 부근의 염기서열과 일치하는 합성 펩타이드를 사용하였다. 합성 펩타이드에 결합하는 단클론항체를 선별하고 선별된 단클론항체가 baculovirus에서 발현된 HBV DNA 중합효소인 pol 단백질과 결합하는 것을 확인함으로써 pol 단백질의 TP영역 중에서도 65번째 타이로신 잔기 주변을 인지할 수 있도록 하였다. 또한 기존의 하이브리도마 방법 대신에 phage display 방법으로 scFv를 생산함으로써 하이브리도마 방법보다 효과적으로 항체를 선별하고, 그 항체에 대한 유전자를 확보하고자 한다.
- 합성 펩타이드에 결합하는 단클론항체를 선별하고 선별된 단클론항체가 baculovirus에서 발현된 HBV DNA 중합효소인 pol 단백질과 결합하는 것을 확인함으로써 pol 단백질의 TP영역 중에서도 65번째 타이로신 잔기 주변을 인지할 수 있도록 하였다. 또한 기존의 하이브리도마 방법 대신에 phage display 방법으로 scFv를 생산함으로써 하이브리도마 방법보다 효과적으로 항체를 선별하고, 그 항체에 대한 유전자를 확보하고자 한다.
- 마우스 면역에 사용될 항원으로 합성한 펩타이드를 사용하였다. 즉, B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 TP 영역 중, 65번째 타이로신 부위를 포함한 24개 아미노산으로 구성된 펩타이드(KVGNFTGLYSS TVPIFNPEWQTPS)를 제작하였다. 이 펩타이드를 제작할 때 N-말단에 바이오틴(biotin)을 부착하여 carrier protein인 뉴트라비딘(NeutrAvidin)과의 결합을 용이하게 하였다(합성펩타이드의 제작은 Peptron, Korea에 주문제작하였다).
- 부착된 항원 480μl와 complete Freund's adjuvant (Sigma) 480 l를 혼합하여 에멀션화하였다. 완전히 에멀션화된 것을 확인한 후, BALB/c 마우스(female, 6∼8주령) 1마리 당 200μl씩 4마리의 마우스의 복강으로 주사하였다. 21일째에 같은 방법으로 뉴트라비딘에 부착된 항원 480 μl을 incomplete Freund's adjuvant(Sigma) 480μl와 혼합하여 에멀션화한 후, 복강 내로 주사하여 2차 면역시켰다.
- 21일째에 같은 방법으로 뉴트라비딘에 부착된 항원 480 μl을 incomplete Freund's adjuvant(Sigma) 480μl와 혼합하여 에멀션화한 후, 복강 내로 주사하여 2차 면역시켰다. 2차 면역 시와 같은 방법으로 35일째 3차 면역을, 45일째 4차 면역을 시행한 후, 54일째에 마우스에서 혈청을 분리하여 ELISA로 면역정도를 확인하였다.ELISA의 방법은 다음과 같다.
- 05% Tween 20 in PBS)을 넣었고 한시간 동안 상온에 방치하였다. Blocking solution을 제거한 뒤, 0.05% PBST로 씻어주고, 1：5,000, 1：20,000, 1： 80,000, 1：160,000으로 희석된 마우스 혈청을 각 well에 100μl씩 넣어준 뒤 한시간 동안 상온에 방치하였다. 한 시간 뒤 well에 있는 희석된 혈청을 모두 제거하고 0.
- RNA 추출과 mRNA의 분리. RNA extraction kit (Pharmacia)를 이용하여 마우스의 비장에서 총 RNA를 추출하였다. 요약하면, 면역된 BALB/c 마우스에서 비장을 적출하여 잘게 조각낸 뒤, 37oC에서 미리 배양된 extraction buffer 3.
- 4), 1 mM EDTA로 재부유시켰다. 추출된 총 RNA를 oligo (dT)-cellulose column (Pharmacia)을 이용하여 mRNA를 분리하였다. Oligo (dT) cellulose column에 1 ml의 high salt buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.
- scFv 유전자 제작과 phagemid vector에 삽입. RPAS mouse scFv module (Pharmacia)을 사용하여 scFv 유전자 절편을 제작하였다. mRNA 주형 10μl (200 ng-1μg)와 RNase free-water 11μl, primed first strand mix (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase random hexadeoxyribonucleotides [pd (N)6] primers) 11μl, DTT solution 1μl를 넣고 37oC에서 한 시간 동안 방치하여 first strand cDNA를 합성하였다.
- mRNA 주형 10μl (200 ng-1μg)와 RNase free-water 11μl, primed first strand mix (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase random hexadeoxyribonucleotides [pd (N)6] primers) 11μl, DTT solution 1μl를 넣고 37oC에서 한 시간 동안 방치하여 first strand cDNA를 합성하였다. VL cDNA 증폭을 위해 합성된 first strand cDNA 33μl에 light primer mix 2μl와 증류수 64μl, AmpliTaq DNA 중합효소(PE Biosystem) 1μl (10U)를 섞고 PCR 반응(30 cycle: 94℃ 1분, 55℃ 2분, 72℃ 2분)을 시켰다. VH cDNA 증폭을 위해 first strand 33μl, heavy primer mix I 2μl, heavy primer mix II 2μl와 증류수 62μl, AmpliTaq DNA 중합효소 1μl (10 U)를 혼합하여 같은 방법으로 PCR반응을 시행하였다.
- VL cDNA 증폭을 위해 합성된 first strand cDNA 33μl에 light primer mix 2μl와 증류수 64μl, AmpliTaq DNA 중합효소(PE Biosystem) 1μl (10U)를 섞고 PCR 반응(30 cycle: 94℃ 1분, 55℃ 2분, 72℃ 2분)을 시켰다. VH cDNA 증폭을 위해 first strand 33μl, heavy primer mix I 2μl, heavy primer mix II 2μl와 증류수 62μl, AmpliTaq DNA 중합효소 1μl (10 U)를 혼합하여 같은 방법으로 PCR반응을 시행하였다. PCR에 의해 증폭된 각각의 DNA를 agarose gel상에서 gel extraction kit (QIAGEN)를 이용하여 정제한 후, 정제된 VH, VL cDNA를 scFv cDNA로 만들기 위해 다음과 같은 PCR 반응을 시행하였다.
- VH cDNA 증폭을 위해 first strand 33μl, heavy primer mix I 2μl, heavy primer mix II 2μl와 증류수 62μl, AmpliTaq DNA 중합효소 1μl (10 U)를 혼합하여 같은 방법으로 PCR반응을 시행하였다. PCR에 의해 증폭된 각각의 DNA를 agarose gel상에서 gel extraction kit (QIAGEN)를 이용하여 정제한 후, 정제된 VH, VL cDNA를 scFv cDNA로 만들기 위해 다음과 같은 PCR 반응을 시행하였다. VH cDNA 50 ng, VL cDNA 50 ng, linker primer 4μl, 25 mM dNTP 2μl, 25 mM MgCl2 8 μl, AmpliTaq 1μl (10 U), 10 ×PCR buffer 5μl를 섞고 총 50μl가 되도록 증류수를 추가하였다.
- PCR에 의해 증폭된 각각의 DNA를 agarose gel상에서 gel extraction kit (QIAGEN)를 이용하여 정제한 후, 정제된 VH, VL cDNA를 scFv cDNA로 만들기 위해 다음과 같은 PCR 반응을 시행하였다. VH cDNA 50 ng, VL cDNA 50 ng, linker primer 4μl, 25 mM dNTP 2μl, 25 mM MgCl2 8 μl, AmpliTaq 1μl (10 U), 10 ×PCR buffer 5μl를 섞고 총 50μl가 되도록 증류수를 추가하였다. 이 혼합액을 PCR반응(94oC 3분 후, 7 cycle: 94oC 1분, 45oC 30초, 63oC 4분)으로 연결시킨 뒤, 증폭을 위해 10×PCR buffer 5μl, 10 mM dNTP 2μl, RS primer 4μl, 25 mM MgCl2 3μl, AmpliTaq 1μl (10 U), 증류수 35μl를 추가한 뒤 PCR 반응(35 cycle: 94oC 1분, 55oC 2분, 72oC 2분)을 시행하였다.
- VH cDNA 50 ng, VL cDNA 50 ng, linker primer 4μl, 25 mM dNTP 2μl, 25 mM MgCl2 8 μl, AmpliTaq 1μl (10 U), 10 ×PCR buffer 5μl를 섞고 총 50μl가 되도록 증류수를 추가하였다. 이 혼합액을 PCR반응(94oC 3분 후, 7 cycle: 94oC 1분, 45oC 30초, 63oC 4분)으로 연결시킨 뒤, 증폭을 위해 10×PCR buffer 5μl, 10 mM dNTP 2μl, RS primer 4μl, 25 mM MgCl2 3μl, AmpliTaq 1μl (10 U), 증류수 35μl를 추가한 뒤 PCR 반응(35 cycle: 94oC 1분, 55oC 2분, 72oC 2분)을 시행하였다. 증폭된 scFv DNA를 1.
- 이 혼합액을 PCR반응(94oC 3분 후, 7 cycle: 94oC 1분, 45oC 30초, 63oC 4분)으로 연결시킨 뒤, 증폭을 위해 10×PCR buffer 5μl, 10 mM dNTP 2μl, RS primer 4μl, 25 mM MgCl2 3μl, AmpliTaq 1μl (10 U), 증류수 35μl를 추가한 뒤 PCR 반응(35 cycle: 94oC 1분, 55oC 2분, 72oC 2분)을 시행하였다. 증폭된 scFv DNA를 1.2% agarose gel에서 전기영동시킨 후, VH, VL을 정제한 것과 같은 방법으로 정제하였다. scFv cDNA를 phagemid 벡터에 연결하기 위해 scFv 유전자에 제한효소처리를 시행하였다.
- 2% agarose gel에서 전기영동시킨 후, VH, VL을 정제한 것과 같은 방법으로 정제하였다. scFv cDNA를 phagemid 벡터에 연결하기 위해 scFv 유전자에 제한효소처리를 시행하였다. 약 0.
- scFv cDNA를 phagemid 벡터에 연결하기 위해 scFv 유전자에 제한효소처리를 시행하였다. 약 0.25∼1μg의 scFv DNA를 SfiI (NEB)와 NotI(NEB)로 각각 4시간씩 반응시킨 후, scFv DNA를 scFv marker와 함께 1.2% agarose gel에서 전기영동하여 정량하였다. 정량된 150 ng의 scFv를 T4 DNA ligase (NEB)를 이용하여 phagemid vector인 pCANTAB5E 250 ng과 연결한 후, 에탄올로 침전시켜 TE buffer 20μl로 DNA를 용해시켰다.
- 2 cm 큐벳에 넣은 뒤 1분간 얼음 위에 두었다. Electroporator (Bio Rad, Hercules, CA)를 25μF, 2.5 kV at 200 ohms으로 프로그램하고 준비된 큐벳의 물기를 제거하고 electroporator에 위치시킨 뒤 pulse를 주었다(시간 상수 4.5∼5 msec). pulse후 즉시 37℃로 준비된 1 ml의 LB-G 액체배지를 넣고 마이크로피펫을 이용하여 9회 재부유시켰다.
- 라이브러리에서 재조합 파아지 생산과 PEG 침전. Panning을 시행하기 위해 저장된 항체 library에서 재조합 파아지를 생산하였다. 500 ml 플라스크에 95 ml의 2×YT 액체배지을 넣은 후, -70oC에 보관된 scFv 라이브러리 1 ml을 녹여 넣고 600 nm 파장에서 흡광도가 0.
- 05% PBST가 담긴 용기에 nitrocellulose membrane를 옮겨 15분간 흔들어주며 방치하는 세척과정을 2회 반복하였다. 세척 후, nitrocellulose membrane을 blocking buffer로 1：1,000으로 희석된 HRP 부착 Anti-E tag 단클론항체 2 ml에 넣어 1시간 동안 상온에서 방치하고, 0.05% PBST를 사용하여 6회 세척하여 상온에서 5분간 말린 뒤, 2 ml의 4-CN 기질 용액(Sigma)에 10∼20분간 넣어 반응이 나타나는 것을 확인하고 증류수로 세척하였다.
- 감염된 배양액 중, 40μl를 새로운 microtiter plate에 옮겨 1,500 g로 20분 간 원심분리하고 상청액은 모두 제거한 뒤, 여기에 400μl의 2×YT-AK 액체배지를 넣어 37oC에서 250 rpm의 속도로 섞어주며 하룻밤 동안 배양시켜 scFv를 지닌 파아지를 생산하였다. 생산된 microtiter plate를 1,500 g로 20분 동안 원심분리하여 파아지를 포함한 상청액을 이용하여 ELISA를 시행하였다.
- coli HB2151 세포로 감염. ELISA상에서 양성으로 확인된 well에 해당하는 master plate의 well에서 파아지 발현시킨 뒤, 발현된 파아지포함 용액 10μl를 log phage E.coli HB2151 400μl를 포함한 well에 접종하였다. 접종 후, 37oC에서 2시간 동안 130 rpm의 속도로 섞어주며 배양하여 파아지를 감염시켰다.
- 5 ml의 1/5 TES buffer (1 volume of 1×TES buffer to 4 volumes of distilled water)를 혼합하여 얼음에 30분간 방치시키고, 12,000 g로 10분간 원심분리하여 상청액만을 분리하였다. 추출된 scFv를 포함한 periplasmic extract를 RPAS purification module (Pharmacia)을 사용하여 정제하였다.
- Western blot을 시행하기 위해 nictrocellulose membrane에 250 mA로 1시간 동안 전기 이동한 후 nitrocellulose membrane을 blocking solution (5% skim milk in PBS)에 1시간 동안 blocking하였다. Blocking이 끝나고, blocking solution에 HRP가 결합된 anti-E tag 단클론 항체(Pharmacia)가 1：1,000으로 희석된 용액을 사용하여 1시간 동안 반응시킨 후 기질로 4-Chloro-1-naphthol 용액 (Sigma)을 사용하여 30∼60분 후에 발색된 결과를 관찰하였다.
- 선별된 scFv의 염기서열 분석. 선별된 scFv의 VH, VL 유전자의 DNA서열분석을 pCANTAB5E sequence primer set (Pharmacia)을 사용하여 ABI Perkin Elmer 373A automated DNA sequencer (Applied Biosystems, Norwalk, CT)에서 수행하였다. 분석된 염기서열을 Kabat database에서 비교분석하였다.
- TP 단백질, B형 간염 바이러스 DNA 중합효소에 대한 binding 확인. 정제된 scFv를 이용하여 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소에 대한 결합능을 확인하기 위하여 baculovirus/insect cell 발현 시스템을 통해 TP 영역만을 발현시킨 TP 단백질과 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소 전체를 발현시킨 pol 단백질에 대한 indirect ELISA를 시행하였고, TP 펩타이드와 pol 단백질을 이용하여 competitive ELISA를 시행하였다. Indirect ELISA를 시행하기 위하여 우선, ELISA plate의 각 well에 항원으로, PBS에 희석한 TP 펩타이드(10μg/ml), TP 단백질(10μg/ml), pol 단백질(10μg/ml)을 50μl씩 넣고 4oC에서 하룻밤 동안 방치하였다.
- 정제된 scFv를 이용하여 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소에 대한 결합능을 확인하기 위하여 baculovirus/insect cell 발현 시스템을 통해 TP 영역만을 발현시킨 TP 단백질과 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소 전체를 발현시킨 pol 단백질에 대한 indirect ELISA를 시행하였고, TP 펩타이드와 pol 단백질을 이용하여 competitive ELISA를 시행하였다. Indirect ELISA를 시행하기 위하여 우선, ELISA plate의 각 well에 항원으로, PBS에 희석한 TP 펩타이드(10μg/ml), TP 단백질(10μg/ml), pol 단백질(10μg/ml)을 50μl씩 넣고 4oC에서 하룻밤 동안 방치하였다. 항원이 부착된 ELISA plate에서 항원용액들을 모두 제거하고 0.
- 마우스 면역 확인을 위한 ELISA. 합성 TP 펩타이드를 사용하여 면역시킨 후에 생성된 항체의 역가를 알아보기 위하여 ELISA를 시행하였다. BALB/c 마우스 4마리에 각각 4회에 걸쳐 면역시킨 후에 각각의 마우스로부터 얻은 혈청을 이용하여 ELISA를 시행하였으며, negative control 로 면역 전 혈청을 사용하여 비교하였을 때, 4마리 중 2마리에서 1：160,000 이상의 항체 역가가 확인되었다.
- RNA 추출과 scFv 라이브러리의 확보. 가장 높은 항체 역가를 보인 1번 BALB/c 마우스로부터 비장을 적출한 후, 비장의 절반을 사용하여 총RNA를 추출하였다. 총 RNA로부터 mRNA를 분리한 후, 흡광도를 측정하여 계산된 mRNA양은 약 10μg이었다.
- 총 RNA로부터 mRNA를 분리한 후, 흡광도를 측정하여 계산된 mRNA양은 약 10μg이었다. 얻어진 mRNA를 주형으로 이용하여 VH와 VL에 대한 cDNA를 증폭하였다. VH와 VL의 cDNA를 증폭한 후 전기 영동하여 약 340 bp 크기의 DNA를 확인하였다.
- 얻어진 mRNA를 주형으로 이용하여 VH와 VL에 대한 cDNA를 증폭하였다. VH와 VL의 cDNA를 증폭한 후 전기 영동하여 약 340 bp 크기의 DNA를 확인하였다. 확인된 VH와 VL의 cDNA를 linker primer와 반응시켜 scFv DNA를 제작하였고, 전기영동상에서 약 750 bp 크기의 DNA를 확인하였다(Fig.
- VH와 VL의 cDNA를 증폭한 후 전기 영동하여 약 340 bp 크기의 DNA를 확인하였다. 확인된 VH와 VL의 cDNA를 linker primer와 반응시켜 scFv DNA를 제작하였고, 전기영동상에서 약 750 bp 크기의 DNA를 확인하였다(Fig. 1). scFv DNA와 pCANTAB5E를 연결시킨 후, 연결된 반응액을 감응세포에 electroporation시켰다.
- Colony lift assay. 라이브러리로부터 phage를 얻어 panning 과정을 거친 후, 선별된 클론 중 항원에 결합하는 것만을 선별하였다. 선별은 한 번에 많은 수의 집락을 조사하기 위한 방법으로 colony lift assay를 시행하였다.
- TP 펩타이드에 대한 ELISA. Colony lift assay에서 양성반응으로 확인된 집락들에서 파아지를 발현시켜 TP-특이 항체를 발현하는 세포만을 선별하기 위하여 ELISA를 시행하였다. 이 중에서 negative control로 사용된 phage에 비하여 높은 반응을 보인 well 3개를 선별하였고, 결합여부를 재확인하기 위하여 soluble scFv를 발현시켜 정제한 후, 정제된 용액을 1차 항체로 사용하고 HRP가 결합된 anti-E tag 단클론항체를 2차 항체로 사용하여 405 nm의 파장에서 흡광도에서 측정하였다.
- Colony lift assay에서 양성반응으로 확인된 집락들에서 파아지를 발현시켜 TP-특이 항체를 발현하는 세포만을 선별하기 위하여 ELISA를 시행하였다. 이 중에서 negative control로 사용된 phage에 비하여 높은 반응을 보인 well 3개를 선별하였고, 결합여부를 재확인하기 위하여 soluble scFv를 발현시켜 정제한 후, 정제된 용액을 1차 항체로 사용하고 HRP가 결합된 anti-E tag 단클론항체를 2차 항체로 사용하여 405 nm의 파장에서 흡광도에서 측정하였다. 측정된 결과를 Table I에 표시하였다.
- SDS PAGE & Western blot. ELISA에서 양성반응으로 선별된 세포들 중에서 가장 높은 흡광도 수치를 나타냈던 1A phage clone에서 파아지를 구성하는 단백질 중 하나인 gIII 단백질이 붙어있지 않은 형태의 scFv를 얻어 그 크기를 확인하기 위하여, amber stop codon suppressor strain인 E.coli TG1에 들어있던 phagemid를 파아지를 통하여 non-suppressor strain인 E.coli HB2151로 감염시킨 후, soluble scFv를 발현시킨 후, anti-E purification module(phamacia)를 이용하여 발현된 scFv를 정제하여 SDS PAGE와 western blot으로 30 kDa의 크기를 확인하였다(Fig. 3).
- 선별된 scFv의 TP 단백질, pol 단백질에 대한 결합 확인. TP 펩타이드에 대해 선별된 phage 중 405 nm의 파장에서 가장 높은 흡광도를 보였던 1A phage clone에서 발현된 scFv의 TP 단백질과 pol 단백질에 대한 결합여부를 확인하기 위하여 정제된 1A scFv를 사용하여 각각의 단백질에 대한 indirect ELISA를 시행하고, TP 펩타이드와 pol 단백질을 이용하여 competitive ELISA를 시행하였다. Indirect ELISA상에서 negative control로 항원 대신에 BSA를 사용하여 비교하였다.
- TP 펩타이드에 대해 선별된 phage 중 405 nm의 파장에서 가장 높은 흡광도를 보였던 1A phage clone에서 발현된 scFv의 TP 단백질과 pol 단백질에 대한 결합여부를 확인하기 위하여 정제된 1A scFv를 사용하여 각각의 단백질에 대한 indirect ELISA를 시행하고, TP 펩타이드와 pol 단백질을 이용하여 competitive ELISA를 시행하였다. Indirect ELISA상에서 negative control로 항원 대신에 BSA를 사용하여 비교하였다. TP 펩타이드를 항원으로 사용한 경우가 405 nm의 파장에서 가장 높은 흡광도를 보였고, TP 단백질, pol 단백질의 경우에는 그보다 낮은 흡광도를 보였다(Table II).
- TP 펩타이드를 항원으로 사용한 경우가 405 nm의 파장에서 가장 높은 흡광도를 보였고, TP 단백질, pol 단백질의 경우에는 그보다 낮은 흡광도를 보였다(Table II). 선별된 scFv가 TP 펩타이드 부위를 특이하게 인지한다는 것을 확인하기 위하여, TP 펩타이드와 pol 단백질을 사용하여 competitive ELISA를 시행하였다. 항원으로 TP 펩타이드를 사용하였고, competiter로 pol 단백질, TP 펩타이드, BSA를 사용하였다.
- 본 연구에서는 phage display방법을 이용하여 TP 영역을 특이하게 인지하는 scFv를 선별하였다. 선별하는 항원으로 TP의 65번째 타이로신 잔기부근의 염기서열과 일치하는 합성 펩타이드를 사용하여 scFv를 선별하였고, 선별된 scFv를 TP 단백질과 pol 단백질에 대해 붙는 것을 확인하기 위하여 indirect ELISA를 사용하여 확인한 후, competitive ELISA를 이용하여 TP 영역에 특이하게 반응하는 것을 확인하였다.
- 본 연구에서는 phage display방법을 이용하여 TP 영역을 특이하게 인지하는 scFv를 선별하였다. 선별하는 항원으로 TP의 65번째 타이로신 잔기부근의 염기서열과 일치하는 합성 펩타이드를 사용하여 scFv를 선별하였고, 선별된 scFv를 TP 단백질과 pol 단백질에 대해 붙는 것을 확인하기 위하여 indirect ELISA를 사용하여 확인한 후, competitive ELISA를 이용하여 TP 영역에 특이하게 반응하는 것을 확인하였다.
- 이러한 panning 과정을 반복할수록 원하는 항체가 다수 선별되어야 하지만, 감염을 반복하는 과정에서 불완전한 형태의 항체조각들이 발견된다는 것이 다른 연구자들에 의해 보고된 바 있다(6). Phage display에 있어 가장 중요한 두 가지의 과정에 있어, 본 실험에서는 library 크기가 작고, 항체를 선별하는 것도 용이하지 않았기 때문에 원하는 단클 론 항체를 얻기 위해서 panning이나 선별하는 방법에 대해 조정이 필요하였다. 본 연구에서는 한 번에 보다 많은 수의 클론을 선별하고, 완전한 형태를 지닌 scFv를 얻고자 하는 방법으로 colony lift assay를 시행하였다.
- 실제로 Panning 후에 ELISA를 직접 시행하는 경우, 완전한 형태의 scFv가 전체 집락 중에서 얼마나 되는가를 확인할 수 있는 방법이 없으므로 불완전한 scFv가 많을 경우 이후의 phage 발현과 ELISA에서 원하는 항체를 선별할 수 있는 확률이 감소하게 되는데, phage 발현과 ELISA 시행에 소요되는 시간이 colony lift assay에 비해 몇 배의 시간과 노력이 소요된다는 점을 고려할 때, colony lift assay를 시행함으로써 panning후 직접 ELISA로 항체를 선별하는 것보다 많은 수의 집락을 한번에 선별하고, 완전한 형태의 항체를 얻는 것이 가능하였다. 비록 ELISA상에서 colony lift assay로 선별된 모든 집락들이 양성의 반응을 보이지는 않았으나 선별된 모든 집락들이 완전한 형태의 scFv를 이루고 있는 것을 염기서열 분석으로 확인하였다(data not shown). 선별에 있어서 하나의 과정이 추가되기는 하나 원하는 항체가 쉽게 선별되지 않거나, 선별된 항체가 불완전한 염기서열만을 가지고 있을 경우, colony lift assay를 시행함으로써 불 필요한 노동을 줄일 수가 있었다.
대상 데이터
- 본 연구는 기존의 TP 특이 단클론항체 생산과는 달리 항체를 선별할 때 항원으로 TP 전체 단백질대신에 TP의 65번째 타이로신 잔기 부근의 염기서열과 일치하는 합성 펩타이드를 사용하였다. 합성 펩타이드에 결합하는 단클론항체를 선별하고 선별된 단클론항체가 baculovirus에서 발현된 HBV DNA 중합효소인 pol 단백질과 결합하는 것을 확인함으로써 pol 단백질의 TP영역 중에서도 65번째 타이로신 잔기 주변을 인지할 수 있도록 하였다.
- 면역항원의 준비. 마우스 면역에 사용될 항원으로 합성한 펩타이드를 사용하였다. 즉, B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 TP 영역 중, 65번째 타이로신 부위를 포함한 24개 아미노산으로 구성된 펩타이드(KVGNFTGLYSS TVPIFNPEWQTPS)를 제작하였다.
- coli TG1 세포를 minimal medium plate (6 g of Na2HP04 (diabasic), 3 g of KH2P04(monobasic) and 1 g of NH4Cl, 15 g of Bacto-agar, 1 ml of 1 M MgCl2, 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 1 M thiamine hydrochloride and 5 ml of 20% glucose in 1 liter of autoclaved distilled water)에 선상도말하였다. 한천 평판배지에서 자란 집락을 10 ml의 2×YT 배지에 접종한 뒤 37oC에서 250 rpm의 속도로 섞어주면서 하룻동안 배양하였다. 배양된 10 ml의 세포들을 1 L의 2×YT 배지에 접종하고 같은 방식으로 600 nm의 파장에서 흡광도가 0.
- Electroporation. Phagemid 벡터 250 ng과 scFv DNA절편 150 ng으로 연결반응을 거친 20µl의 scFv/pCANTAB5E를 10개로 분주하여 electroporation하였다.
- 접종 후, 37oC에서 2시간 동안 130 rpm의 속도로 섞어주며 배양하여 파아지를 감염시켰다. 감염된 E.coli 세포를 포함한 배지 100μl를 SOBAG-N (SOBAG with 100μg/ml nalidixic acid) 한천 평판배지에 도말한 뒤, 30oC에서 하룻밤 동안 배양하여 배양된 집락을 얻었다.
- scFv DNA와 pCANTAB5E를 연결시킨 후, 연결된 반응액을 감응세포에 electroporation시켰다. Electroporation된 E.coli를 SOBAG 한천 평판배지에 배양하였고, 배양된 세포를 모아 라이브러리로 보관하였다.
- 선별된 scFv가 TP 펩타이드 부위를 특이하게 인지한다는 것을 확인하기 위하여, TP 펩타이드와 pol 단백질을 사용하여 competitive ELISA를 시행하였다. 항원으로 TP 펩타이드를 사용하였고, competiter로 pol 단백질, TP 펩타이드, BSA를 사용하였다. Competition 정도를 비교하기 위하여 산출된 결과를 백분율로 계산한 후, 그래프로 표시하였다(Fig.
데이터처리
- 선별된 scFv의 VH, VL 유전자의 DNA서열분석을 pCANTAB5E sequence primer set (Pharmacia)을 사용하여 ABI Perkin Elmer 373A automated DNA sequencer (Applied Biosystems, Norwalk, CT)에서 수행하였다. 분석된 염기서열을 Kabat database에서 비교분석하였다.
성능/효과
- 현재까지 B형 간염 바이러스중합효소를 인지하는 단클론 항체가 보고된 것은 TP, spacer, RNaseH의 일부분을 인지하는 것이었다. 또한 이 단클론 항체를 사용하여 생체 외에서 단백질 priming 반응에 대해 억제 효과를 실험한 결과에서 TP 영역을 인지하는 단클론 항체만이 단백질 priming 반응을 억제하였다(4). 하지만 보고된 TP 특이 단클론 항체가 인지하는 부분은 TP의 8∼20, 20∼30번 아미노산 부위였다.
- 합성 TP 펩타이드를 사용하여 면역시킨 후에 생성된 항체의 역가를 알아보기 위하여 ELISA를 시행하였다. BALB/c 마우스 4마리에 각각 4회에 걸쳐 면역시킨 후에 각각의 마우스로부터 얻은 혈청을 이용하여 ELISA를 시행하였으며, negative control 로 면역 전 혈청을 사용하여 비교하였을 때, 4마리 중 2마리에서 1：160,000 이상의 항체 역가가 확인되었다.
- 선별은 한 번에 많은 수의 집락을 조사하기 위한 방법으로 colony lift assay를 시행하였다. colony lift assay상 600개의 집락들 중에서 34개의 양성반응을 보인 집락들이 관찰되었고(Fig. 2), 관찰된 각 집락들은 2×YT-AG 액체배지가 포함된 96 well microtiter cluster tube의 각 well로 옮겨졌다.
- 선별된 scFv의 염기서열 분석. 1A phage에 삽입된 scFv DNA의 염기서열을 분석하였을 때(Fig. 4), 345 bp로 이루어진 VH와 330 bp로 구성된 VL을 확인할 수 있었고, 완전한 형태의 linker와 E-tag의 염기서열을 확인하였다. VH와 VKgene family를 International Immunogenetics Database (http://imgt.
- 4), 345 bp로 이루어진 VH와 330 bp로 구성된 VL을 확인할 수 있었고, 완전한 형태의 linker와 E-tag의 염기서열을 확인하였다. VH와 VKgene family를 International Immunogenetics Database (http://imgt.cnusc.fr:8104/v2/DNAP/index.html)에서 분석한 결과, VH region은 VH1 family의 VH gene segment, SP2.2 DH gene segment, JH3 gene segment로 구성되었고, VL region은 VK4와 JK2 gene segment의 조합으로 이루어져 있었다. Kabat database에서 보고된 항체들 간의 Homology분석 결과 anti-botulinum neurotoxin 항체, anti-poly(dC) 항체 등과 95% 이상의 homology를 보였으나, 이전에 보고되었던 TP의 8∼20, 20∼30번 아미노산 부위를 인지하는 단클론 항체와는 homology를 보이지 않았다(data not shown).
- 2 DH gene segment, JH3 gene segment로 구성되었고, VL region은 VK4와 JK2 gene segment의 조합으로 이루어져 있었다. Kabat database에서 보고된 항체들 간의 Homology분석 결과 anti-botulinum neurotoxin 항체, anti-poly(dC) 항체 등과 95% 이상의 homology를 보였으나, 이전에 보고되었던 TP의 8∼20, 20∼30번 아미노산 부위를 인지하는 단클론 항체와는 homology를 보이지 않았다(data not shown).
- 일반적으로 면역을 할 경우, 105 정도 크기의 library에서 항체 선별을 하는 데 비해 본 실험에서 얻어진 library의 크기는 그보다도 10배 정도 작은 크기였다. 선별과정에 있어서는, 보편적으로 2∼3회의 panning을 시행하여 항체를 얻지만 본 실험에서는 2∼3회의 panning후 ELISA를 시행하였을 때, TP-특이 단클론 항체가 선별되지 않았고 항체 선별을 위하여 4∼5회의 panning을 반복한 후 ELISA상에서 양성 결과를 얻었다. 하지만염기서열을 분석한 결과 모두가 불완전한 형태의 scFv였다(data not shown).
- 선별과정에 있어서는, 보편적으로 2∼3회의 panning을 시행하여 항체를 얻지만 본 실험에서는 2∼3회의 panning후 ELISA를 시행하였을 때, TP-특이 단클론 항체가 선별되지 않았고 항체 선별을 위하여 4∼5회의 panning을 반복한 후 ELISA상에서 양성 결과를 얻었다. 하지만염기서열을 분석한 결과 모두가 불완전한 형태의 scFv였다(data not shown). 이러한 결과가 나타난 이유를 예상하기 위해서는 panning 과정을 살펴볼 필요가 있다.
- 이 방법을 이용하면 100∼300개 정도의 집락들을 한 번에 선별하여 원하는 항체의 선별을 효과적으로 시행할 수 있는 장점이 있다(14). 실제로 Panning 후에 ELISA를 직접 시행하는 경우, 완전한 형태의 scFv가 전체 집락 중에서 얼마나 되는가를 확인할 수 있는 방법이 없으므로 불완전한 scFv가 많을 경우 이후의 phage 발현과 ELISA에서 원하는 항체를 선별할 수 있는 확률이 감소하게 되는데, phage 발현과 ELISA 시행에 소요되는 시간이 colony lift assay에 비해 몇 배의 시간과 노력이 소요된다는 점을 고려할 때, colony lift assay를 시행함으로써 panning후 직접 ELISA로 항체를 선별하는 것보다 많은 수의 집락을 한번에 선별하고, 완전한 형태의 항체를 얻는 것이 가능하였다. 비록 ELISA상에서 colony lift assay로 선별된 모든 집락들이 양성의 반응을 보이지는 않았으나 선별된 모든 집락들이 완전한 형태의 scFv를 이루고 있는 것을 염기서열 분석으로 확인하였다(data not shown).
- 비록 ELISA상에서 colony lift assay로 선별된 모든 집락들이 양성의 반응을 보이지는 않았으나 선별된 모든 집락들이 완전한 형태의 scFv를 이루고 있는 것을 염기서열 분석으로 확인하였다(data not shown). 선별에 있어서 하나의 과정이 추가되기는 하나 원하는 항체가 쉽게 선별되지 않거나, 선별된 항체가 불완전한 염기서열만을 가지고 있을 경우, colony lift assay를 시행함으로써 불 필요한 노동을 줄일 수가 있었다.
후속연구
- 본 연구에서 향후 더 연구되어야 할 부분으로 선별된 TP 특이 항체인 1A scFv의 특성 분석과 선별된 scFv에 의한 HBV 중합효소의 priming작용에 대한 효과를 확인하는 연구가 진행되어야 할 것이다.
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