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문제 정의
- 이러한 일련의 과정을 phage display 라고 한다. Phage 표면에 발현할 수 있는 구조가 다른 항체의 종류에는 Fab (antigen binding fragment), Fv (variable fragment), scFv (single-chain variable fragment), dsFv (disulfide stabilized variable fragment) 등이 있는데 이중에서 solublee scFv 를 발현하는 phage antibody의 생산에 목표를 두었고 본 연구에서는 질병, 식품, 환경 등 진단을 목적으로 혹은 Proteomics에서의 신규 단백질을 선별하기 위한 면역 침과 같은 분석도구에 이용될 수 있는 phage antibody 생산기술을 개발하였다. 특히 phage coat 상
제안 방법
- 본 연구진은 Griffin. 1 antibody library의 positive control을 통해 phage 표면에 항체가 발현되는 지의 여부를 ELISA test를 통하여 확인하였다. 또한 human serum albumin을 모델분석물길로 사용하여 1~4차까지의 bio-panning-fr 실시하였고 각 단계에서 증폭된 phage를 가지고 ELISA test를 한 결과 신호가 점진적으로 증가하는 data를 얻을 수 있었다.
- Griffin. 1 phage library 에서 유래된 positive clone을 이용하여 생산된 anti-human thyroglobulin phage antibody# 항원과 반응시킴으로써 그 항체의 생산과 분석법을 확인하였다. 그 positive phage가 감염된 E.
- 1 phage library 에서 유래된 positive clone을 이용하여 생산된 anti-human thyroglobulin phage antibody# 항원과 반응시킴으로써 그 항체의 생산과 분석법을 확인하였다. 그 positive phage가 감염된 E. coli를 2TY (ampicillin과 glucose 추가) 배지에서 exponential 단계까지 키운 후 helper phage를 water bath에서 추가 감염시켰다. 그 이후 2TY (ampicillin 과 kanamycin 추가) 배지로 옮기고 12시간 이상 배양하였다.
- 세포를 원심분리 시킨후 상층액에 PEG와 NaCl이 포함된 용액을 총 부피의 1/6이 되도록 첨가한 후 4℃ 에서 1시간 이상 정치하였다. 원심분리를 통헤 phage 침전 (white p이let) 을 얻었고 다시 PBS 로 부유시킨 후 E. 8〃, 에 감염시켜 colony assay 를 통해서 phage antibody titer를 측정하였으며 이것을 다시 ELISA test를 수행하여 항체의 존재를 확인하였다.
- Bio-panning. 10억 이상의 다양성올 가지고 있는 phage antibody 중에서 원하는 항체만을 screening하기 위해 인간혈청 알브민 (human serum albumin, HSA) 을 모델항원으로 선택하였고 이것을 polystylene 재질의 immunotube (Nunc, Naperville, USA) 표면에 물리흡착 시켰다. 이와 같이 항원이 고정화된 tube에 phage antibody# 투입하여 일정 시간 반응시킨 다음 tween이 포함된 PBS와 PBS 로 번 갈아 세 척 하여 반응에 참여 하지 않은 phage antibody* 세 거하였다.
- 10억 이상의 다양성올 가지고 있는 phage antibody 중에서 원하는 항체만을 screening하기 위해 인간혈청 알브민 (human serum albumin, HSA) 을 모델항원으로 선택하였고 이것을 polystylene 재질의 immunotube (Nunc, Naperville, USA) 표면에 물리흡착 시켰다. 이와 같이 항원이 고정화된 tube에 phage antibody# 투입하여 일정 시간 반응시킨 다음 tween이 포함된 PBS와 PBS 로 번 갈아 세 척 하여 반응에 참여 하지 않은 phage antibody* 세 거하였다. 그 후 glycine b니ffer로 immunot니be 벽에 붙어있는 phage antibody# 회수하였으며 즉시 Tris b니ffer로 중화시켰다.
- 그 후 glycine b니ffer로 immunot니be 벽에 붙어있는 phage antibody# 회수하였으며 즉시 Tris b니ffer로 중화시켰다. 얻어낸 phage antibody는 native TG1에 감염시켰으며 ampicillin 배지에 spreading 해줌으로써 감염된 TG1 만이 생존할 수 있도록 하였다. 자라난 colony> 회수 한 후 helper phage를 감염시켜 증폭된 anti~HSA phage antibody# 얻어내는 bio-panning 과정을 반복하였다.
- 얻어낸 phage antibody는 native TG1에 감염시켰으며 ampicillin 배지에 spreading 해줌으로써 감염된 TG1 만이 생존할 수 있도록 하였다. 자라난 colony> 회수 한 후 helper phage를 감염시켜 증폭된 anti~HSA phage antibody# 얻어내는 bio-panning 과정을 반복하였다. 1~4차까지의 bio-panning 수행하는 동안 washing 회수는 10회씩 증가시켰고 antigen coating 량은 100 以g /ml丄에서 1 "흥/mL 까지 감소시켜 affinity 가 높은 phage antibody만을 선별하여 회수하도록 하였다.
- 자라난 colony> 회수 한 후 helper phage를 감염시켜 증폭된 anti~HSA phage antibody# 얻어내는 bio-panning 과정을 반복하였다. 1~4차까지의 bio-panning 수행하는 동안 washing 회수는 10회씩 증가시켰고 antigen coating 량은 100 以g /ml丄에서 1 "흥/mL 까지 감소시켜 affinity 가 높은 phage antibody만을 선별하여 회수하도록 하였다. 회수된 phage antibody으] affinity를 알아보기 위하여 ELISA test 를 수행하였다» 3, .
- E. coli 내부에 존재하는 phagemid로부터 발현된 scFv 항체의 존재를 확인하기 위해 positive control로써 human thyroglobulin에 대해 특이한 항체를 발현하는 phagemid를 포함하는 세포를 베양한 후 phage antibody# 생산하였다. Colony assay를 통해서 phage antibody titer를 측정하였고 또한 얻어낸 phage를 가지고 고정화된 항원을 이용한 ELISA test (그림 1) 를 수행하여 negative control 결과와 비교함으로써 항체의 존재를 확인함과 동시에 affinity를 확인할 수 있었다.
- Phage library의 모델 분석물질인 human serum albumin (HSA) 에 대한 1~4차까지의 bio-panning-S- 수행하였고 각 panning으로부터 나온 증폭된 phage를 사용하여 ELISA test를 실시하였다 (그림 2). ELISA를 수행하기 위헤 10 pg/mL 의 동일한 양의 HSA/를 coating하였고 microwell 내에 각 bio-panning 단계에서 얻은 10"cfu/mL의 phage antibody# 투입하였다.
- ELISA test를 실시하였다 (그림 2). ELISA를 수행하기 위헤 10 pg/mL 의 동일한 양의 HSA/를 coating하였고 microwell 내에 각 bio-panning 단계에서 얻은 10"cfu/mL의 phage antibody# 투입하였다. 그 결과 pHEN2 (negative control) 는 bio-panning 단계가 증가해도 신호가 증가하지 않았고 anti-HSA phage antibody는 bio-panning 단계가 증가할수록 신호가 점진적으로 증가하였다.
대상 데이터
- coil (strain TGI) 에 감염되어 phagemid 상태로 존재하는 Griffin. 1 antibody library (MRC center, Cambridge, England) 를 제공받았고 VCS M13 h이per phage (Stratagene, La Jolla, USA) 의 추가 감염과정을 통헤 library< 유지하였다.
이론/모형
- 1~4차까지의 bio-panning 수행하는 동안 washing 회수는 10회씩 증가시켰고 antigen coating 량은 100 以g /ml丄에서 1 "흥/mL 까지 감소시켜 affinity 가 높은 phage antibody만을 선별하여 회수하도록 하였다. 회수된 phage antibody으] affinity를 알아보기 위하여 ELISA test 를 수행하였다» 3, .
성능/효과
- 또한 human serum albumin을 모델분석물길로 사용하여 1~4차까지의 bio-panning-fr 실시하였고 각 단계에서 증폭된 phage를 가지고 ELISA test를 한 결과 신호가 점진적으로 증가하는 data를 얻을 수 있었다. 이것을 통해 phage library로부터 특정항원에 대한 monoclonal antibody를 생산할 수 있다는 사실을 검증하였다.
- coli 내부에 존재하는 phagemid로부터 발현된 scFv 항체의 존재를 확인하기 위해 positive control로써 human thyroglobulin에 대해 특이한 항체를 발현하는 phagemid를 포함하는 세포를 베양한 후 phage antibody# 생산하였다. Colony assay를 통해서 phage antibody titer를 측정하였고 또한 얻어낸 phage를 가지고 고정화된 항원을 이용한 ELISA test (그림 1) 를 수행하여 negative control 결과와 비교함으로써 항체의 존재를 확인함과 동시에 affinity를 확인할 수 있었다.
- ELISA를 수행하기 위헤 10 pg/mL 의 동일한 양의 HSA/를 coating하였고 microwell 내에 각 bio-panning 단계에서 얻은 10"cfu/mL의 phage antibody# 투입하였다. 그 결과 pHEN2 (negative control) 는 bio-panning 단계가 증가해도 신호가 증가하지 않았고 anti-HSA phage antibody는 bio-panning 단계가 증가할수록 신호가 점진적으로 증가하였다. 따라서 10억 개 이상의 서로 다른 phage antibody 중에서 특정한 항원에 대한 항체가 선별될 수 있다는 것을 보여주었다.
- 그 결과 pHEN2 (negative control) 는 bio-panning 단계가 증가해도 신호가 증가하지 않았고 anti-HSA phage antibody는 bio-panning 단계가 증가할수록 신호가 점진적으로 증가하였다. 따라서 10억 개 이상의 서로 다른 phage antibody 중에서 특정한 항원에 대한 항체가 선별될 수 있다는 것을 보여주었다.
- 1 antibody library의 positive control을 통해 phage 표면에 항체가 발현되는 지의 여부를 ELISA test를 통하여 확인하였다. 또한 human serum albumin을 모델분석물길로 사용하여 1~4차까지의 bio-panning-fr 실시하였고 각 단계에서 증폭된 phage를 가지고 ELISA test를 한 결과 신호가 점진적으로 증가하는 data를 얻을 수 있었다. 이것을 통해 phage library로부터 특정항원에 대한 monoclonal antibody를 생산할 수 있다는 사실을 검증하였다.
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