[논문]Herpes Simplex Virus thymidine Kinase/Ganciclovir 유전자 치료에서 새로운 간격결합분자 Connexin 37에 의한 방관자 효과의 증가

김선영; 이호근; 이정창; 황동진; 황평한; 이대열; 조수철

[국내논문] Herpes Simplex Virus thymidine Kinase/Ganciclovir 유전자 치료에서 새로운 간격결합분자 Connexin 37에 의한 방관자 효과의 증가
Novel Gap Junction Molecules, Connexin 37, Enhances the Bystander Effect in HSVtk/GCV Gene Therapy 원문보기

소아과 = Journal of the Korean pediatric society, v.46 no.6, 2003년, pp.541 - 547

김선영 (전북대학교 의과대학 소아과학교실) , 이호근 (전북대학교 의과대학 소아과학교실) , 이정창 (전북대학교 의과대학 소아과학교실) , 황동진 (전북대학교 의과대학 소아과학교실) , 황평한 (전북대학교 의과대학 소아과학교실) , 이대열 (전북대학교 의과대학 소아과학교실) , 조수철 (전북대학교 의과대학 소아과학교실)

초록
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목 적 : HSVtk 유전자를 암세포에 도입하여 GCV에 대해 선택적으로 감수성을 증가시키는 HSVtk/GCV 유전자 치료에서 방관자 효과는 모든 암세포에 유전자를 도입하지 않고도 치료효과를 얻을 수 있으므로 방관자 효과를 증강시킬 수만 있다면 HSVtk/GCV 유전자 치료의 효과를 극대화시킬 수 있다. HSVtk의 방관자 효과에 관한 기전으로는 간격결합분자들이 주요 역할을 하리라고 알려져 있다. 간격결합분자들은 세포간의 통신을 담당하는 connexin family이며, 주로 Cx43에 관해서는 많이 알려져 왔다. Cx37을 암의 유전자 치료에 이용 가능한 유전자로서의 가능성을 타진하기 위하여 HSVtk/GCV 유전자 치료에 Cx37 유전자를 직접 세포에 발현을 시켜 방관자 효과를 증가시킬 수 있는 새로운 방법의 가능성을 검토하였다. 방 법 : 효과의 검증을 위한 세포주로는 NIH3T3를 사용하였다. HSVtk가 형질도입된 NIH3T3 세포에 GCV의 농도별로 세포사를 관찰하였다. 또한 Cx37의 발현 여부에 따른 세포사멸의 효과를 검토하기 위하여 Cx37 발현 세포주와 비발현 세포주를 서로 다른 비율로 혼합 배양후 나타나는 세포사를 관찰하였다. 최종적으로 Cx37이 세포사멸을 직접적으로 매개하고 있음을 규명하기 위하여 Cx37 발현 표적세포를 크로미움으로 표지화한 후 Cx37 발현 세포주와 비발현 작동세포와 혼합 배양 시 사멸되는 세포로부터 유리되는 크로미움의 양을 측정하였다. 결 과: HSVtk 발현 세포는 GCV 농도에 비례하여 세포가 사멸되었으며 HSVtk/Cx37 동시 발현 세포는 HSVtk만 발현된 세포에 비해 2배 이상의 사멸 효과가 나타났다. 아울러 Cx37에 의해 유도되는 방관자 효과는 표적세포와 작동세포 모두에 Cx37이 발현되는 경우는 세포의 혼합배양 비율에 상관없이 80%에 이르는 세포가 사멸되었다. 특히 작동세포에 Cx37이 없더라도 표적세포에 Cx37이 발현하면 세포사멸은 Cx37이 매개되지 않는 경우에 비교하여 2배 이상의 증가를 보였다. 이러한 결과는 크로미움 유리 실험에서도 동일한 결과가 유도되어 Cx37은 세포사멸을 직접적으로 매개하고 있음이 나타났다. 결 론 : 이상의 결과로부터 HSVtk/GCV 유전자 치료에서 방관자효과를 나타내는 분자의 하나로 Cx37의 기능을 확인하였으며, Cx37은 방관자 효과를 증가시켜 유전자치료의 낮은 유전자 전이율을 극복하고 암의 자살 유전자 치료의 효과를 극대화할 수 있는 분자로 예측된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Purpose : Gap junction intercellular communication(GJIC) is an important mechanism of the bystander effect in herpes simplex thymidine kinase/ganciclovir(HSVtk/GCV) gene therapy Therefore, we attempted to enhance the bystander effect in vitro by exogenous overexpressing connexin 37(Cx37) in cells to increase GJIC. Methods : NIH3T3 cells were transfected with the Cx37 and HSVtk gene or the HSVtk gene alone by the calcium phosphate method, and we detected their expression from these cells by RT-PCR. GCV-mediated cytotoxicity and the bystander effect of each transfectant was then assessed and compared. Results : Cells transfected with HSVtk became sensitive to low concentration of GCV. We found significantly increased cytotoxicity in HSVtk/GCV gene therapy after introduction of the HSVtk and Cx37 genes together compared with the cytotoxicity seen after introduction of the HSVtk gene in vitro. Co-expression of the HSVtk and Cx37 genes potentiates HSVtk/GCV gene therapy through the bystander effect. Conclusion : These results indicated that the increase of GJIC using Cx37 have potentiated the bystander effect of HSVtk/GCV therapy, and may be a new approach to improve response in suicidal cancer gene therapy.

Keyword

AI 본문요약
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문제 정의

이러한 결과는 Cx37이 자살유전자를 이용한 암의 유전자 치료에 있어서 방관자 효과를 높이는 효과 이외에도 암을 공격하는 면역세포의 주 표적이 된다면 암 유전자치료에 효과적으로 이용될 수 있는 분자로 생각된다. 본 연구에서는 Cx37을 암의 유전자 치료의 효과를 높이기 위한 유전자로서의 가능성을 타진하기 위하여 HSVtk/GCV 유전자 치료에 Cx37를 직접 세포에 발현을 시켜 방관자 효과를 증가시킬 수 있는 새로운 방법의 가능성을 검토하였다.
. 본 연구에서는 현재까지 비교적으로 연구가 적게 진행된 Cx37의 방관자 효과를 확인하고자 하였다. 실험에 사용된 Cx37은 사람으로부터 유래된 유전자이며, 실험 세포주인 마우스 유래의 섬유아세포인 NIH3T3에서는 동일한 배열을 갖는 유전자의 발현은 없었다.

제안 방법

본 연구에서는 NIH3T3 섬유아세포주를 이용하여 실험하였다. 세포배양액은 DMEM(Life Technologies, Grand Island, NY, USA) 배지에 56℃에서 30분간 가열하여 비활성화시킨 우태아 혈청(FBS; Hyclone, Logan, Utah, USA)을 10%, penicillin(100 unit/mL), streptomycine(100 µg/mL)과 glutamine(300 µg/mL)을 첨가하여 조제하였다. 세포주는 위의 배양액을 사용하여 37℃, 95% 습도, 5% CO₂배양기에서 배양하였고, 통상적으로 세포가 융합되기 직전인 3-4일 간격으로 계대 배양하였으며, 실험에는 총 30계대 이하인 세포만을 사용하였다.
cDNA 합성을 위한 역전사는 분리 RNA 2 µg을 취하여 역전사중합효소(MMLV, Gibco BRL, MD, USA) 200 U를 효소의 반응액과 첨가하여 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 HSVtk 와 CX37의 유전자를 PCR로 증폭하였다. HSVtk 시발체는 5`-aac cac cac cac gca act-3`와 5‘-gcc agc ata gcc agg tca-3`를 이용하여 513 bp를 증폭하였고, 사람 Cx37의 시발체로는 5’-tgt tgg tgg ttg gac tca-3`와 5`-gac gcc agc ctc tcc tct-3`를 이용하여 268 bp를 증폭하여 유전자의 도입을 확인하였다.
합성된 cDNA로부터 HSVtk 와 CX37의 유전자를 PCR로 증폭하였다. HSVtk 시발체는 5`-aac cac cac cac gca act-3`와 5‘-gcc agc ata gcc agg tca-3`를 이용하여 513 bp를 증폭하였고, 사람 Cx37의 시발체로는 5’-tgt tgg tgg ttg gac tca-3`와 5`-gac gcc agc ctc tcc tct-3`를 이용하여 268 bp를 증폭하여 유전자의 도입을 확인하였다. cDNA 합성체와 각각의 시발체들을 첨가하고 중합효소(Taq Polymerase, Promega, Madison, WI, USA) 0.
HSVtk 시발체는 5`-aac cac cac cac gca act-3`와 5‘-gcc agc ata gcc agg tca-3`를 이용하여 513 bp를 증폭하였고, 사람 Cx37의 시발체로는 5’-tgt tgg tgg ttg gac tca-3`와 5`-gac gcc agc ctc tcc tct-3`를 이용하여 268 bp를 증폭하여 유전자의 도입을 확인하였다. cDNA 합성체와 각각의 시발체들을 첨가하고 중합효소(Taq Polymerase, Promega, Madison, WI, USA) 0.5 U를 첨가하여 94℃, 58℃, 72℃를 30회 반복하여 증폭시켰다. 증폭된 유전자는 1.
24 well plate에 각각의 유전자가 도입된 세포를 분주하여 하룻밤 배양하여 MTT 측정 전에 세포배양액으로 2회 세척 후 각 well에 1 mL의 MTT 용액을 첨가하고 37℃에 4 시간 배양시켰다. 상층액을 제거시키고 형성된 formazan 침전물을 용해시키기 위해 1 mL의 DMSO을 가하여 5분간 microplate shaker상에서 용해시킨 다음 파장 630 nm의 reference filter와 파장 570 nm test filter를 사용하여 흡광도를 측정하였다. MTT 용액은 phenol red 가 들어있지 않은 DMEM 세포배양액을 사용하여 5 mg/mL의 농도로 만들어 사용하되 4℃에서 하룻밤 용해시킨 후 여과 멸균하여 분주한 것을 -20℃에 보관하며 사용하였다.
5% SDS)를 첨가하여 얼음에서 30분간 용해시킨 후, 세포 찌꺼기를 13,000 rpm에서 원심 제거하였다. 상층의 용해질을 2회 phenol/chloroform으로 추출 후 에탄올로 DNA를 침전시켰고 2 µg의 RNase A가 함유된 TE용액에 녹인 후 1.5% agarose gel에서 전기영동 하여 DNA 단편화를 확인하였다.
Cr 방출법으로 측정하였다. 표적세포로는 pcDNA3 벡터가 도입된 NIH3T3 세포(5×10³개)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 Na₂⁵¹CrO₄ (100 µci)를 첨가하여 2시간 동안 표지화하였다. 2회 배양용액으로 세척 후 24 well plate에 배양시키고 작동세포로는 동시에 같은 수의 HSVtk 혹은 HSVtk/Cx37 유전자가 도입된 세포를 배양시켰다.
2회 배양용액으로 세척 후 24 well plate에 배양시키고 작동세포로는 동시에 같은 수의 HSVtk 혹은 HSVtk/Cx37 유전자가 도입된 세포를 배양시켰다. 배양 다음날 GCV를 첨가시키고 24시간 배양한 후 상층액을 100 µL를 취하여 감마방사능 측정기(Wallac, Gathersburg, MD, USA)로 유리방사능을 측정하였다. 각 실험군에서의 유리량(experimental release, ER)을 측정하고, 자연유리량(spontaneous release, SR)을 작동세포 부유액 대신 동량의 배양액을 가하여 측정하였고 최대유리량(maximum release, MR)을 1% Triton X-100용액을 가하여 측정하였다.
Cx37의 방관자 효과에 대한 영향을 알아보기 위해서 HSVtk 와 Cx37 유전자를 발현벡터인 pcDNA3에 재조합시키고 NIH3T3 세포주에 도입시켰다. 형질도입된 세포주로부터 각각의 RNA를 추출하여 이들 유전자들의 특이 시발체를 이용하여 중합효소연쇄반응을 시행한 결과 마우스 유래 섬유아세포주인 NIH3T3 세포는 본 실험에 사용된 바이러스 유래 HSVtk와 사람의 Cx37과의 동일한 유전자 배열은 갖고 있지 않았다(Fig.
HSVtk 세포주에 먼저 GCV에 의해 유도되는 세포사멸을 검토하였다. HSVtk 발현 세포(1×10⁴)를 24 well plate에 하룻밤 배양시키고 GCV를 1 µM에서 100 µM까지 첨가하여 24시간과 48시간 후의 GCV에 대한 감수성을 MTT로 측정하였다.
HSVtk 세포주에 먼저 GCV에 의해 유도되는 세포사멸을 검토하였다. HSVtk 발현 세포(1×10⁴)를 24 well plate에 하룻밤 배양시키고 GCV를 1 µM에서 100 µM까지 첨가하여 24시간과 48시간 후의 GCV에 대한 감수성을 MTT로 측정하였다. 대조 세포에 비하여 HSVtk 발현 세포는 GCV에 대한 감수성이 나타나 비교적 고농도인 GCV 100 µM에서 24시간에 20% 정도와 48시간에는 30% 정도의 세포가 사멸되었다(Fig.
HSVtk 발현 세포는 100 µM 농도에서 1일째에 20%, 2일째에 최고 30% 정도의 세포에서만 사멸되었다. 이러한 세포사멸 정도를 기준으로 Cx37이 매개되는 방관자 효과에 의한 세포사멸을 검토하기 위하여 HSVtk만 발현되는 세포와 HSVtk/Cx37 동시 발현 세포에 GCV의 농도를 달리하여 이들간의 세포사멸 정도를 비교하였다. HSVtk만 발현되는 세포는 Fig.
그밖에 Cx37에 의해 유도되는 방관자 효과를 측정하기 위하여 Cx37이 전혀 매개되지 않는 NIH3T3 : HSVtk와 Cx37이 부분적으로 매개되는 NIH3T3 : HSVtk/Cx37과 Cx37 : HSVtk 및 Cx37이 모두 매개되는 Cx37 : HSVtk/Cx37의 유전자가 발현된 세포를 서로 혼합 배양하였다. 즉 Cx37 및 NIH3T3 표적세포를 기준으로 HSVtk와 Cx37/HSVtk가 도입된 작동세포 군으로 구분하여 각각 20 : 80, 40 : 60, 60 : 40, 80 : 20으로 서로 다른 비율로 혼합 배양하여 GCV에 대한 세포 사멸을 비교하였다. Cx37이 매개되지 않는 NIH3T3 : HSVtk 세포에서는 약 20% 정도 특히 HSVtk의 비율을 80%로 하였을 경우 10% 이하의 세포만이 사멸되었다.
위 실험의 결과처럼 Cx37이 세포사멸을 직접적으로 매개하고 있음을 규명하기 위하여 Cx37 발현 세포를 크로미움으로 표지 화한 후 사멸되는 세포로부터 유리되는 크로미움의 양을 측정하였다. Cx37이 매개되지 않는 HSVtk 발현 세포만의 배양시 유리되는 크로미움은 총 표지화 된 양의 20% 이하만이 유리되는 것에 비하여, HSVtk/Cx37 동시 발현 세포와 혼합 배양 시에는 90%에 이르는 크로미움이 유리되었다(Fig.
배양 다음날 GCV를 첨가시키고 24시간 배양한 후 상층액을 100 µL를 취하여 감마방사능 측정기(Wallac, Gathersburg, MD, USA)로 유리방사능을 측정하였다. 각 실험군에서의 유리량(experimental release, ER)을 측정하고, 자연유리량(spontaneous release, SR)을 작동세포 부유액 대신 동량의 배양액을 가하여 측정하였고 최대유리량(maximum release, MR)을 1% Triton X-100용액을 가하여 측정하였다. 세포독성의 값은 cytotoxicity(%)=[100×(ER－SR)/(MR－SR)]에 의해 계산하였다.

대상 데이터

본 연구에서는 NIH3T3 섬유아세포주를 이용하여 실험하였다. 세포배양액은 DMEM(Life Technologies, Grand Island, NY, USA) 배지에 56℃에서 30분간 가열하여 비활성화시킨 우태아 혈청(FBS; Hyclone, Logan, Utah, USA)을 10%, penicillin(100 unit/mL), streptomycine(100 µg/mL)과 glutamine(300 µg/mL)을 첨가하여 조제하였다.
세포배양액은 DMEM(Life Technologies, Grand Island, NY, USA) 배지에 56℃에서 30분간 가열하여 비활성화시킨 우태아 혈청(FBS; Hyclone, Logan, Utah, USA)을 10%, penicillin(100 unit/mL), streptomycine(100 µg/mL)과 glutamine(300 µg/mL)을 첨가하여 조제하였다. 세포주는 위의 배양액을 사용하여 37℃, 95% 습도, 5% CO₂배양기에서 배양하였고, 통상적으로 세포가 융합되기 직전인 3-4일 간격으로 계대 배양하였으며, 실험에는 총 30계대 이하인 세포만을 사용하였다.
HSVtk 유전자와 사람 Cx37 유전자(미국 시카고대학의 소아 혈액종양분야의 Seul 박사로부터 분양)의 발현을 위하여 동물 세포내 발현 벡터인 pcDNA3(Invitrogen, Gronigen, Netherlands)에 각각 재조합시켰다. 실험 세포주에는 HSVtk, Cx37 각각 혹은 두 유전자를 동시에 도입시켰으며, 대조세포에는 pcDNA3 벡터만을 calcium phosphate(Promega, Madison, WI, USA) 법을 이용하여 도입시켰다.
본 연구에서는 현재까지 비교적으로 연구가 적게 진행된 Cx37의 방관자 효과를 확인하고자 하였다. 실험에 사용된 Cx37은 사람으로부터 유래된 유전자이며, 실험 세포주인 마우스 유래의 섬유아세포인 NIH3T3에서는 동일한 배열을 갖는 유전자의 발현은 없었다. 이는 사람 Cx37에 의한 HSVtk/GCV 유전자 치료의 방관자 효과를 증명하는데 이상적으로 생각되어 실험 세포주로 선택하였다.

데이터처리

통계 방법 처리는 Student`s t-test를 사용하여 검정하였으며 P값은 0.05 미만일 때 통계학적인 유의성을 인정하였다.

이론/모형

HSVtk 유전자와 사람 Cx37 유전자(미국 시카고대학의 소아 혈액종양분야의 Seul 박사로부터 분양)의 발현을 위하여 동물 세포내 발현 벡터인 pcDNA3(Invitrogen, Gronigen, Netherlands)에 각각 재조합시켰다. 실험 세포주에는 HSVtk, Cx37 각각 혹은 두 유전자를 동시에 도입시켰으며, 대조세포에는 pcDNA3 벡터만을 calcium phosphate(Promega, Madison, WI, USA) 법을 이용하여 도입시켰다. 세포 5×10⁵ 개를 100 mm 배양용기에 배양 후 유전자 도입 4시간 전에 새로운 무혈청 배양액으로 교체하고 유전자 10 µg과 2M CaCl₂ 36 µL를 혼합한 후 멸균 증류수로 300 µL로 고정하였다.
유전자 도입 3일 후 세포로부터 HSVtk, Cx37 유전자의 발현은 RT-PCR 방법으로 확인하였다. 융합직전의 세포에 1 mL TRIzol(Gibco BRL, MD, USA)을 첨가하여 세포를 용해시키고, 200 µL의 클로르포름을 첨가하여 강하게 교반 후 13,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층의 RNA를 포함한 층을 취하였다.
세포사멸의 정도를 Van de Loosdrecht 등¹⁵⁾에 의한 MTT (3-[4,5-dimethyltiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma, St Louis, USA) 방법으로 측정하였다. 24 well plate에 각각의 유전자가 도입된 세포를 분주하여 하룻밤 배양하여 MTT 측정 전에 세포배양액으로 2회 세척 후 각 well에 1 mL의 MTT 용액을 첨가하고 37℃에 4 시간 배양시켰다.
Cx37 유전자와 GCV 유도체의 이동에 의한 세포독성의 검증을 ⁵¹Cr 방출법으로 측정하였다. 표적세포로는 pcDNA3 벡터가 도입된 NIH3T3 세포(5×10³개)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 Na₂⁵¹CrO₄ (100 µci)를 첨가하여 2시간 동안 표지화하였다.

성능/효과

Cx37의 방관자 효과에 대한 영향을 알아보기 위해서 HSVtk 와 Cx37 유전자를 발현벡터인 pcDNA3에 재조합시키고 NIH3T3 세포주에 도입시켰다. 형질도입된 세포주로부터 각각의 RNA를 추출하여 이들 유전자들의 특이 시발체를 이용하여 중합효소연쇄반응을 시행한 결과 마우스 유래 섬유아세포주인 NIH3T3 세포는 본 실험에 사용된 바이러스 유래 HSVtk와 사람의 Cx37과의 동일한 유전자 배열은 갖고 있지 않았다(Fig. 1). 유전자는 pcDNA3, HSVtk, Cx37, HSVtk/Cx37로 구분하여 각각 세포에 도입시키고 형질 도입된 세포주에서는 각각의 유전자의 특이 DNA 분절의 증폭을 확인할 수 있어 이들 유전자의 형질도입이 성공적으로 이루어진 것을 확인할 수 있었다(Fig.
1). 유전자는 pcDNA3, HSVtk, Cx37, HSVtk/Cx37로 구분하여 각각 세포에 도입시키고 형질 도입된 세포주에서는 각각의 유전자의 특이 DNA 분절의 증폭을 확인할 수 있어 이들 유전자의 형질도입이 성공적으로 이루어진 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
HSVtk 발현 세포(1×10⁴)를 24 well plate에 하룻밤 배양시키고 GCV를 1 µM에서 100 µM까지 첨가하여 24시간과 48시간 후의 GCV에 대한 감수성을 MTT로 측정하였다. 대조 세포에 비하여 HSVtk 발현 세포는 GCV에 대한 감수성이 나타나 비교적 고농도인 GCV 100 µM에서 24시간에 20% 정도와 48시간에는 30% 정도의 세포가 사멸되었다(Fig. 2). 그러나 NIH3T3와 pcDNA3 벡터만 도입된 세포는 GCV 100 µM 처리 농도에서는 실제적으로 많은 세포가 사멸되지 않았으며 오히려 20% 이상의 세포가 증식하였다(결과 미기재).
Cell survival was measured by colorimetric MTT assay at 24, 48 hours after GCV treatment. Results were calculated as differences between untreated and GCV-treated cultures as a percentage of the untreated culture(*P<0.05).
2의 결과처럼 24시간 후에 100 µM에서 20% 정도만이 사멸되었다. 반면 동일한 농도에서 HSVtk/Cx37 동시 발현 세포는 75% 정도 세포가 사멸되어 2배 이상의 사멸 효과가 나타났다(Fig. 3). 이러한 사멸 효과는 저 농도의 GCV 처리에서도 동일하게 나타났다.
GCV에 의한 세포사멸은 HSVtk 발현 세포에서는 20-30% 전후의 세포사멸 현상이 나타났으며, Cx37 발현 세포도 약간의 세포사멸이 보여졌다. 그러나 HSVtk/Cx37 동시 발현 세포는 대부분의 세포가 모두 사멸되어 생존세포를 거의 확인 할 수 없었다(Fig.
4A). 이들 세포의 사멸은 세포자멸사(apoptosis)의 전형적인 DNA의 단편화가 나타났으며, 특히 HSVtk/Cx37 동시 발현 세포에서 더 많이 유도되었다(Fig. 4B).
Cx37이 매개되지 않는 NIH3T3 : HSVtk 세포에서는 약 20% 정도 특히 HSVtk의 비율을 80%로 하였을 경우 10% 이하의 세포만이 사멸되었다. 이와는 다르게 Cx37이 동시 발현되는 Cx37 : HSVtk/Cx37 세포에서는 비율에 무관하게 80%에 가까운 세포가 사멸되어 Cx37의 방관자 효과를 확인 할 수 있었다. 이러한 방관자 효과는 Cx37이 부분적으로 매개되는 NIH3T3 : HSVtk/Cx37과 Cx37 : HSVtk 세포에서도 사멸 현상이 높게 나타났다.
위 실험의 결과처럼 Cx37이 세포사멸을 직접적으로 매개하고 있음을 규명하기 위하여 Cx37 발현 세포를 크로미움으로 표지 화한 후 사멸되는 세포로부터 유리되는 크로미움의 양을 측정하였다. Cx37이 매개되지 않는 HSVtk 발현 세포만의 배양시 유리되는 크로미움은 총 표지화 된 양의 20% 이하만이 유리되는 것에 비하여, HSVtk/Cx37 동시 발현 세포와 혼합 배양 시에는 90%에 이르는 크로미움이 유리되었다(Fig. 6). 이상의 결과로부터 사람의 Cx37 간격결합분자는 HSVtk/GCV을 이용한 GDEPT 치료에 효과적인 방관자 효과를 나타내는 중요한 분자임을 확인하였다.
6). 이상의 결과로부터 사람의 Cx37 간격결합분자는 HSVtk/GCV을 이용한 GDEPT 치료에 효과적인 방관자 효과를 나타내는 중요한 분자임을 확인하였다.
다음으로 HSVtk/GCV 유전자 치료의 가능성을 검토한 결과 NIH3T3 세포에 도입된 HSVtk 유전자는 GCV에 의한 세포사멸을 유도하였다(Fig. 2). 실험에서는 GCV를 1 µM에서 100 µM까지 처리한 결과 배양시간과 처리 농도에 따라 다르게 세포 사멸이 나타났다.
2). 실험에서는 GCV를 1 µM에서 100 µM까지 처리한 결과 배양시간과 처리 농도에 따라 다르게 세포 사멸이 나타났다. GCV의 100 µM을 처리한 경우 48시간 후에 40% 정도의 세포사멸이 나타났으나 실제적으로 고농도의 GCV 처리에 불구하고 높은 세포사멸을 기대할 수가 없었다.
이러한 낮은 세포사멸은 유전자 도입의 한계로 생각된다. HSVtk 유전자의 낮은 발현율에 따른 세포사멸 현상이 간격결합분자인 Cx37을 동시에 발현시킨 세포에서는 높게 나타났다. 100 µM GCV 처리 24시간째에 80% 이상의 세포가 사멸되어 30% 전후의 HSVtk만에 비교하여 3배 이상의 높은 사멸효과가 나타났다(Fig.
HSVtk 유전자의 낮은 발현율에 따른 세포사멸 현상이 간격결합분자인 Cx37을 동시에 발현시킨 세포에서는 높게 나타났다. 100 µM GCV 처리 24시간째에 80% 이상의 세포가 사멸되어 30% 전후의 HSVtk만에 비교하여 3배 이상의 높은 사멸효과가 나타났다(Fig.3). 이는 Cx37이 방관자 효과의 특성을 가지고 있음을 의미한다.
특히 작동세포에 Cx37이 없는 경우의 세포사멸의 증가는 표적세포가 사멸된 결과이며, 이는 표적세포의 Cx37이 매개되어 인산화된 GCV의 산물이 이동된 것으로 추측된다. 반면 표적세포에 Cx37이 발현되지 않지만 작동세포에 Cx37 발현경우(NIH3T3 : HSVtk/Cx37)는 세포사멸이 높게 나타났지만 실제로는 표적세포의 사멸보다는 작동세포의 높은 세포 사멸의 결과로 나타났다(Fig. 6). Cx37에 의해 매개되는 방관자 효과를 정확히 증명하는 수단으로 표적세포인 Cx37 발현 세포를 크로미움으로 표지화하여 실험한 결과에서도 Cx37이 발현되는 작동세포에서 강력하게 크로미움이 유리됨으로써 그 효과를 증명할 수 있었다.
6). Cx37에 의해 매개되는 방관자 효과를 정확히 증명하는 수단으로 표적세포인 Cx37 발현 세포를 크로미움으로 표지화하여 실험한 결과에서도 Cx37이 발현되는 작동세포에서 강력하게 크로미움이 유리됨으로써 그 효과를 증명할 수 있었다. 이는 자살 유전자 치료에 있어서 낮은 유전자의 발현율로부터 세포사멸을 높이는 방법으로 Cx37의 가능성을 보여주는 결과로 생각된다.
본 실험에서는 일반 세포에서 Cx37의 방관자 효과를 검토하였으나 이러한 결과는 암세포에서도 동일하게 그 효과가 있을 것으로 생각된다. 일반적으로 암세포는 악성으로 변환되는 과정에 있어서 간격결합분자의 발현율의 저하와 발현 위치의 변화가 나타난다고 한다²³⁾.

후속연구

그러나 암세포에 유전자를 전달시키면 실제로는 극히 일부분의 암세포에만 유전자가 전달되어 발현된다. 이러한 미약한 유전자의 전달과 발현이 유전자 치료의 효과를 낮게 하는 원인으로 작용하지만, 유전자가 전달되지 않는 주위의 암세포도 죽어 가는 “방관자 효과”가 나타나 유전자 치료의 효과를 높일 수 있는 방안으로 기대된다.
암 유전자 치료에 있어서 가장 어려운 문제점의 하나는 제한된 세포에만 전달되는 유전자의 낮은 효율로서 암조직의 전체를 제거시키는데 한계가 있다. 그러나 HSVtk/GCV를 이용한 자살 유전자 치료는 HSVtk가 도입된 암세포뿐만 아니라 HSVtk가 도입되지 않은 주위의 암세포도 GCV 투여 후 사망하는 “방관자 효과 (bystander effect)”에 의해 치료 효과가 나타나므로^{3, 4)}, 방관자 효과를 증강시킬 수만 있다면 HSVtk/GCV 유전자 치료의 효과를 극대화시킬 수 있으므로 이러한 문제점을 극복하는 방안이 될 수 있어 이에 대한 연구가 필요하다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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